Name: short-term free-floating slice cultures from the adult human brain
Uploaded: 2019-11-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain at JoVE.com

Detta arbete stöds av FAPESP (Grant 25681-3/2017 to AS), CAPES (post-doktors stipendium PNPD/INCT-HSM till AF och pre-doktors stipendium till N.D.M.) och FAEPA. G.M.A. innehar ett Masterstipendium från FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. innehar ett CNPq Research Fellowship. Vi tackar patienterna och deras familjer för att ha donerat de resected vävnaderna för denna studie. Vi vill erkänna stöd av boende, sjuksköterskor, tekniker och CIREP team, från det kliniska sjukhuset i Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, som hjälpte i olika skeden av processen.

Levande vuxna hjärnvävnader erhölls från patienter som genomgick resektiv neurokirurgi för behandling av farmakoresistent tinningloben epilepsi (figur 1A). Alla procedurer godkändes av etikkommittén från kliniker sjukhuset på Ribeirão Preto Medical School (17578/2015), och patienter (eller deras juridiska ansvariga person) enades om och undertecknade villkoren för informerat samtycke. Insamling av vävnaden utfördes av neurokirurgi team vid epilepsi kirurgi Cente...

Detta protokoll för produktion av fritt flytande, kortvariga segment kulturer är en alternativ metod för odling av vuxna humana neokortikala skivor. Ett sådant protokoll för segment kulturer kan vara mottagligt för studier på (men inte begränsat till) optogenetik1,44,45, elektrofysiologi2,3,4,5 </sup...

Användningen av mänskliga prover i forskning är otvetydigt ett bra alternativ för att studera mänskliga hjärnan patologier, och moderna tekniker har öppnat nya sätt för robusta och etiska experiment med hjälp av patient-derived vävnad. Metoder som organotypic/slice kulturer utarbetats från vuxna mänskliga hjärnan har alltmer använts i paradigm såsom optogenetik1, elektrofysiologi2,3,4,5,plasticitet 6,7,8,9, neurotoxicitet/neuroprotection10,11,12,13, cellterapi14, läkemedels screening15,16,17, genetik och gen editering12,18,19,20, bland annat som en strategi för bättre att förstå neurologiska sjukdomar under vuxen ålder.
Förståelsen av mekanismerna bakom mänskliga hjärnsjukdomar beror på experimentella strategier som kräver ett stort antal ämnen. Omvänt, när det gäller segment kulturer, även om tillgången till Human prov fortfarande är svår, kringgår möjligheten att generera upp till 50 skivor från ett enda kortikal prov delvis kravet på rekrytering av flera frivilliga genom att öka antal replikat och utförda analyser per insamlad vävnad21.
Flera protokoll för hjärnans organotypic/slice kulturer har beskrivits, allt från den klassiska endigital utkast22,23 till rullrör24,25,26, semi-permeabla membran gränssnitt27,28,29,30och fritt flytande skivor31,32. Beroende på särdragen i en experimentell design, har varje teknik sina egna fördelar och nackdelar. Kortsiktiga, fritt flytande skivor kulturer från vuxna mänskliga hjärnor är i vissa fall fördelaktiga över den metod som används av Stoppini et al.27, om man överväger det faktum att även om långsiktig cellöverlevnad in vitro är vanligtvis ett stort problem när man utvärderar en kultur metod, i många experiment endast kort perioder av tid i kultur behövs12,31,32,33,34,35. Under dessa förhållanden, användningen av fri-flytande kulturer ger fördelen av att vara enklare och mer kostnadseffektivt, samt mer exakt som liknar den ursprungliga människans vävnads tillstånd än skivor hålls i kulturen över 2-3 veckor.
Trots potentialen hos segment kulturer till neurovetenskap, studier med hjälp av vuxna nervvävnad att förbereda sådana kulturer är fortfarande knappa, särskilt från försökspersoner. Denna artikel beskriver ett protokoll för att använda insamlade hjärnvävnad från levande mänskliga givare lämnas till resektiv hjärnkirurgi för att förbereda fritt flytande segment kulturer. Förfaranden för att underhålla och utföra biokemiska och cellbiologi analyser med hjälp av dessa kulturer är detaljerade. Detta protokoll har visat sig värdefullt för att analysera livskraft och neuronala funktion i utredningar om mekanismerna för neuropatologier kopplade till vuxen ålder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1571px;" width="1570">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1096341000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A3449&#160;</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">A3678-25G</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:200px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">15290-018</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-ERK 2 (rabbit)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-154</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-pERK (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-7383</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BDNF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A7906</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td style="width:200px;">BioRad</td>
			<td style="width:344px;">500-0205</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">EDTA</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T3924</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salts</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1387-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1003171000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td align="right" style="width:344px;">194</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse)</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">NA931-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">NaCl</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">1064041000</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Non-fat dry milk (Molico)</td>
			<td style="width:200px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Used for membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">PBS Buffer pH 7,2</td>
			<td>Laborclin</td>
			<td align="right">590338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicilin/Streptomicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:521px;">Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">RPN2232</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">SDS</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">L5750</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:521px;">TEMED</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">17-1312-01</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Tris</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T-1378</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Triton x-100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">X100</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Ultrapure Water</td>
			<td style="width:200px;">Millipore</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Sterile water, derived from MiliQ water purification system</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Equipment and Material</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CL S3526</td>
			<td>Flat Bottom with Lid</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>29047575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Carbogen Mixture</td>
			<td style="width:200px;">White Martins</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">95% O2, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:521px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:344px;">CO-24</td>
			<td style="width:505px;">Incubation of slices 5% CO2, 36&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:521px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:200px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Microtubes</td>
			<td style="width:200px;">Greiner</td>
			<td style="width:344px;">001608</td>
			<td style="width:505px;">1,5mL microtube</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Motorized pestle</td>
			<td style="width:200px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Plastic spoon</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Size of a dessert spoon</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Razor Blade</td>
			<td style="width:200px;">Bic</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Chrome Platinum, used in slicing with vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Scalpel Blade</td>
			<td style="width:200px;">Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:344px;">Number 24</td>
			<td style="width:505px;">Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:34px;width:521px;">Superglue (Loctite Super Bonder)</td>
			<td style="width:200px;">Henkel</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6&#39;-di-terc-butil-2,2&#39;-metilenodi-p-cresol; homopolymer</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Vibratome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14047235612 - VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;">Antibody anti-NeuN (mouse)</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:521px;">Antibody anti-GFAP (mouse)</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">MAB360</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Antibody anti-Iba1 (rabbit)</td>
			<td style="width:200px;">Abcam</td>
			<td style="width:344px;">EPR16588 - ab178846</td>
			<td>Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">BA-9200</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">DAB</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">D-9015</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Entellan</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">107960</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Ethanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1.00983.1000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Gelatin</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">00G1002.02.AE</td>
			<td style="width:505px;">Used for coating slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td>Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">158127</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides (Star Frost)</td>
			<td>Knittel Glaser</td>
			<td></td>
			<td>Gelatin coated slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td>60REAVET017050</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">PK-4000, Kit Standard</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Xylene</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">01X1001.01.BJ</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

