Name: characterizing mutational load and clonal composition of human blood
Uploaded: 2019-07-11T15:00:00
Duration: 7 min 58 s
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Cette étude a été soutenue par une subvention VIDI de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO) (no. 016.Vidi.171.023) à R. c. B.

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	<li>Osorio, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+Reveal+Lineage+Relationships+and+Age-Related+Mutagenesis+in+Human+Hematopoiesis.">Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis.</a> Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Hematopoiesis+and+Blood-Cancer+Risk+Inferred+from+Blood+DNA+Sequence.">Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Clonal+Hematopoiesis+Associated+with+Adverse+Outcomes.">Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).</li><li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+haematopoiesis+harbouring+AML-associated+mutations+is+ubiquitous+in+healthy+adults.">Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> Nature Communications. 7, 1-7 (2016).</li><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+Signatures+of+Mutational+Processes+Operative+in+Human+Cancer.">Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer.</a> Cell Reports. 3, 246-259 (2013).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500, 415-421 (2013).</li><li>Alexandrov, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Repertoire+of+Mutational+Signatures+in+Human+Cancer.">The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. 513, 422-425 (2014).</li><li>Blokzijl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mutation+accumulation+in+human+adult+stem+cells+during+life.">Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life.</a> Nature. 538, 260-264 (2016).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+Current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: Current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+identification+of+single-nucleotide+variants+in+whole-genome-amplified+single+cells.">Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells.</a> Nature Methods. 14, 491-493 (2017).</li><li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150, (2012).</li><li>Jager, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mutation+accumulation+in+single+human+adult+stem+cells+by+whole-genome+sequencing+of+organoid+cultures.">Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures.</a> Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).</li><li>Boeva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control-FREEC:+A+tool+for+assessing+copy+number+and+allelic+content+using+next-generation+sequencing+data.">Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data.</a> Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).</li><li>Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MutationalPatterns:+Comprehensive+genome-wide+analysis+of+mutational+processes.">MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes.</a> Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).</li><li>Thorvaldsd&#243;ttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Genomics+Viewer+(IGV):+High-performance+genomics+data+visualization+and+exploration.">Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+human+hematopoietic+stem+cells+capable+of+long-term+multilineage+engraftment.">Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.</a> Science. , (2011).</li><li>Lee-Six, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+of+normal+human+blood+inferred+from+somatic+mutations.">Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations.</a> Nature. 561, 473-478 (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. , (2014).</li></ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Présenté ici est une méthode pour détecter les mutations qui se sont accumulées au cours de la vie dans les HSPC individuels et de construire un arbre de lignée développementale précoce en utilisant ces données de mutation.
Plusieurs exigences critiques doivent être remplies afin d'effectuer ces essais avec succès. Premièrement, la viabilité de l'échantillon doit être assurée. Une manipulation rapide de l'échantillon est essentielle pour assurer l'efficacité de la procédure. Deuxièmement, la perte de puissance du facteur de croissance aura une incidence négative sur l'expansion clonale des HSPC. Pour assurer une puissance élevée du facteur de croissance, il est important d'éviter les cycles de gel-dégel et de préparer des aliquots à usage unique. Troisièmement, après avoir effectué WGS, appel de mutation et de filtrage, il est crucial de valider la clonalité de la culture clonale. Pour confirmer la clonalité de la culture, le VAF des mutations devrait se regrouper autour de 0,5 dans un échantillon karyotypiquement normal (Figure 3). Dans les cellules à faible charge mutationnelle, comme les HSPC de sang de cordon, il est plus difficile de déterminer la clonalité due aux faibles nombres de mutation.
Notre approche repose sur l'expansion in vitro des cellules individuelles pour permettre le WGS. Par conséquent, notre approche est limitée aux cellules qui ont le potentiel réplicif de se développer de façon clonale, comme les HSPC. Dans nos mains, environ 5%-30% de toutes les cellules à tri unique sont capables de se développer correctement. La réduction des taux de croissance peut entraîner un biais de sélection. Comme nous l'avons vu précédemment, les méthodes utilisant WGA peuvent surmonter ce biais de sélection que cette technique est ne repose pas sur l'expansion des cellules. Cependant, LA WGA a ses propres défauts, et l'amplification clonale reste la seule méthode pour déterminer avec précision le nombre de mutations dans l'ensemble du génome sans abandons alléliques et une couverture égale le long du génome, en particulier dans les échantillons avec peu de somatique vrai numéros de mutation.
Les données générées à l'aide de cette approche peuvent être utilisées pour déterminer les phylogénies du système hématopoïétique, car les mutations détectées dans les cellules individuelles peuvent être utilisées pour disséquer les lignées cellulaires, comme le montre la figure 6. Typiquement, une ou deux mutations peuvent définir chaque branche dans un donneur sain1. Puisque la branche de lignéetôt après la conception, les mutations définissant ces premières branches seront également présentes avec un bas VAF dans l'échantillon normal assorti qui a été employé pour filtrer les variantes de germline1,18,19. Dans ce cas, l'utilisation des cellules non hématopoïétiques, telles que les MSC, sont préférées car on s'attend à ce qu'elles se séparent très tôt pendant le développement du système hématopoïétique. Comme les lymphocytes T sont d'origine hématopoïétique, l'utilisation de ces cellules comme échantillon normal assorti pour filtrer les variantes germinales pourrait donc confondre la construction de la branchement la plus précoce de l'arbre de lignée développementale. La présence sous-clonale de mutations spécifiques aux branches dans certaines populations sanguines matures, qui peuvent être mesurées par un séquençage profond ciblé, indiquera que la progéniture de cette branche peut donner naissance à ce type de cellules matures. En outre, notre approche permet d'évaluer les conséquences mutationnelles de l'exposition mutagène in vivo et, en fin de compte, comment cela peut contribuer au développement de la leucémie.

