Name: characterizing mutational load and clonal composition of human blood
Uploaded: 2019-07-11T15:00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood at JoVE.com

Deze studie werd gesteund door een a VIDI Grant van de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO) (No. 016. Vidi. 171.023) naar R. v. B.

<ol>
	<li>Osorio, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+Reveal+Lineage+Relationships+and+Age-Related+Mutagenesis+in+Human+Hematopoiesis.">Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis.</a> Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Hematopoiesis+and+Blood-Cancer+Risk+Inferred+from+Blood+DNA+Sequence.">Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Clonal+Hematopoiesis+Associated+with+Adverse+Outcomes.">Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).</li><li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+haematopoiesis+harbouring+AML-associated+mutations+is+ubiquitous+in+healthy+adults.">Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> Nature Communications. 7, 1-7 (2016).</li><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+Signatures+of+Mutational+Processes+Operative+in+Human+Cancer.">Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer.</a> Cell Reports. 3, 246-259 (2013).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500, 415-421 (2013).</li><li>Alexandrov, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Repertoire+of+Mutational+Signatures+in+Human+Cancer.">The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. 513, 422-425 (2014).</li><li>Blokzijl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mutation+accumulation+in+human+adult+stem+cells+during+life.">Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life.</a> Nature. 538, 260-264 (2016).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+Current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: Current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+identification+of+single-nucleotide+variants+in+whole-genome-amplified+single+cells.">Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells.</a> Nature Methods. 14, 491-493 (2017).</li><li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150, (2012).</li><li>Jager, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mutation+accumulation+in+single+human+adult+stem+cells+by+whole-genome+sequencing+of+organoid+cultures.">Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures.</a> Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).</li><li>Boeva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control-FREEC:+A+tool+for+assessing+copy+number+and+allelic+content+using+next-generation+sequencing+data.">Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data.</a> Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).</li><li>Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MutationalPatterns:+Comprehensive+genome-wide+analysis+of+mutational+processes.">MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes.</a> Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).</li><li>Thorvaldsd&#243;ttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Genomics+Viewer+(IGV):+High-performance+genomics+data+visualization+and+exploration.">Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+human+hematopoietic+stem+cells+capable+of+long-term+multilineage+engraftment.">Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.</a> Science. , (2011).</li><li>Lee-Six, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+of+normal+human+blood+inferred+from+somatic+mutations.">Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations.</a> Nature. 561, 473-478 (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. , (2014).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier gepresenteerd is een methode om mutaties op te sporen die zich tijdens het leven in individuele Hspc's hebben verzameld en om een vroege ontwikkelings stamboom te construeren met behulp van deze mutatiegegevens.
Er moet aan verschillende kritieke vereisten worden voldaan om deze tests met succes te kunnen uitvoeren. Ten eerste moet de levensvatbaarheid van de steekproef worden gewaarborgd. Snelle hantering van het monster is essentieel om de efficiëntie van de procedure te garanderen. Ten tweede, verlies van groeifactor potentie zal negatieve invloed hebben op de klonale expansie van Hspc's. Om te zorgen voor een hoge groeifactor potentie, het is belangrijk om te voorkomen dat bevriezen-ontdooien cycli en bereiden voor eenmalig gebruik aliquots. Ten derde, na het uitvoeren van WGS, mutatie bellen en filteren, is het cruciaal om de clonaliteit van de klonale cultuur te valideren. Om de clonaliteit van de cultuur te bevestigen, moet de VAF van de mutaties rond de 0,5 in een karyotypisch normaal monster worden geclusteren (Figuur 3). In cellen met een lage mutationele belasting, zoals bloedarm Hspc's, is het moeilijker om de clonaliteit te bepalen als gevolg van de lage mutatie aantallen.
Onze aanpak is gebaseerd op in vitro uitbreiding van afzonderlijke cellen om WGS mogelijk te maken. Daarom is onze aanpak beperkt tot cellen die het replicatieve potentieel hebben om klonen uit te breiden, zoals Hspc's. In onze handen zijn ongeveer 5%-30% van alle enkelvoudige gesorteerde cellen in staat om voldoende uit te breiden. Gereduceerde uitgroei percentages kunnen mogelijk resulteren in een selectie bias. Zoals eerder besproken, methoden met behulp van WGA kunnen overwinnen deze selectie bias als deze techniek is niet afhankelijk van de uitbreiding van cellen. WGA heeft echter zijn eigen tekortkomingen, en van klonen Amplification blijft de enige methode om nauwkeurig het aantal mutaties in het hele genoom te bepalen zonder allel dropouts en gelijke dekking langs het genoom, vooral in monsters met lage echte somatische Mutatie nummers.
De gegevens die worden gegenereerd met behulp van deze aanpak kan worden gebruikt om te bepalen van de fylogenies van het hematopoietische systeem, als de mutaties gedetecteerd in enkele cellen kunnen worden gebruikt om te ontleden celkilometer standen, zoals afgebeeld in Figuur 6. Normaalgesproken kunnen een of twee mutaties elke tak in een gezonde donor1definiëren. Sinds het begin van de bevruchting van de lijn, zullen mutaties die deze eerste takken definiëren ook aanwezig zijn met een lage VAF in het overeenkomende normale monster dat werd gebruikt voor het filteren van de kiembaan varianten1,18,19. In dit geval, het gebruik van niet-hematopoietische cellen, zoals MSCs, hebben de voorkeur omdat ze worden verwacht zeer vroeg scheiden tijdens de ontwikkeling van het hematopoietische systeem. Aangezien T-cellen van hematopoietische oorsprong zijn, kon het gebruik van deze cellen als een overeenkomend normaal monster om kiembaan-varianten te filteren, daarom de bouw van de vroegste vertakking van de ontwikkelings Lineage-boom verbeelden. Subklonale aanwezigheid van branchespecifieke mutaties in bepaalde volwassen bloed populaties, die kunnen worden gemeten door gerichte diepe sequentiëren, geeft aan dat de nakomelingen van dat filiaal aanleiding kunnen geven tot dat volwassen celtype. Daarnaast maakt onze aanpak het mogelijk om de mutationele gevolgen van mutagene blootstelling in vivo te beoordelen en uiteindelijk hoe dit kan bijdragen aan leukemie ontwikkeling.

