Name: characterizing mutational load and clonal composition of human blood
Uploaded: 2019-07-11T15:00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood at JoVE.com

وقد دعمت هذه الدراسة بمنحة من المنظمة الهولندية للبحث العلمي من المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (رقم 016.Vidi.171.023) إلى R. v. V.

<ol>
	<li>Osorio, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+Reveal+Lineage+Relationships+and+Age-Related+Mutagenesis+in+Human+Hematopoiesis.">Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis.</a> Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Hematopoiesis+and+Blood-Cancer+Risk+Inferred+from+Blood+DNA+Sequence.">Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Clonal+Hematopoiesis+Associated+with+Adverse+Outcomes.">Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).</li><li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+haematopoiesis+harbouring+AML-associated+mutations+is+ubiquitous+in+healthy+adults.">Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> Nature Communications. 7, 1-7 (2016).</li><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+Signatures+of+Mutational+Processes+Operative+in+Human+Cancer.">Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer.</a> Cell Reports. 3, 246-259 (2013).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500, 415-421 (2013).</li><li>Alexandrov, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Repertoire+of+Mutational+Signatures+in+Human+Cancer.">The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. 513, 422-425 (2014).</li><li>Blokzijl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mutation+accumulation+in+human+adult+stem+cells+during+life.">Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life.</a> Nature. 538, 260-264 (2016).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+Current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: Current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+identification+of+single-nucleotide+variants+in+whole-genome-amplified+single+cells.">Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells.</a> Nature Methods. 14, 491-493 (2017).</li><li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150, (2012).</li><li>Jager, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mutation+accumulation+in+single+human+adult+stem+cells+by+whole-genome+sequencing+of+organoid+cultures.">Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures.</a> Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).</li><li>Boeva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control-FREEC:+A+tool+for+assessing+copy+number+and+allelic+content+using+next-generation+sequencing+data.">Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data.</a> Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).</li><li>Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MutationalPatterns:+Comprehensive+genome-wide+analysis+of+mutational+processes.">MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes.</a> Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).</li><li>Thorvaldsd&#243;ttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Genomics+Viewer+(IGV):+High-performance+genomics+data+visualization+and+exploration.">Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+human+hematopoietic+stem+cells+capable+of+long-term+multilineage+engraftment.">Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.</a> Science. , (2011).</li><li>Lee-Six, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+of+normal+human+blood+inferred+from+somatic+mutations.">Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations.</a> Nature. 561, 473-478 (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. , (2014).</li></ol>