L'exposition des cellules hématopoïétiques de tige et d'ancêtre (HSPC) aux sources mutagenic endogènes ou extrinsèques contribue à l'accumulation progressive des mutations dans l'ADN pendant une durée de vie1. L'accumulation graduelle de mutation dans HSPcs1 peut avoir comme conséquence l'hématopoiesis clonal relatif à l'âge (ARCH)2,3, qui est une condition non-symptomatique conduite par HSPcs portant des mutations leucémie-conducteur. Initialement, on pensait que les personnes atteintes d'ARCH ont un risque accru de leucémie2,3. Cependant, des études récentes ont montré une incidence de 95% de arch chez les personnes âgées4, ce qui rend l'association avec les tumeurs malignes moins claire et soulevant la question de savoir pourquoi certaines personnes atteintes d'ARCH finissent par développer ou ne développent pas de tumeurs malignes. Néanmoins, les mutations somatiques dans les HSPC peuvent poser de graves risques pour la santé, car les troubles myélodysplasiques et la leucémie sont caractérisés par la présence de mutations spécifiques du conducteur du cancer.
Pour identifier les processus mutationnels et étudier la clonalité sanguine, l'accumulation de mutation dans les HSPC individuels doit être caractérisée. Les processus mutationnels laissent des modèles caractéristiques dans le génome, ce que l'on appelle les signatures mutationnelles, qui peuvent être identifiés et quantifiés dans des collections de mutations à l'échelle du génome5. Par exemple, l'exposition à la lumière UV, aux agents alkylants et aux défauts des voies de réparation de l'ADN ont été associées à une signature mutationnelle différente6,7. En outre, en raison de la nature stochastique des accumulations de mutation, la plupart (sinon la totalité) des mutations acquises sont uniques entre les cellules. Si des mutations sont partagées entre plusieurs cellules d'un même individu, cela indique que ces cellules partagent un ancêtre commun8. Par conséquent, en évaluant les mutations partagées, les relations de lignée peuvent être déterminées entre les cellules et un arbre de lignée développementale peut être construit branche par branche. Cependant, le catalogage des mutations somatiques rares dans les cellules physiologiquement normales est techniquement provocant en raison de la nature polyclonal des tissus sains.
Présenté ici est une méthode pour identifier et déterminer avec précision les mutations somatiques dans les génomes des HSPC individuels. Cela implique l'isolement et l'expansion clonale des HSPC in vitro. Ces cultures clonales reflètent la composition génétique de la cellule d'origine (c.-à-d. que les mutations de la cellule d'origine seront partagées par toutes les autres cellules de la culture). Cette approche nous permet d'obtenir suffisamment d'ADN pour le séquençage du génome entier (WGS). Nous avons déjà montré que les mutations accumulées in vitro pendant la culture clonale seront partagées par un sous-ensemble de cellules. Cela permet le filtrage de toutes les mutations in vitro, car celles-ci seront présentes dans une plus petite fraction de lectures par rapport aux mutations acquises in vivo9. Les méthodes précédentes ont obtenu suffisamment d'ADN à partir d'une seule cellule pour WGS en utilisant l'amplification du génome entier (WGA)10. Cependant, le principal inconvénient de la WGA est son amplification relativement sujette aux erreurs et déséquilibrée du génome, ce qui peut entraîner des abandons allèle11. Néanmoins, comme cette approche repose sur l'expansion in vitro des cellules individuelles, elle se limite aux cellules sanguines ayant un potentiel réplicif suffisant, ce qui n'est pas le cas pour les méthodes dépendantes de la WGA. Les efforts antérieurs de séquençage des cultures clonales ont compté sur l'utilisation de couches d'alimentation pour assurer l'amplification clonale des HSPC simples12. Cependant, l'ADN des couches d'alimentation peut potentiellement contaminer l'ADN des cultures clonales, confondant l'appel et le filtrage ultérieurs de mutation. La méthode présentée ici repose uniquement sur un moyen précis d'expansion ponctuelle des HSPC uniques, et évite ainsi la question de la contamination par l'ADN. Jusqu'à présent, nous avons appliqué avec succès cette méthode sur la moelle osseuse humaine, le sang de cordon, la moelle osseuse bien gelée et le sang périphérique.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.20 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Syringe, Luer lock</td>
			<td>BD</td>
			<td>613-3925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301603</td>
			<td>Clone 3.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302005</td>
			<td>Clone 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 BV650</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300467</td>
			<td>Clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 BV421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343609</td>
			<td>561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38 PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303505</td>
			<td>Clone HIT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA PerCP/Cy5.5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304121</td>
			<td>Clone HI100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f PE/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313621</td>
			<td>Clone GoH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328113</td>
			<td>Clone 5E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 5 mL tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR plate, 384w, 130 &#181;L, F-bottom, TC, cover</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61965059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Flt3-Ligand, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-479</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78040.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (2.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78050.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TPO, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-095-752</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (12.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer 2.4</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12440061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>348701</td>
			<td>Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>#07861</td>
			<td>Used for Density gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in at Institute&#39;s facility. Commerically available PBS can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Antibiotic formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>56304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH800S Cell Sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM, 500mL</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mutational load and clonal composition of human blood