Blootstelling van hematopoietische stam en voorlopercellen (Hspc's) aan endogene of extrinsieke mutagene bronnen draagt bij tot de geleidelijke accumulatie van mutaties in het DNA gedurende een levensduur1. Geleidelijke mutatie accumulatie in hspcs1 kan resulteren in leeftijdsgebonden klonale hematopoiese (arch)2,3, wat een niet-symptomatische aandoening is die wordt aangedreven door hspc's die leukemie-driver mutaties dragen. Aanvankelijk, men dacht dat individuen met boog een verhoogd risico op leukemie2,3. Echter, recente studies hebben aangetoond een incidentie van 95% van de boog in oudere individuen4, waardoor de associatie met maligniteiten minder duidelijk en het verhogen van de vraag waarom sommige individuen met Arch uiteindelijk doen of niet maligniteiten ontwikkelen. Niettemin kunnen somatische mutaties in Hspc's ernstige gezondheidsrisico's inhouden, aangezien myelodysplastische stoornissen en leukemie worden gekenmerkt door de aanwezigheid van specifieke mutaties in de kanker-driver.
Om de mutationele processen te identificeren en bloed clonaliteit te bestuderen, moet mutatie accumulatie in individuele Hspc's worden gekarakteriseerd. Mutationele processen laten karakteristieke patronen achter in het genoom, zogenaamde mutationele handtekeningen, die kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd in Genome-brede verzamelingen van mutaties5. Zo zijn blootstelling aan UV-licht, alkylerende middelen en defecten in DNA-herstel trajecten elk geassocieerd met een andere mutationele handtekening van6,7. Bovendien, als gevolg van de stochastische aard van mutatie ophopingen, zijn de meeste (zo niet alle) verworven mutaties uniek tussen de cellen. Als mutaties worden gedeeld tussen meerdere cellen van dezelfde persoon, geeft dit aan dat deze cellen een gemeenschappelijke voorouder8delen. Daarom, door het beoordelen van gedeelde mutaties, kunnen Lineage relaties worden bepaald tussen cellen en een ontwikkelings Lineage boom kan worden geconstrueerd tak per tak. Het catalogeren van zeldzame somatische mutaties in fysiologisch normale cellen is echter technisch uitdagend vanwege het polyklonale karakter van gezonde weefsels.
Hier wordt gepresenteerd is een methode voor het nauwkeurig identificeren en bepalen van somatische mutaties in de genomen van individuele hspc's. Dit omvat de isolatie en klonale expansie van Hspc's in vitro. Deze klonale culturen weerspiegelen de genetische make-up van de oorspronkelijke cel (d.w.z. mutaties in de oorspronkelijke cel zullen worden gedeeld door alle andere cellen in de cultuur). Deze aanpak stelt ons in staat om voldoende DNA te verkrijgen voor gehele genoom sequencing (WGS). We hebben eerder aangetoond dat mutaties die in vitro zijn opgebouwd tijdens de klonale cultuur zullen worden gedeeld door een subset van cellen. Dit maakt het filteren van alle in vitro mutaties mogelijk, aangezien deze in een kleinere fractie van leesbewerkingen zullen voorkomen in vergelijking met in vivo verworven mutaties9. Eerdere methoden hebben voldoende DNA verkregen uit een enkele cel voor WGS met behulp van Whole-Genome Amplification (WGA)10. Het belangrijkste nadeel van WGA is echter de relatief foutgevoelige en onevenwichtige versterking van het genoom, wat kan resulteren in allel dropouts11. Niettemin, aangezien deze aanpak afhankelijk is van in vitro expansie van enkelvoudige cellen, is het beperkt tot bloedcellen met voldoende replicatief potentieel, wat niet het geval is voor WGA-afhankelijke methoden. Eerdere inspanningen in de sequentie van klonale culturen vertrouwden op het gebruik van feederlagen om te zorgen voor een klonale versterking van enkele Hspc's12. DNA van de feederlagen kan het DNA van de klonale culturen echter mogelijk verontreinigen, wat de daaropvolgende mutatie roeping en filtering verrichtte. De hier gepresenteerde methode is uitsluitend gebaseerd op gespecificeerde middellange tot klonaal uitbreiding van enkelvoudige hspc's, en vermijdt daarom het probleem van DNA-besmetting. Tot nu hebben we deze methode met succes toegepast op menselijk beenmerg, snoer bloed, goed bevroren beenmerg en perifeer bloed.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.20 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Syringe, Luer lock</td>
			<td>BD</td>
			<td>613-3925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301603</td>
			<td>Clone 3.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302005</td>
			<td>Clone 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 BV650</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300467</td>
			<td>Clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 BV421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343609</td>
			<td>561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38 PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303505</td>
			<td>Clone HIT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA PerCP/Cy5.5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304121</td>
			<td>Clone HI100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f PE/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313621</td>
			<td>Clone GoH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328113</td>
			<td>Clone 5E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 5 mL tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR plate, 384w, 130 &#181;L, F-bottom, TC, cover</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61965059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Flt3-Ligand, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-479</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78040.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (2.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78050.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TPO, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-095-752</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (12.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer 2.4</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12440061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>348701</td>
			<td>Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>#07861</td>
			<td>Used for Density gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in at Institute&#39;s facility. Commerically available PBS can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Antibiotic formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>56304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH800S Cell Sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM, 500mL</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mutational load and clonal composition of human blood

Hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPCs) accumuleren geleidelijk DNA-mutaties tijdens een levensduur, wat kan bijdragen aan leeftijdsgebonden ziekten zoals leukemie. Karakteriseren mutatie accumulatie kan het begrip van de etiologie van leeftijdsgebonden ziekten verbeteren. Hier gepresenteerd is een methode om somatische mutaties in individuele Hspc's te catalogiseren, die is gebaseerd op Whole-genoom sequencing (WGS) van klonale primaire celculturen. Mutaties die in de oorspronkelijke cel aanwezig zijn, worden door alle cellen in de klonale cultuur gedeeld, terwijl mutaties die in vitro zijn verworven na het sorteren van cellen aanwezig zijn in een subset van celwaarden. Daarom zorgt deze methode voor een nauwkeurige detectie van somatische mutaties die aanwezig zijn in de genomen van individuele hspc's, die zich tijdens het leven ophopen. Deze catalogi van somatische mutaties kunnen waardevolle inzichten bieden in mutationele processen die actief zijn in het hematopoietische weefsel en hoe deze processen bijdragen aan leukemogenese. Bovendien kunnen door het beoordelen van somatische mutaties die worden gedeeld tussen meerdere Hspc's van hetzelfde individu, klonale Lineage relaties en populatiedynamiek van bloed populaties worden bepaald. Aangezien deze aanpak afhankelijk is van in vitro expansie van enkelvoudige cellen, is de methode beperkt tot hematopoietische cellen met voldoende replicatief potentieel.

