Name: characterizing mutational load and clonal composition of human blood
Uploaded: 2019-07-11T15:00:00
Duration: 7 min 58 s
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Diese Studie wurde durch ein VIDI-Stipendium der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) (Nr. 016.Vidi.171.023) an R. v. B. unterstützt.

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	<li>Osorio, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+Reveal+Lineage+Relationships+and+Age-Related+Mutagenesis+in+Human+Hematopoiesis.">Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis.</a> Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Hematopoiesis+and+Blood-Cancer+Risk+Inferred+from+Blood+DNA+Sequence.">Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Clonal+Hematopoiesis+Associated+with+Adverse+Outcomes.">Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).</li><li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+haematopoiesis+harbouring+AML-associated+mutations+is+ubiquitous+in+healthy+adults.">Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> Nature Communications. 7, 1-7 (2016).</li><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+Signatures+of+Mutational+Processes+Operative+in+Human+Cancer.">Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer.</a> Cell Reports. 3, 246-259 (2013).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500, 415-421 (2013).</li><li>Alexandrov, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Repertoire+of+Mutational+Signatures+in+Human+Cancer.">The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. 513, 422-425 (2014).</li><li>Blokzijl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mutation+accumulation+in+human+adult+stem+cells+during+life.">Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life.</a> Nature. 538, 260-264 (2016).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+Current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: Current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+identification+of+single-nucleotide+variants+in+whole-genome-amplified+single+cells.">Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells.</a> Nature Methods. 14, 491-493 (2017).</li><li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150, (2012).</li><li>Jager, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mutation+accumulation+in+single+human+adult+stem+cells+by+whole-genome+sequencing+of+organoid+cultures.">Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures.</a> Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).</li><li>Boeva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control-FREEC:+A+tool+for+assessing+copy+number+and+allelic+content+using+next-generation+sequencing+data.">Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data.</a> Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).</li><li>Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MutationalPatterns:+Comprehensive+genome-wide+analysis+of+mutational+processes.">MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes.</a> Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).</li><li>Thorvaldsd&#243;ttir, H., Robinson, J. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Genomics+Viewer+(IGV):+High-performance+genomics+data+visualization+and+exploration.">Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+human+hematopoietic+stem+cells+capable+of+long-term+multilineage+engraftment.">Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.</a> Science. , (2011).</li><li>Lee-Six, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+of+normal+human+blood+inferred+from+somatic+mutations.">Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations.</a> Nature. 561, 473-478 (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. , (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Hier wird eine Methode vorgestellt, um Mutationen zu erkennen, die sich während des Lebens in einzelnen HSPCs angesammelt haben, und um einen frühen Entwicklungslinienbaum mit diesen Mutationsdaten zu konstruieren.
Für eine erfolgreiche Durchführung dieser Tests müssen mehrere kritische Anforderungen erfüllt werden. Erstens muss die Lebensfähigkeit der Probe sichergestellt werden. Die schnelle Handhabung der Probe ist der Schlüssel, um die Effizienz des Verfahrens zu gewährleisten. Zweitens wird sich der Verlust der Wachstumsfaktor-Potenz negativ auf die klonale Expansion von HSPCs auswirken. Um eine hohe Wirksamkeit des Wachstumsfaktors zu gewährleisten, ist es wichtig, Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden und Einweg-Aliquots vorzubereiten. Drittens ist es nach der Durchführung von WGS, Mutationsaufruf und Filterung von entscheidender Bedeutung, die Klonalität der Klonkultur zu validieren. Um die Klonalität der Kultur zu bestätigen, sollte sich der VAF der Mutationen in einer karyotypischen normalen Probe um 0,5 gruppieren (Abbildung 3). In Zellen mit geringer Mutationslast, wie Zabelschnurblut-HSPCs, ist es aufgrund der geringen Mutationszahlen schwieriger, die Klonalität zu bestimmen.
Unser Ansatz beruht auf der In-vitro-Expansion einzelner Zellen, um WGS zu ermöglichen. Daher ist unser Ansatz auf Zellen beschränkt, die das replikierende Potenzial haben, klonal zu erweitern, z. B. HSPCs. In unseren Händen sind etwa 5%-30% aller einsortierten Zellen in der Lage, sich angemessen auszudehnen. Reduzierte Auswuchsraten können möglicherweise zu einer Auswahlverzerrung führen. Wie bereits erläutert, können Methoden, die WGA verwenden, diese Selektionsverzerrung überwinden, da diese Technik nicht auf der Erweiterung von Zellen beruht. Allerdings hat WGA seine eigenen Mängel, und die klonale Amplifikation bleibt die einzige Methode, um die Anzahl der Mutationen im gesamten Genom ohne Allelic-Aussetzer und gleiche Abdeckung entlang des Genoms genau zu bestimmen, insbesondere in Proben mit niedrigem Mutationszahlen.