Les cellules hématopoïétiques de tige et d'ancêtre (HSPc) accumulent graduellement des mutations d'ADN pendant une durée de vie, qui peuvent contribuer aux maladies âge-associées telles que la leucémie. Caractériser l'accumulation de mutation peut améliorer la compréhension de l'étiologie des maladies liées à l'âge. Présenté ici est une méthode pour cataloguer les mutations somatiques dans les HSPC individuels, qui est basé sur le séquençage du génome entier (WGS) des cultures cellulaires primaires clonales. Les mutations présentes dans la cellule d'origine sont partagées par toutes les cellules de la culture clonale, tandis que les mutations acquises in vitro après le tri cellulaire sont présentes dans un sous-ensemble de cellules. Par conséquent, cette méthode permet une détection précise des mutations somatiques présentes dans les génomes des HSPC individuels, qui s'accumulent au cours de la vie. Ces catalogues de mutations somatiques peuvent fournir des informations précieuses sur les processus mutationnels actifs dans le tissu hématopoïétique et comment ces processus contribuent à la leukemogénèse. En outre, en évaluant les mutations somatiques qui sont partagées entre plusieurs HSPC de la même lignée individuelle, les relations de lignée clonaque et la dynamique de population des populations sanguines peuvent être déterminées. Comme cette approche repose sur l'expansion in vitro des cellules individuelles, la méthode est limitée aux cellules hématopoïétiques avec un potentiel réplicif suffisant.