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

المعروضة هنا هي طريقة للكشف عن الطفرات التي تراكمت خلال الحياة في HSPCs الفردية وبناء شجرة النسب التنموية المبكرة باستخدام هذه البيانات الطفرة.
ويجب استيفاء العديد من المتطلبات الحاسمة من أجل إجراء هذه الاختبارات بنجاح. أولا، يجب ضمان صلاحية العينة. التعامل السريع مع العينة هو المفتاح لضمان كفاءة الإجراء. ثانياً، سيؤثر فقدان قوة عامل النمو سلباً على التوسع الكلوني لـ HSPCs. لضمان فعالية عامل النمو العالي، من المهم تجنب دورات ذوبان التجميد وإعداد aliquots للاستخدام الواحد. ثالثا، بعد إجراء WGS، استدعاء التحول والتصفية، فمن الأهمية بمكان للتحقق من كلونية الثقافة clonal. لتأكيد كلونية الثقافة، يجب أن تتجمع VAF من الطفرات حول 0.5 في عينة طبيعية karyotypically (الشكل3). في الخلايا ذات الحمل الطفرة المنخفضة، مثل HSPCs دم الحبل السري، يكون من الأصعب تحديد الكلونية بسبب انخفاض أعداد الطفرات.
نهجنا يعتمد على التوسع في المختبر من الخلايا المفردة للسماح لWGS. لذلك، يقتصر نهجنا على الخلايا التي لديها القدرة على النسخ المتماثل لتوسيع clonally، مثل HSPCs. في أيدينا، حوالي 5٪ -30٪ من جميع الخلايا واحدة فرزها قادرة على التوسع بشكل كاف. ويمكن أن يؤدي انخفاض معدلات النمو في الخارج إلى تحيز في الاختيار. كما نوقش سابقا، يمكن للأساليب التي تستخدم WGA التغلب على هذا التحيز الاختيار لأن هذه التقنية لا تعتمد على توسيع الخلايا. ومع ذلك، فإن WGA له أوجه قصور خاصة به، ويبقى التضخيم الكلوني الطريقة الوحيدة لتحديد عدد الطفرات في الجينوم كله بدقة دون تسرب الاليليك والتغطية المتساوية على طول الجينوم، وخاصة في العينات ذات الجسدية الحقيقية المنخفضة أرقام الطفرة.
ويمكن استخدام البيانات التي يتم إنشاؤها باستخدام هذا النهج لتحديد الفيلوجينات في نظام المكونة للدم، حيث يمكن استخدام الطفرات المكتشفة في خلايا واحدة لتشريح سلالات الخلايا، كما هو موضح في الشكل 6. عادة، واحد أو اثنين من الطفرات يمكن أن تحدد كل فرع في متبرع صحي1. منذ فروع السلالات في وقت مبكر بعد الحمل، والطفرات التي تحدد هذه الفروع الأولى سوف تكون موجودة أيضا مع VAF منخفضة في العينة العادية المتطابقة التي استخدمت لتصفية المتغيرات الجرثومية1،18،19. في هذه الحالة ، يفضل استخدام الخلايا غير المكونة للدم ، مثل MSCs ، حيث من المتوقع أن تنفصل في وقت مبكر جدا أثناء التنمية عن نظام المكونة للدم. بما أنّ [ت-سلّس] يكون من أصل المكونة للدم, الإستعمال من هذا خلايا كيماثل عينة عاديّة أن ييصفّي [جرمنين] [فرينت] استطاع لذلك يخلط البناء من التفريع مبكّرة من ال [أنفيس تري] تنمويّة. إن وجود الطفرات الخاصة بالفرع في بعض مجموعات الدم الناضجة، والتي يمكن قياسها بالتسلسل العميق المستهدف، سيشير إلى أن ذرية ذلك الفرع يمكن أن تؤدي إلى هذا النوع من الخلايا الناضجة. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح نهجنا لتقييم العواقب الطفرة للتعرض للطفرات في الجسم الحي، وفي نهاية المطاف كيف يمكن أن يسهم ذلك في نمو ابيضاض الدم.