Die mit diesem Ansatz generierten Daten können verwendet werden, um Phylogenitäten des hämatopoetischen Systems zu bestimmen, da die in einzelnen Zellen erkannten Mutationen verwendet werden können, um Zelllinien zu sezieren, wie in Abbildung 6dargestellt. In der Regel können ein oder zwei Mutationen jeden Zweig in einem gesunden Spender definieren1. Da Linien früh nach der Empfängnis verzweigen, werden Mutationen, die diese ersten Zweige definieren, auch mit einem niedrigen VAF in der übereinstimmenden normalen Probe vorhanden sein, die zum Filtern der Keimbahnvarianten1,18,19verwendet wurde. In diesem Fall wird die Verwendung von nicht-hämatopoetischen Zellen, wie MSCs, bevorzugt, da erwartet wird, dass sie sich sehr früh während der Entwicklung vom hämatopoetischen System trennen. Da T-Zellen hämatopoetischen Ursprungs sind, könnte die Verwendung dieser Zellen als abgestimmte normale Probe zum Filtern von Keimbahnvarianten daher die Konstruktion der frühesten Verzweigung des Entwicklungslinienbaums verwirren. Das subklonale Vorhandensein von astspezifischen Mutationen in bestimmten reifen Blutpopulationen, die durch gezielte tiefe Sequenzierung gemessen werden können, wird darauf hindeuten, dass die Nachkommen dieses Zweigs zu diesem reifen Zelltyp führen kann. Darüber hinaus ermöglicht unser Ansatz die Bewertung der mutationsischen Folgen einer mutagenen Exposition in vivo und letztlich, wie dies zur Entwicklung der Leukämie beitragen kann.

Die Exposition hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) gegenüber endogenen oder extrinsischen mutagenen mutagenen erbgutverändernden Quellen trägt zur allmählichen Ansammlung von Mutationen in der DNA während einer Lebensdauer1bei. Die allmähliche Mutationsakkumulation in HSPCs1 kann zu altersbedingter klonaler Hämatopoese (ARCH)2,3führen, was ein nicht symptomatischer Zustand ist, der von HSPCs angetrieben wird, die Leukämie-Treibermutationen tragen. Anfangs wurde angenommen, dass Personen mit ARCH ein erhöhtes Risiko für Leukämie haben2,3. Jedoch, neuere Studien haben gezeigt, dass eine Inzidenz von 95% der ARCH bei älteren Menschen4, so dass die Assoziation mit bösartigenErkrankungen weniger klar und wirft die Frage, warum einige Personen mit ARCH schließlich tun oder nicht entwickeln Malignitäten. Dennoch können somatische Mutationen in HSPCs ernste Gesundheitsrisiken darstellen, da myelodysplastische Störungen und Leukämie durch das Vorhandensein spezifischer Krebstreibermutationen gekennzeichnet sind.
Um die Mutationsprozesse zu identifizieren und die Klonalität des Blutes zu untersuchen, muss die Mutationsakkumulation in einzelnen HSPCs charakterisiert werden. Mutationsprozesse hinterlassen charakteristische Muster im Genom, sogenannte Mutationssignaturen, die in genomweiten Mutationssammlungen identifiziert und quantifiziert werden können5. Zum Beispiel wurden die Exposition gegenüber UV-Licht, Alkylierungsmitteln und Defekten in DNA-Reparaturwegen jeweils mit einer anderen Mutationssignatur in Verbindung gebracht6,7. Darüber hinaus sind aufgrund der stochastischen Natur von Mutationsakkumulationen die meisten (wenn nicht alle) der erworbenen Mutationen zwischen den Zellen einzigartig. Wenn Mutationen zwischen mehreren Zellen desselben Individuums geteilt werden, bedeutet dies, dass diese Zellen einen gemeinsamen Vorfahr e. Werthaben 8. Daher können durch die Bewertung gemeinsamer Mutationen Linienbeziehungen zwischen Zellen bestimmt werden, und ein Entwicklungslinienbaum kann verzweigt nach Zweig enzaust erstellt werden. Die Katalogisierung seltener somatischer Mutationen in physiologisch normalen Zellen ist jedoch aufgrund der polyklonalen Natur gesunder Gewebe technisch eine Herausforderung.