short-term free-floating slice cultures from the adult human brain

Organotypic, eller segment kulturer, har varit i stor utsträckning används för att modellera aspekter av det centralanervsystemet fungerar in vitro-. Trots potentialen av segment kulturer i neurovetenskap, studier med hjälp av vuxna nervvävnad att förbereda sådana kulturer är fortfarande knappa, särskilt de från försökspersoner. Användningen av vuxna mänskliga vävnader för att förbereda segment kulturer är särskilt attraktiv för att öka förståelsen av mänskliga neuropatiologier, eftersom de har unika egenskaper som är typiska för den mogna mänskliga hjärnan saknas i skivor som produceras från gnagare (vanligtvis neonatal) nervvävnad. Detta protokoll beskriver hur man använder hjärnvävnad som samlats in från levande mänskliga givare lämnas till resektiv hjärnkirurgi för att förbereda kortsiktiga, fritt flytande segment kulturer. Förfaranden för att underhålla och utföra biokemiska och cellbiologi analyser med hjälp av dessa kulturer presenteras också. Representativa resultat visar att den typiska humana kortikala laminering bevaras i skivor efter 4 dagar in vitro (DIV4), med förväntad förekomst av de viktigaste neurala celltyper. Dessutom skivor på DIV4 genomgå robust celldöd när utmanas med en giftig stimulans (H2O2), som anger potentialen i denna modell för att fungera som en plattform i celldöd analyser. Denna metod, ett enklare och kostnadseffektivt alternativ till det allmänt använda protokollet med hjälp av membran skär, rekommenderas främst för att köra kortsiktiga analyser som syftar till att riva upp mekanismer för neurodegeneration bakom åldersrelaterade hjärnsjukdomar. Slutligen, även om protokollet ägnas åt att använda kortikal vävnad som samlats in från patienter som lämnats till kirurgisk behandling av farmakoresistent tinningloben epilepsi, det hävdas att vävnad som samlats in från andra regioner i hjärnan/villkor bör också vara betraktas som källor för att producera liknande fritt flytande segment kulturer.