Procédure expérimentale Le flux de travail expérimental est représenté dans la figure 1. En fonction du type de matériel d'entrée, différentes étapes doivent être suivies. Dans la figure 2, une sortie cytométrique d'écoulement d'une sorte de globule de cordon est représentée. Tout d'abord, toutes les cellules monocytiques sont sélectionnées en dessinant librement une porte autour de cette population. Ensuite, les singlets sont isolés en sélectionnant pour les cellules avec un rapport linéaire FSC-H/FSC-A, comme un rapport FSC-H/FSC-A inférieur inclut les doublets ou les amas cellulaires. L'échantillon de contrôle non taché est utilisé pour définir les portes de tri cellulaire pour la lignée-, CD34,CD38-, CD45RA-. De plus, les CD90 et cD49f peuvent être utilisés pour distinguer les cellules progénitrices des cellules souches auto-renouvelables17 (figure 2). Le tri d'index permet le retraçage des cellules individuelles, et les cellules triées sont représentées comme des points bruns. Pendant la culture cellulaire, les clones individuels peuvent se développer à un rythme différent, avec quelques clones se développant dans les 3 semaines, tandis que d'autres clones sont seulement entièrement étendus jusqu'à la cinquième semaine de culture. Voir figure 3A,B pour la croissance des colonies représentatives. Une image représentative est montrée d'une culture en vrac presque confluente de MSC à 11 jours après placage (figure 3C).
Vérification de la qualité après le séquençage et l'analyse des mutations Il s'agit d'un exemple de sortie de l'analyse du nombre de copies générée par Control-FreeC14 pour vérifier les modifications apportées au numéro de copie (figure 4). Les informations karyotypic peuvent indiquer quels chromosomes exclure pendant une course de SNVFI (étape 7.6). L'intrigue VAF créée par SNVFI (Figure 5) est un histogramme de fréquences d'allèle variables dans l'échantillon. Un pic dans la parcelle de densité à 0,5 indique que l'échantillon est clonal. Pour obtenir plus de perspicacité dans les causes biologiques sous-jacentes derrière les mutations, ceux-ci peuvent être analysés à l'aide du paquet R MutationalPatterns15. Illustré ici est une analyse typique produisant une parcelle de 96-trinucleotide (Figure 6). En plus de la quantification de différents types de mutation, l'extraction de signature peut également être effectuée avec cet outil.
Construction d'un arbre de lignée de développement Les mutations partagées entre clones ou présentes dans un clone (et à faible VAF) dans le contrôle des lignées germinales sont validées à l'aide d'IGV. Les mutations sont considérées comme vraies lorsqu'elles sont présentes dans l'échantillon et non à des niveaux élevés de VAF dans la lignée germinale (figure 7A). Les mutations sont considérées comme fausses lorsqu'elles ne sont pas présentes dans l'IGV, ce qui peut se produire dans des régions mal cartographiées (figure 7B). Dans d'autres cas, les événements détectés par SNVFI sont des mutations germinales manquées (Figure 7C). Le reséquençage indépendant des mutations par re-séquençage ciblé est fortement recommandé pour ces mutations dans les clones choisis.  