التعرض للجذع المكون للدم والخلايا السلف (HSPCs) للمصادر الذاتية أو الطاردة يساهم في التراكم التدريجي للطفرات في الحمض النووي خلال عمر1. تراكم الطفرة التدريجيفي HSPCs1 يمكن أن يؤدي إلى التهاب الدم المتصل بالعمر (ARCH)2،3، وهو حالة غير أعراض مدفوعة من قبل HSPCs تحمل طفرات سرطان الدم السائق. في البداية، كان يعتقد أن الأفراد مع ARCH لديهم خطر متزايد لسرطان الدم2،3. ومع ذلك، أظهرت الدراسات الحديثة حدوث 95٪ من ARCH في الأفراد المسنين4، مما يجعل الارتباط مع الأورام الخبيثة أقل وضوحا ويثير مسألة لماذا بعض الأفراد مع ARCH في نهاية المطاف القيام أو لا تتطور الأورام الخبيثة. ومع ذلك، يمكن أن تشكل الطفرات الجسدية في HSPCs مخاطر صحية خطيرة، حيث تتميز اضطرابات خلل التنسج النقوي وابيضاض الدم بوجود طفرات محددة لسائق السرطان.
ولتحديد العمليات النتغيرات ودراسة لون الدم، يجب أن يكون تراكم الطفرات في هذه الـ100 من الـ HSPCs الفردية مُميَّزًا. وتترك العمليات التحوجية أنماطاً مميزة في الجينوم، ما يسمى بالتوقيعات النتغيراتية، التي يمكن تحديدها وتحديدها كمياً في مجموعات الطفرات على نطاق الجينوم5. على سبيل المثال، تم ربط التعرض للأشعة فوق البنفسجية، ووكلاء الألكيلات،والعيوب في مسارات إصلاح الحمض النووي مع توقيع طفرة مختلفة 6،7. وبالإضافة إلى ذلك، بسبب الطبيعة العشوائية لتراكمات الطفرة، فإن معظم (إن لم يكن كل) الطفرات المكتسبة فريدة من نوعها بين الخلايا. إذا تم مشاركة الطفرات بين خلايا متعددة من نفس الفرد، فإنه يشير إلى أن هذه الخلايا تشترك في سلف مشترك8. لذلك، من خلال تقييم الطفرات المشتركة، يمكن تحديد علاقات النسب بين الخلايا ويمكن بناء شجرة النسب التنموية فرعا ً فرعاً. ومع ذلك، فإن فهرسة الطفرات الجسدية النادرة في الخلايا الطبيعية من الناحية الفسيولوجية هو أمر صعب من الناحية الفنية بسبب الطبيعة المتعددة الكلونية للأنسجة الصحية.
المعروضة هنا هي طريقة لتحديد وتحديد الطفرات الجسدية بدقة في الجينوم من HSPCs الفردية. وهذا ينطوي على عزل وتوسيع كلونال من HSPCs في المختبر. تعكس هذه الثقافات الكلونية التركيب الوراثي للخلية الأصلية (أي أن الطفرات في الخلية الأصلية سيتم تقاسمها من قبل جميع الخلايا الأخرى في الثقافة). يسمح لنا هذا النهج بالحصول على ما يكفي من الحمض النووي لتسلسل الجينوم الكامل (WGS). لقد أظهرنا في السابق أن الطفرات المتراكمة في المختبر خلال الثقافة الكلونية سيتم تقاسمها من قبل مجموعة فرعية من الخلايا. وهذا يتيح تصفية جميع الطفرات في المختبر، كما أن هذه سوف تكون موجودة في جزء أصغر من القراءة بالمقارنة مع الطفرات المكتسبة في الجسم الحي9. وقد حصلت الأساليب السابقة على ما يكفي من الحمض النووي من خلية واحدة لWGS باستخدام تضخيم الجينوم الكامل (WGA)10. ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي للWGA هو تضخيمها نسبيا عرضة للخطأ وغير متوازن من الجينوم، والتي يمكن أن تؤدي إلى تسرب الأليل11. ومع ذلك، وبما أن هذا النهج يعتمد على التوسع في المختبر للخلايا المفردة، فإنه يقتصر على خلايا الدم ذات الإمكانات التنسخية الكافية، وهذا ليس هو الحال بالنسبة للأساليب المعتمدة على WGA. وقد اعتمدت الجهود السابقة لتسلسل الثقافات clonal على استخدام طبقات التغذية لضمان تضخيم كلونال من HSPCs واحد12. ومع ذلك، يمكن للحمض النووي من طبقات التغذية أن يلوث الحمض النووي للثقافات الكلونية، مما يخلط بين الطفرة اللاحقة التي تدعو وتصفية. وتعتمد الطريقة المعروضة هنا فقط على وسيلة محددة لتوسيع مركبات الـ HSPCs الأحادية، وبالتالي تتجنب مسألة تلوث الحمض النووي. حتى الآن، قمنا بتطبيق هذه الطريقة بنجاح على نخاع العظم البشري، ودم الحبل السري، ونخاع العظام المجمدة بشكل جيد، والدم المحيطي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.20 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Syringe, Luer lock</td>
			<td>BD</td>
			<td>613-3925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301603</td>
			<td>Clone 3.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302005</td>
			<td>Clone 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 BV650</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300467</td>
			<td>Clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 BV421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343609</td>
			<td>561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38 PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303505</td>
			<td>Clone HIT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA PerCP/Cy5.5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304121</td>
			<td>Clone HI100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f PE/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313621</td>
			<td>Clone GoH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328113</td>
			<td>Clone 5E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 5 mL tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR plate, 384w, 130 &#181;L, F-bottom, TC, cover</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61965059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Flt3-Ligand, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-479</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78040.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (2.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78050.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TPO, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-095-752</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (12.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer 2.4</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12440061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>348701</td>
			<td>Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>#07861</td>
			<td>Used for Density gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in at Institute&#39;s facility. Commerically available PBS can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Antibiotic formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>56304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH800S Cell Sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM, 500mL</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mutational load and clonal composition of human blood