Experimentele procedure De experimentele werkstroom wordt afgebeeld in Figuur 1. Op basis van het type invoer materiaal moeten verschillende stappen worden gevolgd. In Figuur 2 wordt een Flow cytometrische uitgang van een bloedcel sortering van het snoer afgebeeld. Eerst worden alle monocytische cellen geselecteerd door losjes een hek rond deze populatie te trekken. Vervolgens worden onderhemden geïsoleerd door te selecteren voor cellen met een lineaire FSC-h/FSC-a ratio, als een lagere FSC-h/FSC-a ratio inclusief wambuizen of Cell clumps. Het onbevlekte controlemonster wordt gebruikt om de celsorteer poorten voor Lineage-, CD34+, CD38-, CD45RA-te definiëren. Daarnaast kunnen CD90 en CD49f worden gebruikt om onderscheid te maken tussen voorlopercellen of zelf-vernieuwende stamcellen17 (Figuur 2). Index sortering maakt het opnieuw traceren van afzonderlijke cellen mogelijk en de gesorteerde cellen worden afgebeeld als bruine stippen. Tijdens de celkweek kunnen individuele klonen in een ander tempo groeien, waarbij sommige klonen binnen 3 weken worden uitgebreid, terwijl andere klonen pas volledig worden uitgebreid tot de vijfde week van de cultuur. Zie afbeelding 3a, B voor representatieve kolonie-uitgroei. Een representatief beeld wordt getoond van een bijna confluente MSC bulk cultuur op 11 dagen na het beplating (figuur 3c).
Kwaliteit controleren na sequentiëren en mutatieanalyse Weergegeven is een voorbeelduitvoer van de kopie-nummeranalyse gegenereerd door Control-FreeC14 om te controleren op kopie nummer wijzigingen (Figuur 4). Karyotypische informatie kan aangeven welke chromosomen uit te sluiten tijdens een SNVFI run (stap 7,6). Het VAF plot gemaakt door SNVFI (Figuur 5) is een histogram van variant allel frequenties in het monster. Een piek in het dichtheids perceel op 0,5 geeft aan dat het monster klonale is. Om meer inzicht te krijgen in de onderliggende biologische oorzaken achter mutaties, kunnen deze worden geanalyseerd met behulp van het R-pakket MutationalPatterns15. Hier afgebeeld is een typische analyse die een 96-trinucleotide plot produceert (Figuur 6). Naast de kwantificering van verschillende mutatie typen kan ook handtekening extractie met deze tool worden uitgevoerd.
Het opbouwen van een ontwikkelings Lineage tree Mutaties die worden gedeeld tussen klonen of aanwezig zijn in een kloon (en bij lage VAF) in het besturingselement kiembaan worden gevalideerd met behulp van igv. Mutaties worden als waar beschouwd wanneer ze in het monster aanwezig zijn en niet op hoge VAF-niveaus in de kiembaan (figuur 7A). Mutaties worden als vals beschouwd wanneer ze niet aanwezig zijn in IGV, wat kan gebeuren in slecht toegewezen gebieden (figuur 7b). In andere gevallen, gebeurtenissen gedetecteerd door snvfi worden gemist kiembaan mutaties (figuur 7C). Onafhankelijke hersequencing van mutaties door gerichte re-sequencing wordt ten zeerste aanbevolen voor deze mutaties in geselecteerde klonen.  