Après détection de mutations somatiques partagées entre les clones, une matrice binaire est générée (étape 10.8). Une carte thermique est construite contenant des cellules avec et sans les mutations partagées A-M. Au-dessus de cette carte thermique, l'arbre de lignée développementale est indiqué (figure 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig1.jpg"> Figure 1 : Diagramme de flux représentant la procédure expérimentale basée sur le matériel d'entrée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig2.jpg"> Figure 2 : Stratégie de tri cellulaire. Tout d'abord, le gating est effectué sur de petites cellules mononucléaires. Deuxièmement, les cellules individuelles sont fermées par sélection de la fraction linéaire. Les cellules négatives de lignée sont fermées. Toutes les cellules CD34et CD38- CD45sont triées à une seule cellule. La fraction des cellules en brun doit être notée, qui sont les cellules triées mises en évidence par l'option «tri de l'index». <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig3.jpg"> Figure 3 : Résultats représentatifs de la culture cellulaire. Clones HSPC représentatifs dans une plaque de puits 384 à (A) 2 semaines après le placage et (B) 4 semaines après le placage. (C) Culture MSC après 2 semaines de remplacement moyen. Barre d'échelle de 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig4.jpg"> Figure 4 : Karyotypes. (A) Culture Clonal HSPC et (B) Échantillon en vrac MSC. Les karyotypes ont été déterminés par analyse de la lecture-profondeur. Les deux graphiques indiquent un échantillon karyotypiquement normal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig5.jpg"> Figure 5 : Histogramme des fréquences d'allèle de variante. Histogramme des fréquences d'allèle de variante des variantes dans un clone avant la dernière étape de filtrage de SNVFI (VAF ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' Un pic à VAF 0,5 indique que l'échantillon est clonal. Les mutations sous-clonales avec le BAS VAF sont exclues pendant l'étape de filtrage de SNVFI (VAF ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig6.jpg"> Figure 6 : Analyse représentative du spectre mutationnel des mutations somatiques dans un échantillon de HSPC. La contribution relative de chaque changement de trinucleotide (dont la base moyenne est mutée) au spectre total est représentée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig6large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig7.jpg"> Figure 7 : Inspection manuelle des mutations à l'aide de l'IGV16. (A) Les mutations sont considérées comme vraies lorsqu'elles sont présentes dans le clone et non dans l'échantillon en vrac. (B) Les mutations sont considérées comme de faux positifs lorsqu'elles sont présentes dans une région mal cartographiée. (C) Les mutations sont considérées comme de faux positifs lorsqu'elles sont présentes dans un contrôle de germline. La ligne verticale indique la position d'une mutation appelée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig7large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig8.jpg"> Figure 8 : Construction d'un arbre de lignée de développement. Un dendrogramme indique la séparation des lignées de développement pendant le développement. La carte thermique sous le dendrogramme indique la présence de mutations dans différents clones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig8large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood

Caractérisation de la charge mutationnelle et de la composition clonale du sang humain

Les modèles de mutation somatiques dans les cellules reflètent l'exposition mutagène précédente et peuvent indiquer des relations de lignée développementale. Présenté ici est une méthodologie pour cataloguer et analyser les mutations somatiques dans les cellules hématopoïétiques individuelles de tige et d'ancêtre.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) gradually accumulate DNA mutations during a lifespan, which can contribute to age-associated diseases such ...

Avec cette méthode, nous pouvons déterminer avec précision le nombre de mutations dans une seule cellule souche hématopoïétique. Ces mutations peuvent être utilisées pour déchiffrer les processus mutationnels et disséquer les lignées hématopoïétiques. Notre méthode évite l’utilisation de techniques d’amplification du génome entier en clonage des cellules souches hématopoïétiques in vitro, ce qui se traduit par des taux d’erreur plus faibles et des avantages d’analyse en aval.Les modèles mutationnels présents dans les génomes des cellules souches hématopoïétiques peuvent révéler les processus mutogènes et de réparation de l’ADN auxquels elles ont été exposées. Commencez cette procédure avec la préparation du matériel d’échantillon et la coloration telle que décrite dans le protocole de texte, puis préparez 25 millilitres de tige hématopoïétique et de cellules progénitrices, ou milieu de culture HSPC. Remplissez une culture cellulaire 384 bien plaque avec 75 microlitres de milieu de culture HSPC dans chaque puits.Pour éviter l’évaporation du milieu dans les puits extérieurs, remplissez les puits extérieurs de 75 microlitres d’eau stérile ou de PBS, et n’utilisez pas ces puits pour le tri cellulaire. Le tri correct des HSPCs de signal viables est l’étape la plus critique dans ce protocole. Placez des portes pour le tri HSPC basé sur un contrôle non taché dans 10 000 cellules de l’échantillon taché.Portez les cellules simples en dessinant une porte autour de la hauteur de dispersion avant linéaire par rapport à la fraction de zone de dispersion avant. Utilisez la fraction de commande non tachée pour dessiner une porte pour la fraction de lignée. Dessinez des barrières pour les cellules positives CD34 et caractérisez davantage ce sous-ensemble en fixant une porte spécifique pour les cellules négatives CD38, CD45RA négatives.Chargez la plaque de 384 puits sur le télécopieur et triez les cellules individuelles. S’il s’applique au télécopieur, basculez sur la possibilité de conserver les données de tri d’index pour permettre le retracage des cellules triées. Pour la culture ment triés HSCs, envelopper la plaque de culture de 384 puits avec couvercle dans un enveloppement transparent en polyéthylène.Transférer la plaque de 384 puits dans un incubateur humidifié de 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et la conserver dans l’incubateur pendant trois à quatre semaines jusqu’à ce que des clones visibles apparaissent. Après quatre semaines de culture, déterminez quels puits ont une confluence de 30 % ou plus. Pour chaque cône, préfillez des microtubes de 1,5 millilitre avec un millilitre de 1%BSA et PBS et étiquetez le tube selon le puits correspondant.Pré-mouiller une pointe pipette avec 1%BSA et PBS pour minimiser le nombre de cellules collant à la pointe pipette. Pipette vigoureusement le milieu de haut en bas au moins cinq fois tout en raclant le fond du puits avec la pipette de 200 microlitres réglée à 75 microlitres. Recueillir la suspension cellulaire dans le microtube étiqueté qui correspond au puits.Répétez la tuyautage dans le puits avec jusqu’à 75 microlitres de 1%BSA frais et PBS pour assurer une absorption maximale des cellules. Les cellules de culture clonally peuvent coller au fond du puits. Inspecter les puits à l’aide d’un microscope léger inversé standard pour s’assurer que toutes les cellules ont été recueillies.Si tous les puits dont la confluence est supérieure à 30 % ont été récoltés, remettre la plaque de 384 puits dans l’incubateur. Les cultures clonales peuvent proliférer jusqu’à cinq semaines. Faites tourner la suspension cellulaire pendant cinq minutes à 350 fois g.Une petite pastille doit être visible. Retirer soigneusement tous les microlitres du supernatant sauf environ. Les granulés cellulaires peuvent être congelés à moins 20 degrés Celsius et stockés pendant plusieurs mois avant l’isolement de l’ADN.Les mutations présentes dans les premières branches de la lignée seront également sous-clonally présentes dans l’échantillon en vrac. Les lignées de branchement ultérieures sont définies par des mutations partagées entre les HSPCs seulement. Pour identifier les mutations présentes dans un sous-ensemble de clones et de sous-vêtements présents en vrac, premier filtre pour les mutations somatiques partagées entre clones.Dans un terminal basé sur Unix, modifiez le filtersomatic. ne fichier pour régler les tapes et ajuster les autres