تتراكم تدريجيا ً طفرات الحمض النووي خلال العمر، والتي يمكن أن تسهم في الأمراض المرتبطة بالعمر مثل سرطان الدم. يمكن أن يؤدي توصيف تراكم الطفرات إلى تحسين فهم مسببات الأمراض المرتبطة بالعمر. وتُعرض هنا طريقة لفهرسة الطفرات الجسدية في الـ HSPCs الفردية، التي تستند إلى تسلسل الجينوم الكامل (WGS) لثقافات الخلايا الأولية الكلونية. يتم مشاركة الطفرات الموجودة في الخلية الأصلية من قبل جميع الخلايا في الثقافة clonal، في حين أن الطفرات المكتسبة في المختبر بعد فرز الخلايا موجودة في مجموعة فرعية من الخلايا. ولذلك، فإن هذه الطريقة تسمح للكشف الدقيق عن الطفرات الجسدية الموجودة في جينوم اتّصال اتّصالات الـ HSPCs الفردية، والتي تتراكم أثناء الحياة. هذه الكتالوجات من الطفرات الجسدية يمكن أن توفر رؤى قيمة في العمليات الطفرة النشطة في أنسجة المكونة للدم وكيف تسهم هذه العمليات في تكوين الكريات. وبالإضافة إلى ذلك، من خلال تقييم الطفرات الجسدية التي يتم تقاسمها بين HSPCs متعددة من نفس الفرد، يمكن تحديد علاقات النسب الكلونال والديناميات السكانية لتجمعات الدم. وبما أن هذا النهج يعتمد على التوسع في المختبر للخلايا المفردة، فإن الطريقة تقتصر على الخلايا المكونة للدم ذات الإمكانات التنسخية الكافية.