Na detectie van gedeelde somatische mutaties tussen klonen wordt een binaire matrix gegenereerd (stap 10,8). Een heatmap is opgebouwd met cellen met en zonder de gedeelde mutaties A-M. Boven deze heatmap wordt de ontwikkelings Lineage boom aangegeven (Figuur 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig1.jpg"> Figuur 1: stroomdiagram met een experimentele procedure op basis van input materiaal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig2.jpg"> Figuur 2: Sorteer strategie voor cellen. Eerst wordt gating uitgevoerd op kleine mononucleaire cellen. Ten tweede worden enkele cellen afgeschermd door selectie van de lineaire breuk. Lineage negatieve cellen worden afgesloten. Alle CD34+ CD38- CD45- cellen zijn eencellige gesorteerd. De Fractie van de cellen in bruin moet worden genoteerd, welke zijn de gesorteerde cellen gemarkeerd door de optie "index Sorteren". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig3.jpg"> Figuur 3: representatieve celcultuurresultaten. Representatieve HSPC klonen in een 384 goed plaat op (a) 2 weken na het beplating en (B) 4 weken na het beplating. C) MSC-cultuur na 2 weken gemiddelde vervanging. Schaalbalk = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig4.jpg"> Figuur 4: Karyotypen. A) KLONALE hspc-cultuur en (B) MSC-bulk monster. De karyotypes werden bepaald door een lees diepteanalyse. Beide grafieken duiden op een karyotypisch normaal monster. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig5.jpg"> Figuur 5: histogram van variant allel-frequenties. Histogram van variant allel frequenties van de varianten in een kloon vóór de laatste filterstap van SNVFI (VAF > 0.3). Een piek bij VAF = 0,5 geeft aan dat het monster klonale is. De subclonal mutaties met lage VAF zijn uitgesloten tijdens de laatste filterstap van SNVFI (VAF > 0.3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig6.jpg"> Figuur 6: representatieve mutatie spectrum analyse van somatische mutaties in een hspc-monster. Afgebeeld is de relatieve bijdrage van elke trinucleotide-verandering (waarvan de middelste basis is gemuleerd) tot het totale spectrum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig7.jpg"> Figuur 7: manuele inspectie van mutaties met behulp van IGV16. A) mutaties worden als waar beschouwd wanneer zij in de kloon aanwezig zijn en niet in het bulk monster. B) mutaties worden als vals-positieven beschouwd wanneer ze in een slecht toegewezen gebied aanwezig zijn. C) mutaties worden als vals-positieven beschouwd als ze in een kiembaan-controle aanwezig zijn. De verticale lijn geeft de positie van een zogenaamde mutatie aan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig8.jpg"> Figuur 8: bouw van een boom van de ontwikkelings afstamming. Afgebeeld is een dendrogram dat de ontwikkelingslijn aangeeft die tijdens de ontwikkeling afsplitst. De heatmap onder het dendrogram duidt op de aanwezigheid van mutaties in verschillende klonen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood at JoVE.com

Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood

Karakteriseren van Mutationele belasting en klonale samenstelling van menselijk bloed

Somatische mutatie patronen in cellen weerspiegelen de eerdere mutagene blootstelling en kunnen ontwikkelings relaties met de afstamming onthullen. Hier gepresenteerd is een methodologie voor het catalogiseren en analyseren van somatische mutaties in individuele hematopoietische stam-en voorlopercellen.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) gradually accumulate DNA mutations during a lifespan, which can contribute to age-associated diseases such ...

Met deze methode kunnen we nauwkeurig het aantal mutaties in één hematopoietische stamcel bepalen. Deze mutaties kunnen worden gebruikt om mutatieprocessen te ontcijferen en hematopoietische afstammingen te ontleden. Onze methode vermijdt het gebruik van hele-genoomversterkingstechnieken door de hematopoietische stamcellen in vitro te klonen, wat resulteert in lagere foutenpercentages en voordelen downstream-analyse.De mutatiepatronen die aanwezig zijn in het genoom van hematopoietische stamcellen kunnen de mutagene en de DNA-herstelprocessen onthullen waaraan ze zijn blootgesteld. Begin deze procedure met de voorbereiding van monstermateriaal en kleuring zoals beschreven in het tekstprotocol en bereid vervolgens 25 milliliter hematopoietische stam- en voorvadercel of HSPC-kweekmedium voor. Vul een celcultuur 384 putplaat met 75 microliters van HSPC cultuurmedium in elke put.Om verdamping van het medium in de buitenste putten te voorkomen, vul de buitenste putten met 75 microliter steriel water of PBS en gebruik deze putten niet voor celsortering. Correct sorteren van levensvatbare signaal HSPCs is de meest kritieke stap in dit protocol. Stel poorten in voor de HSPC-sortering op basis van een onbevlekte controle in 10.000 cellen uit het gekleurde monster.Poort enkele cellen door het tekenen van een poort rond de lineaire voorwaartse spreiding hoogte versus voorwaartse verstrooiing gebied fractie. Gebruik de niet-bevlekte regelfractie om een poort te tekenen voor de lijnfractie. Teken poorten voor CD34 positieve cellen en verder karakteriseren deze subset door het instellen van een specifieke poort voor CD38 negatieve, CD45RA negatieve cellen.Laad de 384-put plaat op de fax machine en sorteren enkele cellen. Indien van toepassing op het faxapparaat, schakelt u de optie in om indexsorteergegevens te behouden om het traceren van de gesorteerde cellen mogelijk te maken. Om cultuur afzonderlijk gesorteerd HSCs, wikkel de 384-well cultuur plaat met deksel in transparante polyethyleen wrap.Breng de 384-well plaat naar een bevochtigde 37 graden Celsius incubator met 5% kooldioxide en bewaar het in de couveuse voor drie tot vier weken totdat zichtbare klonen verschijnen. Na vier weken kweken, bepalen welke putten hebben een samenvloeiing van 30%of hoger. Voor elke kegel, prefill 1,5 milliliter microtubes met een milliliter van 1%BSA en PBS en label de buis volgens de overeenkomstige put.Maak een pipettip voor met 1%BSA en PBS om het aantal cellen dat aan de pipetpunt blijft plakken te minimaliseren. Krachtig pipette het medium op en neer ten minste vijf keer tijdens het schrapen van de bodem van de put met de 200 microliter pipet ingesteld op 75 microliters. Verzamel de celsuspensie in de gelabelde microbuis die overeenkomt met de put.Herhaal pipeting in de put met maximaal 75 microliters van verse 1%BSA en PBS om een maximale opname van cellen te garanderen. Clonally gekweekte cellen kunnen vasthouden aan de bodem van de put. Inspecteer de putten met behulp van een standaard, omgekeerde lichtmicroscoop om ervoor te zorgen of alle cellen zijn verzameld.Als alle putten met meer dan 30% samenvloeiing zijn geoogst, plaatst u de 384-put plaat terug in de couveuse. Klonale culturen kunnen zich tot vijf weken vermenigvuldigen. Draai de celsuspensie vijf minuten naar beneden bij 350 keer g.Een kleine pellet moet zichtbaar zijn. Verwijder voorzichtig alle, maar ongeveer vijf microliter van de supernatant. Celpellets kunnen worden ingevroren bij min 20 graden Celsius en meerdere maanden voor DNA-isolatie worden opgeslagen.Mutaties aanwezig in de eerste takken van de afstamming zullen ook sub clonally aanwezig zijn in het bulkmonster. Latere vertakkingslijnen worden bepaald door mutaties die alleen tussen HSPCs worden gedeeld. Om mutaties te identificeren die aanwezig zijn in een subset van de klonen en subclonaly aanwezig zijn in de bulk, eerste filter voor somatische mutaties gedeeld tussen