En kritisk aspekt för att utvärdera kvalitet och hälsa av odlade skivor är närvaron och typiska morfologi av de förväntade neurala celltyper, nervceller, och gliaceller. Den typiska arkitekturen av den mänskliga kortikala laminering observerades i en skiva på DIV4, som framgår av neuronala immunolabeling (figur 2D). Dessutom observerades även den förväntade närvaron av mikroglia och astroglia (figur 2B, C). Dessa r...

Watch this Scientific Journal Video about Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain at JoVE.com

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Ett protokoll för att förbereda fritt flytande segment kulturer från vuxna mänskliga hjärnan presenteras. Protokollet är en variant av den allmänt använda segment kultur metoden med hjälp av membran skär. Det är enkelt, kostnadseffektivt, och rekommenderas för att köra kortsiktiga analyser syftar till att riva upp mekanismer för neurodegeneration bakom åldersrelaterade hjärnsjukdomar.

Kortsiktiga fritt flytande segment kulturer från den vuxna mänskliga hjärnan

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Vi presenterar ett protokoll för att förbereda fritt flytande skiva kulturer från hjärnvävnad som samlats in från levande mänskliga givare lämnas till resective hjärnkirurgi. Denna kultur är mottagliga för att utföra biokemiska och cellbiologi analyser eller immunohistokemi. Det förväntas bidra till klarläggandet av mekanismen bakom neurodegeneration i associerade hjärnsjukdomar.Den största fördelen med denna teknik är att det är ett enklare och kostnadseffektivt alternativ till den klassiska skiva kultur protokoll med hjälp av membran skär. Även om det övergripande protokollet inte är komplex, vissa steg såsom avlägsnande av hjärnhinnor, limning av vävnaden till vibratome exemplar skivan och samband för immunohistokemi är bäst förstås när det visas visuellt. Hjälper till att visa förfarandet kommer att Niele Mendes och Glaucia Almedia som är grad studenter, och Giovanna Nogueira, en annan grad student.För att börja detta förfarande, tillsätt salt till en hink med is. Överför skivningslösningen till denna hink och låt den vila under karbiogenblandningen som bubblar i minst 20 minuter före användning. Därefter förbereder du ett block på 3%-agarose som är ungefär två centimeter med två centimeter med två centimeter.Superlim agarosblocket till vibratome-preparatskivan för att skapa ytterligare mekaniskt stöd till vävnadsprovet vid skivning. På vibratomen, ställ in sektionens tjocklek på 200 mikrometer, vibrationsfrekvensen till 100 hertz, och välj en skivningshastighet mellan 0,5 och 1,0 millimeter per sekund. Lås sedan vibratombuffertstråget på vibratombasen och tillsätt is för att hålla den i kylskåp innan den tas emot skivningslösningen och provet och under hela skivningsproceduren.Först inrätta en transportapparat som består av en bärbar gascylinder som innehåller en karbiogenblandning som är ansluten till en tryckflussventil som styr gasens utgång som är ansluten till silikonrör som förbinder denna gasproduktion med transportfartyget och transportfartyget som innehåller transportlösningen och is för provkylning under transport. Samla och transportera exemplaret och transporten enligt textprotokollet. Överför preparatet till en petriskål som innehåller skivningslösning.Med hjälp av fina kirurgiska verktyg, ta försiktigt bort så mycket av de återstående hjärnhinnorna som möjligt. Välj den bästa provexemplamentet orientering för att producera skivor med de särskilda egenskaperna hos den experimentella designen och använda ett nummer 24 skalpell blad för att trimma en plan yta för att vara basen som kommer att limmas på preparatskivan. Med hjälp av en destruktion plast sked och känsliga penslar, samla fragmentet från Petri-skålen och torka av överflödig lösning med filterpapper.Därefter använder superlim för att fästa vävnaden till vibratome exemplar skålen tills den är fast vidhäftad till skålen och i kontakt med agaros blocket. Placera vibratome-preparatskivan i vibratomens buffertfack. Lås knivhållaren på plats med rakbladet ordentligt fast.Tillsätt skivningslösning och se till att den täcker både preparatet och bladet. Sedan börja skära exemplaret i 200 mikrometer skivor. Överför skivorna från buffertfacket till en petriskål som innehåller skivningslösning och trimma eventuella lösa kanter och överflödig vit materia till en andel av cirka 70%cortex och 30%vit substans.I ett laminar flödesskåp, tillsätt 600 mikroliter av odlingsmedium till varje brunn av en 24-brunnsplatta och inkubera vid 36 grader Celsius med 5%koldioxid i minst 20 minuter före plätering av skivorna. Efter detta, använd en pensel för att platta en skiva i varje brunn. Om det finns några oanvända brunnar i plattan, fyll dem med 400 mikroliter sterilt vatten.Inkubera vid 36 grader Celsius med 5%koldioxid. Tillägg 10 milliliter av det tidigare beredda odlingsmediet med hjärnan härledd neurotrofa