paramètres. Exécutez le filtersomatic.pi script. Filtre pour les mutations qui sont sous-vêtements présents dans le volume en utilisant le vrac déterminer lowVAF. r script dans un terminal basé sur Unix.Cela générera des fichiers vcf distincts pour les variantes nucléotides uniques partagées et uniques. Déterminer toutes les mutations partagées entre les clones qui ne sont pas présents dans l’échantillon en vrac, en chevauchant toutes les positions de mutation. Exclure les faux positifs par inspection manuelle à l’aide d’Integrative Genomic Viewer, IGV abrégé.Les mutations sont considérées comme fausses lorsqu’elles ne sont pas présentes lorsque la mutation est présente dans la lignée germinale de tous les clones ou lorsqu’elles sont présentes dans des régions mal cartographiées. Les véritables mutations peuvent être partagées entre deux clones ou être sous-vêtements présents en vrac. Resequence tous les loci partagés indépendamment en utilisant le séquençage ciblé ou sanger.Utilisez les mutations partagées pour construire une table binaire de mutations par rapport aux clones séquencés, avec zéro indiquant que la mutation n’est pas présente et une indiquant la présence de la mutation. Sortie de la table binaire de mutation comme carte thermique avec un dendrogram indiquant les relations de lignée entre les cellules utilisant des fonctions basées sur R. La carte thermique indique l’état de mutation de chaque cellule.Montré comme exemple de sortie de l’analyse du numéro de copie générée par le contrôle trois c pour vérifier les modifications du numéro de copie. L’intrigue de fraction d’allèle variante créée par le filtrage unique de variante de nucléotide, est un histogramme des fréquences d’allèle de variante dans l’échantillon. Un pic de la parcelle de densité à 0,5 indique que l’échantillon est clonal.Représenté ici est une analyse des modèles mutationnels typiques produisant une parcelle de trinucléotide 96. En plus de la quantification de différents types de mutation, l’extraction de signature peut également être effectuée avec cet outil. Les mutations partagées entre clones ou présentes dans un clone dans le contrôle de la lignée germinale sont validées à l’aide d’IGV.Les mutations sont considérées comme vraies lorsqu’elles sont présentes dans l’échantillon et non à des niveaux élevés de fréquence des allèles dans la lignée germinale. Les mutations sont considérées comme fausses lorsqu’elles ne sont pas présentes dans l’IGV, ce qui peut se produire dans des régions mal cartographiées. Dans d’autres cas, les événements détectés par le filtrage unique de variante de nucléotide sont des variantes manquées de germline.Le reséquençage indépendant des mutations par reséquençage ciblé est fortement recommandé pour ces mutations chez certains clones. Après détection des mutations somatiques partagées entre les clones, une matrice binaire est générée, une carte thermique est construite contenant des cellules avec et sans les mutations partagées A à M.L’arbre de lignée développementale est indiqué. Comme prochaine étape pour la méta présentée ici, les processus mutationnels actifs dans les cellules souches hémopoïétiques peuvent être déterminés à l’aide de l’analyse de signature mutationnelle.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA Transfection et EMSA Analyses sur fraîchement isolés villosités cytotrophoblastes humaines

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Recherche

Génétique

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

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In Situ Étiquetage de l&#39; ADN mitochondrial de réplication chez la drosophile adulte Ovaires par EdU Coloration

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

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Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Déterminer le taux de décroissance de Genome-wide transcription dans les fibroblastes humains proliférantes et repos

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Perturbation de gène hautement efficace des cellules progénitrices hématopoïétiques murins et humains par CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolement, caractérisation et axée sur les micro-ARN de la Modification génétique des cellules souches humaines follicule dentaire

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identification des événements de recombinaison homologue dans les cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de transfert de Southern et la réaction en chaîne par polymérase

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Caractériser l’Histone modifications post-traductionnelles levure neurodégénératives Proteinopathy modèles

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Séquençage de l’ARNm de sang total à l’aide du séquençage NANOPORE

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Séquençage et analyse de l'ARN unicellulaire des îlots pancréatiques humains

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...