الإجراء التجريبي يتم تصوير سير العمل التجريبي في الشكل 1. استناداً إلى نوع مواد الإدخال، يجب اتباع خطوات مختلفة. في الشكل 2 يتم تصوير إخراج مقياس التدفق من نوع خلايا دم الحبل السري. أولا، يتم اختيار جميع الخلايا الأحادية عن طريق رسم فضفاضة بوابة حول هذه المجموعة السكانية. ثم، يتم عزل singlets عن طريق تحديد الخلايا ذات نسبة FSC-H/FSC-A الخطية، حيث أن نسبة FSC-H/FSC-A أقل تتضمن مزدوجة أو كتل خلايا. يتم استخدام نموذج التحكم غير ملطخة لتعريف بوابات فرز الخلايا للسلالة-، CD34+، CD38-، CD45RA-. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام CD90 و CD49f للتمييز بين خلايا السلفأو الخلايا الجذعية ذاتية التجديد17 (الشكل 2). يتيح فرز الفهرس إعادة تتبع الخلايا الفردية، ويتم تصوير الخلايا التي تم فرزها كنقاط بنية اللون. خلال زراعة الخلايا، يمكن أن تتوسع الحيوانات المستنسخة الفردية بوتيرة مختلفة، مع توسع بعض الحيوانات المستنسخة في غضون 3 أسابيع، في حين يتم توسيع الحيوانات المستنسخة الأخرى بشكل كامل حتى الأسبوع الخامس من الثقافة. انظر الشكل 3A،B للاطلاع على نمو المستعمرة التمثيلي. وتظهر صورة تمثيلية لثقافة السائبة MSC confluent تقريبا في 11 يوما بعد الطلاء (الشكل3C).
التحقق من الجودة بعد التسلسل وتحليل الطفرة يظهر مثال على إخراج تحليل رقم النسخة الذي تم إنشاؤه بواسطة Control-FreeC14 للتحقق من وجود تعديلات في رقم النسخ (الشكل 4). يمكن أن تشير معلومات Karyotypic إلى الكروموسومات التي يجب استبعادها أثناء تشغيل SNVFI (الخطوة 7.6). مؤامرة VAF التي أنشأتها SNVFI (الشكل 5) هو الرسم البياني لترددات الأليل البديل في العينة. تشير الذروة في قطعة الكثافة عند 0.5 إلى أن العينة هي clonal. للحصول على مزيد من البصيرة في الأسباب البيولوجية الكامنة وراء الطفرات، ويمكن تحليل هذه باستخدام حزمة R MutationalPatterns15. يصور هنا هو تحليل نموذجي تنتج مؤامرة 96-trinucleotide (الشكل6). بالإضافة إلى التحديد الكمي لأنواع الطفرات المختلفة، يمكن أيضًا إجراء استخراج التوقيع باستخدام هذه الأداة.
بناء شجرة سلالة تنموية يتم التحقق من صحة الطفرات المشتركة بين الحيوانات المستنسخة أو الموجودة في استنساخ (وعند VAF منخفضة) في التحكم الجرثومي باستخدام IGV. تعتبر الطفرات صحيحة عند وجودها في العينة وليس على مستويات عالية VAF في الجرثومة (الشكل7A). تعتبر الطفرات كاذبة عندما لا تكون موجودة في IGV، والتي يمكن أن تحدث في المناطق التي تم تعيينها بشكل سيئ (الشكل7B). في حالات أخرى، يتم الكشف عن الأحداث التي تم الكشف عنها من قبل SNVFI الطفرات الجرثومية (الشكل7C). ويوصى بشدة بإعادة التسلسل المستقل للطفرات عن طريق إعادة التسلسل المستهدف لهذه الطفرات في عمليات استنساخ مختارة.  