klonen.Bewerk in een terminal op basis van Unix de filtersomatische. ne bestand om de aaien in te stellen en de andere parameters aan te passen. Voer de filtersomatic.pi script. Filter op mutaties die subclonaly aanwezig zijn in de bulk met behulp van de determine lowVAF bulk. r-script in een Unix-gebaseerde terminal.Dit genereert aparte vcf-bestanden voor gedeelde en unieke nucleotidevarianten. Bepaal alle mutaties die worden gedeeld tussen klonen die niet aanwezig zijn in het bulkmonster, door alle mutatieposities te overlappen. Sluit false positives uit door handmatige inspectie met integrative genomic viewer, afgekort IGV.Mutaties worden als vals beschouwd wanneer deze niet aanwezig is wanneer de mutatie aanwezig is in de kiembaan in alle klonen of wanneer deze aanwezig zijn in slecht in kaart gebrachte gebieden. Echte mutaties kunnen worden gedeeld tussen twee klonen of subclonaly aanwezig zijn in de bulk. Resequence alle gedeelde loci onafhankelijk met behulp van gerichte of sanger sequencing.Gebruik de gedeelde mutaties om een binaire tabel van mutaties versus gesequencede klonen te bouwen, waarbij nul aangeeft dat de mutatie niet aanwezig is en een tabel die de aanwezigheid van de mutatie aangeeft. Output de mutatie binaire tabel als een heat map samen met een dendrogram met vermelding van afstamming relaties tussen cellen met behulp van R gebaseerde functies. De heatmap geeft de mutatiestatus voor elke cel aan.Getoond als een voorbeelduitvoer van de analyse van het kopienummer die door besturingselement drie c wordt gegenereerd om te controleren op wijzigingen in het kopienummer. De variant alleel fractie plot gemaakt door enkele nucleotide variant filteren, is een histogram van variant allel frequenties in het monster. Een piek in het dichtheidsperceel op 0,5 geeft aan dat het monster klonaal is.Hier afgebeeld is een typische mutatiepatronen analyse produceren van een 96 trinucleotide plot. Naast kwantificering van verschillende mutatietypes, kan ook met deze tool de extractie van de handtekening worden uitgevoerd. Mutaties die worden gedeeld tussen klonen of aanwezig zijn in een kloon in de kiembaancontrole worden gevalideerd met behulp van IGV.Mutaties worden als waar beschouwd wanneer ze in het monster aanwezig zijn en niet bij hoge variantallelfrequentieniveaus in de kiembaan. Mutaties worden als vals beschouwd wanneer ze niet aanwezig zijn in IGV, wat kan gebeuren in slecht in kaart gebrachte regio's. In andere gevallen worden gebeurtenissen gedetecteerd die worden gedetecteerd door het filteren van één nucleotidevariant, gemiste kiembaanvarianten.Onafhankelijke resequencing van mutaties door gerichte resequencing wordt sterk aanbevolen voor deze mutaties in geselecteerde klonen. Na detectie van gedeelde somatische mutaties tussen klonen wordt een binaire matrix gegenereerd, wordt een warmtekaart samengesteld met cellen met en zonder de gedeelde mutaties A tot en met M.De ontwikkelingslijnboom wordt aangegeven. Als volgende stap voor de hier gepresenteerde meta kunnen mutatieprocessen die actief zijn in hemopoietische stamcellen worden bepaald aan de hand van mutatiesignatuuranalyse.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA Transfectie en EMSA Analyses op vers geïsoleerde Human Villous cytotrofoblasten

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling van mitochondriaal DNA-replicatie in Drosophila volwassen Eierstokken van Edu kleuring

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Gebundelde shRNA scherm voor de heractivering van het MeCP2 op het inactieve X-chromosoom

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Bepalen van genoom-brede Transcript verval tarieven in delende en zwakke menselijke fibroblasten

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolatie, karakterisering en MicroRNA gebaseerde genetische modificatie van stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identificatie van homologe recombinatie gebeurtenissen in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern Blotting en de Kettingreactie van de Polymerase

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Karakterisering van Histone posttranslationele wijziging wijzigingen in gist neurodegeneratieve Proteinopathy modellen

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Het rangschikken van mRNA van geheel bloed gebruikend Nanogaatje het rangschikken

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Eencellige RNA-sequencing en analyse van menselijke pancreatic eilandjes

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...