faktor vid en koncentration av 50 nanogram per milliliter. Efter åtta till 16 timmar, ta bort 333 mikroliter av det betingade mediet från varje brunn och tillsätt 133 mikroliter av färskt BDNF kompletterat medium.Ersätt en tredjedel av det konditionerade mediet med färskt BDNF kompletterat medium var 24:e timme. För först överför skivorna från brunnarna som innehåller odlingsmedium till en ny 24-brunnsplatta som innehåller PBS. Ta bort PBS från varje brunn och ersätta den med en milliliter av 4%paraformaldehyd.Inkubera över natten vid fyra grader Celsius. Nästa dag, försiktigt ta bort paraformaldehyd från brunnarna och ersätta den med en milliliter av 30%sackaros lösning. Inkubera vid fyra grader Celsius i 48 timmar.Efter 48 timmar, ställ in frysning mikrotom till negativa 40 grader Celsius. Förbered en sackarosbas på mikrotomstadiet där skivorna ska placeras. Efter det är fryst helt, skär några av de frysta sackaros för att producera en plan yta på vilken skiva kommer att placeras.Placera sedan varje skiva över en sträckt plastfilm och använd en pensel för att platta till vävnaden. I ett enda drag överför du den utsträckta skivan till den frysta sackarosbasen. När skivan har vilat i fem till 10 minuter för att frysa ordentligt, skär skivan i 30 mikrometersektioner.Överför 30 mikrometersektionerna till en petriskål som innehåller PBS och gå vidare till ett histologiprotokoll som är adekvat för den experimentella designen. Vid fastställandet av kvalitet och hälsa odlade skivor, en kritisk aspekt att utvärdera är närvaro och typiska morfologi av de förväntade neurala celltyper, nervceller och gliaceller celler. Den typiska arkitekturen av den mänskliga när laminering observeras i en skiva på dag in vitro fyra avslöjas av neuronal immunolabeling.Dessutom observeras också den förväntade förekomsten av mikroglia och astroglia. Dessa resultat visar att vävnadsarkitektur inte påverkas nämns i någon större utsträckning vare sig av det kirurgiska ingreppet, provbehandlingen eller av kortvariga perioden in vitro. Neuronal svar på kaliumklorid-inducerad depolarisering har också kvantifierats i odlade skivor genom att följa ERK fosforylering.Intressant nog ses en tydlig ökning av ERK-fosforylering i kaliumkloridbehandlade skivor på dag in vitro-fyra. Slutligen utvärderas svaret av skivor på dag in vitro-fyra till en toxisk utmaning med en känd oxidativ stress inducerare väteperoxid. Utsätta skivorna till 300 millimol väteperoxid i 24 timmar ledde till en kraftig minskning av MTT minskning.Sammantaget, den massiva celldöd observerats i dag in vitro fem skivor efter väteperoxid utmaning och kaliumklorid-inducerad depolarisering resultat visar bevarade allmänna hälsa skivor på dag in vitro fyra som svarar på en giftig stimulans såsom oxidativ stress. Detta protokoll är främst ägnas åt studier baserade på analyser som varar än en vecka såsom undersökning av molekylära mekanismer för neurotoxicitet och neuroprotektion av kandidat läkemedel. Även om detta protokoll ägnas åt att använda när vävnad som samlats in från patienter som lämnats till kirurgisk behandling för mikroresistenta temporala LOB epilepsi, det är troligt att vävnad som samlats in från andra hjärnan regioner eller villkor kan också källor för att producera fritt flytande skiva kulturer.Slice kulturer från vuxna mänskliga hjärnan kan vara nyckeln till att främja vår förståelse av mänskliga neuropathologies på grund av deras unika cellulära kretsar och molekylära maskiner saknas i skivor som produceras från gnagare hjärnor.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypic hippocampus Slice kulturer

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Analysen av Purkinje Cell Dendritic Morfologi i Organotypiska slice kulturer

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering av Pericyte-härledda celler i den vuxna mänskliga hjärnan i inducerade Nervceller

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Den Analys av neurovaskulär Remodeling i Entorhino-hippocampus Organotypic Slice kulturer

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Slice It Hot: Akut vuxna hjärnan Skivning i fysiologisk temperatur

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Framställning av primära blandade Glial kulturer från vuxen mus ryggmärg

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Härledning av Leptomeninges Explantation kulturer från obduktions Human Brain Donatorer

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Enkla Generation av en hög avkastning kultur av inducerade nervceller från mänsklig vuxen hud fibroblaster

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Förberedelse och immunfärgning av Myelinating Organotypic cerebellär Slice kulturer

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Inriktning alpha Synuclein aggregat i kutan perifer nerv fibrer av fritt flytande immunofluorescens assay

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...