بعد الكشف عن الطفرات الجسدية المشتركة بين المستنسخين، يتم إنشاء مصفوفة ثنائية (الخطوة 10.8). يتم إنشاء خريطة الحرارة التي تحتوي على الخلايا مع وبدون الطفرات المشتركة A-M. وفوق هذه الخريطة الحرارية يشارإلى شجرة النسب التنموية (الشكل 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig1.jpg"> الشكل 1: مخطط انسيابي يصور الإجراء التجريبي القائم على مواد الإدخال. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig2.jpg"> الشكل 2: استراتيجية فرز الخلايا. أولاً، يتم تنفيذ التجشّر على الخلايا أحادية النووية الصغيرة. ثانياً، يتم بوابات الخلايا المفردة عن طريق اختيار الكسر الخطي. الخلايا السالبة النسبية مسورة. يتم فرز كافة CD34+ CD38- CD45- الخلايا المفردة. وتجدر الإشارة إلى جزء من الخلايا باللون البني، وهي الخلايا التي تم فرزها التي تم تمييزها بواسطة خيار "فهرس الفرز". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig3.jpg"> الشكل 3: نتائج ثقافة الخلية التمثيلية. ممثل HSPC استنساخ في لوحة 384 جيدا في (A) 2 أسابيع بعد الطلاء و (B) 4 أسابيع بعد الطلاء. (C) ثقافة MSC بعد 2 أسابيع من استبدال المتوسطة. شريط مقياس = 100 درجة مئوية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig4.jpg"> الشكل 4: أنواع الكاريو. (A) Clonal HSPC الثقافة و (B) MSC عينة السائبة. تم تحديد أنواع الكاريوتايب من خلال تحليل عمق القراءة. كلا الرسمين البيانيين يشيرإلى عينة karyotypically العادي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig5.jpg"> الشكل 5: الرسم البياني لترددات الأليل المتغيرة. الرسم البياني لترددات الأليل البديل من المتغيرات في استنساخ قبل الخطوة الأخيرة تصفية SNVFI (VAF >0.3). تشير الذروة في VAF = 0.5 إلى أن العينة clonal. يتم استبعاد الطفرات تحت الكلل مع VAF منخفضة أثناء الخطوة الأخيرة تصفية SNVFI (VAF >0.3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig6.jpg"> الشكل 6: تحليل الطيف الطفرة التمثيلي للطفرات الجسدية في عينة من HSPC. يصور هو المساهمة النسبية لكل تغيير trinucleotide (التي يتم تغيير القاعدة الوسطى) إلى الطيف الكلي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig7.jpg"> الشكل 7: الفحص اليدوي للطفرات باستخدام IGV16. (أ) تعتبر الطفرات صحيحة عندما تكون موجودة في استنساخ وليس في عينة السائبة. (ب) تعتبر الطفرات إيجابية خاطئة عندما تكون موجودة في منطقة سيئة المعينة. (C) تعتبر الطفرات إيجابيات كاذبة عند وجودها في السيطرة على الجرثومة. يشير الخط العمودي إلى موضع طفرة تسمى. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig8.jpg"> الشكل 8: بناء شجرة سلالة تنموية. يصور هو مخطط الأسنان التي تشير إلى السلالات التنموية تقسيم قبالة أثناء التنمية. تشير الخريطة الحرارية تحت مخطط الأسنان إلى وجود طفرات في مختلف الحيوانات المستنسخة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig8large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood at JoVE.com

Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood

وصف الحمل النفيوى والتركيب الكلونى للدم البشري

تعكس أنماط الطفرة الجسدية في الخلايا التعرض السابق للطفرات ويمكن أن تكشف عن علاقات النسب التنموي. تُعرض هنا منهجية لفهرسة وتحليل الطفرات الجسدية في الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية الفردية.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) gradually accumulate DNA mutations during a lifespan, which can contribute to age-associated diseases such ...

مع هذه الطريقة، يمكننا تحديد بدقة عدد الطفرات في خلية جذعية واحدة. ويمكن استخدام هذه الطفرات لفك عمليات الطفرات وتشريح النسب الدموية. طريقتنا يتجنب استخدام تقنيات تضخيم الجينوم كله عن طريق استنساخ الخلايا الجذعية الدموية في المختبر، مما يؤدي إلى انخفاض معدلات الخطأ وفوائد تحليل المصب.يمكن أن تكشف الأنماط الطفرة الموجودة في جينوم الخلايا الجذعية المسببة للدم عن عمليات إصلاح الطفرات والحمض النووي التي تعرضت لها. ابدأ هذا الإجراء مع إعداد عينة المواد وتلطيخ كما هو موضح في بروتوكول النص، ثم إعداد 25 ملليلتر من الجذعية الدموية وخلية السلف، أو متوسط ثقافة HSPC. ملء خلية ثقافة 384 لوحة جيدة مع 75 ميكرولترات من ثقافة HSPC المتوسطة في كل بئر.لمنع تبخر المتوسطة في الآبار الخارجية، تعبئة الآبار الخارجية مع 75 ميكرولترات من الماء المعقم أو برنامج تلفزيوني، وعدم استخدام هذه الآبار لفرز الخلايا. الفرز الصحيح لـ HSPCs إشارة قابلة للتطبيق هو الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول. تعيين البوابات لفرز HSPC على أساس عنصر تحكم غير ملوث في 10،000 الخلايا من العينة الملطخة.بوابة الخلايا المفردة عن طريق رسم بوابة حول ارتفاع التشتت الأمامي الخطي مقابل كسر منطقة التشتت إلى الأمام. استخدم كسر عنصر التحكم غير المُطَرَّط لرسم بوابة لكسر النسب. رسم بوابات لالخلايا الإيجابية CD34 وميز كذلك هذه المجموعة الفرعية عن طريق وضع بوابة محددة لD38 السلبية، CD45RA الخلايا السلبية.قم بتحميل اللوحة التي تحتوي على 384 بئرًا على جهاز الفاكس وفرز الخلايا المفردة. إذا كان قابلاً للتطبيق على جهاز الفاكس، قم بالتبديل على الخيار للاحتفاظ بفهرسة بيانات الفرز لتمكين تعقب الخلايا التي تم فرزها. إلى الثقافة فرزها بشكل غير معلّم، لف لوحة ثقافة 384 بئرًا مع غطاء في غلاف البولي إيثيلين الشفاف.نقل لوحة 384-well إلى حاضنة 37 درجة مئوية مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والحفاظ عليه في الحاضنة لمدة ثلاثة إلى أربعة أسابيع حتى تظهر استنساخ مرئية. بعد أربعة أسابيع من الاستزراع، حدد الآبار التي تحتوي على التقاء بنسبة 30٪ أو أعلى. لكل مخروط، ملء مسبق 1.5 ملليلتر الأنابيب الدقيقة مع ملليلتر واحد من 1٪ BSA وPBS وتسمية الأنبوب وفقا لبرئ المقابلة.قبل الرطب تلميح ماصة مع 1٪ BSA وBBS لتقليل عدد الخلايا التمسك تلميح ماصة. بقوة ماصة المتوسطة صعودا وهبوطا خمس مرات على الأقل في حين كشط الجزء السفلي من البئر مع ماصة 200 ميكرولتر تعيين في 75 ميكرولترات. جمع تعليق الخلية في microtube المسمى الذي يتوافق مع البئر.كرر الأنابيب في البئر مع ما يصل إلى 75 ميكرولترات من 1٪ BSA الطازجة وبرنامج تلفزيوني لضمان أقصى قدر من امتصاص الخلايا. يمكن للخلايا المستزرعة كلونالي التمسك إلى الجزء السفلي من البئر. افحص الآبار باستخدام مجهر ضوء مقلوب قياسي للتأكد مما إذا كان قد تم جمع جميع الخلايا.إذا تم حصاد جميع الآبار التي يزيد التقاءها عن 30٪ ، ضع لوحة 384 بئرًا في الحاضنة. يمكن أن تتكاثر الثقافات التخفية لمدة تصل إلى خمسة أسابيع. تدور أسفل تعليق الخلية لمدة خمس دقائق في 350 مرات ز.وينبغي أن تكون بيليه صغيرة مرئية. إزالة بعناية كل ما عدا حوالي خمسة ميكرولترات من السوبر. يمكن تجميد كريات الخلايا عند ناقص 20 درجة مئوية وتخزينها لعدة أشهر قبل عزل الحمض النووي.الطفرات الموجودة في الفروع الأولى من lineagery ستكون أيضا تحت كلونالي موجودة في العينة السائبة. يتم تعريف أنساب المتفرعة اللاحقة بواسطة الطفرات المشتركة بين HSPCs فقط. لتحديد الطفرات الموجودة في مجموعة فرعية من المستنسخات و تحت كلينا موجودة في الجزء الأكبر ، أول مرشح للطفرات الجسدية المشتركة بين المستنسخين.في محطة طرفية Unix المستندة، تحرير filtersomatic. ني ملف لضبط الربتات وضبط المعلمات الأخرى. تشغيل filtersomatic.بي النصي. تصفية للطفرات التي هي subclonaly موجودة في الجزء الأكبر باستخدام تحديد lowVAF الجزء الأكبر. r البرنامج النصي في محطة Unix المستندة.سيؤدي ذلك إلى إنشاء ملفات vcf منفصلة لمتغيرات النيوكليوتيدات المفردة المشتركة والفريدة. تحديد جميع الطفرات المشتركة بين المستنسخين غير الموجودة في عينة الجزء الأكبر، عن طريق تداخل جميع مواضع الطفرات. استبعاد الإيجابيات الكاذبة عن طريق التفتيش اليدوي باستخدام عارض الجينوم التكاملي، مختصر IGV.تعتبر الطفرات زائفة عندما لا تكون موجودة عندما تكون الطفرة موجودة في الخط الجرثومي في جميع المستنسخات أو عندما تكون موجودة في مناطق غير مرسومة بشكل سيئ. يمكن أن تكون مشتركة الطفرات الحقيقية بين اثنين من المستنسخين أو أن تكون موجودة subclonaly في الجزء الأكبر. إعادة إنشاء كافة loci المشتركة بشكل مستقل باستخدام تسلسل المستهدفة أو sanger.استخدم الطفرات المشتركة لبناء جدول ثنائي من الطفرات مقابل المستنسخات المتسلسلة، مع عدم الإشارة إلى أن الطفرة غير موجودة وواحدة تشير إلى وجود الطفرة. إخراج الجدول الثنائي الطفرة كخريطة حرارية مع dendrogram تشير إلى علاقات النسب بين الخلايا باستخدام وظائف R أساس. تشير الخريطة الحرارية إلى حالة الطفرة لكل خلية.تظهر كـ مثال إخراج تحليل رقم نسخة التي تم إنشاؤها بواسطة عنصر التحكم ثلاثة c للتحقق من التعديلات رقم نسخة. البديل أليل جزء مؤامرة التي أنشأتها تصفية متغير وحيد النيوكليوتيد، هو مدرج التكرار من ترددات آليل البديل في العينة. تشير الذروة في قطعة الكثافة عند 0.5 إلى أن العينة غير مُتَنَكَة.يصور هنا هو نموذجي تحليل أنماط الطفرات إنتاج مؤامرة ثلاثية النوى 96. بالإضافة إلى القياس الكمي لأنواع الطفرات المختلفة، يمكن أيضًا إجراء استخراج التوقيع باستخدام هذه الأداة. يتم التحقق من الطفرات المشتركة بين المستنسخين أو الموجودة في استنساخ في عنصر التحكم في الخط الجرثومي باستخدام IGV.وتعتبر الطفرات صحيحة عندما تكون موجودة في العينة وليس عند مستويات تردد آليل متغيرة عالية في الخط الجرثومي. تعتبر الطفرات كاذبة عندما لا تكون موجودة في IGV ، والتي يمكن أن تحدث في المناطق التي تم تعيينها بشكل سيئ. وفي حالات أخرى، تكون الأحداث التي تم الكشف عنها بواسطة تصفية متغير النيوكليوتيد المفردة متغيرات جرثومية مفتقدة.ويوصى بشدة بإعادة التسييل المستقل للطفرات عن طريق إعادة التسييل المستهدف لهذه الطفرات في استنساخ مختارة. بعد الكشف عن الطفرات الجسدية المشتركة بين المستنسخين، يتم إنشاء مصفوفة ثنائية، يتم إنشاء خريطة حرارية تحتوي على خلايا مع وبدون الطفرات المشتركة A من خلال شجرة النسب التنموي M.The. كخطوة تالية للميتا المعروض هنا، يمكن تحديد العمليات الطفرة النشطة في الخلايا الجذعية الهموبويتية باستخدام تحليل التوقيع الطفرة.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

سيرنا ترنسفكأيشن وEMSA تحاليل المعزولة حديثا أرومة غاذية خلوية زغبي الإنسان

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

في الموقع وصفها من الحمض النووي النسخ المتماثل في ذبابة الفاكهة الكبار المبايض عن طريق ايدو تلطيخ

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

شرنا المجمعة الشاشة لإعادة تنشيط MeCP2 على كروموسوم X غير نشط

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

تحديد معدلات تسوس نسخة على نطاق الجينوم في الخلايا الليفية البشرية المتكاثرة وهادئة

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

عزل وتوصيف والمستندة إلى MicroRNA التحوير الوراثي للخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

تحديد الأحداث جزئ مثلى في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبي وتفاعل البوليميراز المتسلسل

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

يصف هستون تعديل بوستترانسلاشونال التعديلات في نماذج بروتينوباثي الأعصاب الخميرة

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

تسلسل mRNA من الدم الكامل باستخدام التسلسل نانو

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

تسلسل وتحليل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من الجزر البنكرياسية البشرية

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...