Hier wird eine Methode vorgestellt, um somatische Mutationen in den Genomen einzelner HSPCs genau zu identifizieren und zu bestimmen. Dies beinhaltet die Isolierung und klonale Expansion von HSPCs in vitro. Diese klonalen Kulturen spiegeln die genetische Zusammensetzung der ursprünglichen Zelle wider (d. h., Mutationen in der ursprünglichen Zelle werden von allen anderen Zellen in der Kultur geteilt). Dieser Ansatz ermöglicht es uns, genügend DNA für die gesamte Genomsequenzierung (WGS) zu erhalten. Wir haben bereits gezeigt, dass Mutationen, die sich in vitro während der klonalen Kultur angesammelt haben, von einer Teilmenge von Zellen geteilt werden. Dies ermöglicht die Filterung aller In-vitro-Mutationen, da diese in einem kleineren Bruchteil der Lesevorgänge im Vergleich zu in vivo erworbenen Mutationen9vorhanden sein werden. Frühere Methoden haben ausreichende DNA aus einer einzelzelle für WGS mit Vollgenom-Amplifikation (WGA)10erhalten. Der Hauptnachteil von WGA ist jedoch seine relativ fehleranfällige und unausgewogene Verstärkung des Genoms, die zu Allele-Aussetzern führen kann11. Da dieser Ansatz jedoch auf der In-vitro-Expansion einzelner Zellen beruht, ist er auf Blutzellen mit ausreichendem replizitivem Potenzial beschränkt, was bei WGA-abhängigen Methoden nicht der Fall ist. Frühere Bemühungen, klonale Kulturen zu sequenzieren, haben sich auf die Verwendung von Feederschichten verlassen, um die klonale Verstärkung einzelner HSPCs zu gewährleisten12. DNA aus den Feederschichten kann jedoch potenziell die DNA der Klonkulturen kontaminieren und die anschließende Mutationsaufruf und -filterung verwirren. Die hier vorgestellte Methode beruht ausschließlich auf spezifizierten Datenträgern, um einzelne HSPCs klonal zu erweitern, und vermeidet somit das Problem der DNA-Kontamination. Bisher haben wir diese Methode erfolgreich auf menschliches Knochenmark, Nabelschnurblut, viably gefrorenes Knochenmark und peripheres Blut angewendet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.20 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Syringe, Luer lock</td>
			<td>BD</td>
			<td>613-3925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301603</td>
			<td>Clone 3.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302005</td>
			<td>Clone 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 BV650</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300467</td>
			<td>Clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 BV421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343609</td>
			<td>561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38 PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303505</td>
			<td>Clone HIT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA PerCP/Cy5.5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304121</td>
			<td>Clone HI100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f PE/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313621</td>
			<td>Clone GoH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328113</td>
			<td>Clone 5E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 5 mL tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR plate, 384w, 130 &#181;L, F-bottom, TC, cover</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61965059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Flt3-Ligand, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-479</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78040.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (2.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78050.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TPO, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-095-752</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (12.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer 2.4</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12440061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>348701</td>
			<td>Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>#07861</td>
			<td>Used for Density gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in at Institute&#39;s facility. Commerically available PBS can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Antibiotic formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>56304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH800S Cell Sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM, 500mL</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mutational load and clonal composition of human blood

Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) akkumulieren während einer Lebensdauer allmählich DNA-Mutationen, die zu altersassoziierten Krankheiten wie Leukämie beitragen können. Die Charakterisierung der Mutationsakkumulation kann das Verständnis der Ätiologie altersassoziierter Krankheiten verbessern. Hier wird eine Methode vorgestellt, um somatische Mutationen in einzelnen HSPCs zu katalogisieren, die auf der Ganzgenomsequenzierung (WGS) klonaler Primärzellkulturen basiert. Mutationen, die in der ursprünglichen Zelle vorhanden sind, werden von allen Zellen in der Klonkultur geteilt, während Mutationen, die in vitro nach der Zellsortierung erworben wurden, in einer Teilmenge von Zellen vorhanden sind. Daher ermöglicht diese Methode den genauen Nachweis somatischer Mutationen in den Genomen einzelner HSPCs, die sich im Laufe des Lebens ansammeln. Diese Kataloge somatischer Mutationen können wertvolle Einblicke in mutationsaktive Mutationsprozesse im hämatopoetischen Gewebe liefern und wie diese Prozesse zur Leukemogenese beitragen. Darüber hinaus können durch die Bewertung somatischer Mutationen, die zwischen mehreren HSPCs desselben Individuums geteilt werden, klonale Abstammungsbeziehungen und populationsische Dynamiken von Blutpopulationen bestimmt werden. Da dieser Ansatz auf der In-vitro-Expansion einzelner Zellen beruht, ist die Methode auf hämatopoetische Zellen mit ausreichendem replizierendem Potenzial beschränkt.

Experimentelles Verfahren Der experimentelle Workflow ist in Abbildung 1dargestellt. Je nach Art des Eingabematerials müssen verschiedene Schritte befolgt werden. In Abbildung 2 wird eine zytometrische Durchflussausgabe einer Nabelschnurblutzellsortierung dargestellt. Erstens werden alle monozytäre Zellen ausgewählt, indem lose ein Tor um diese Population gezeichnet wird. Dann werden Singlets isoliert, indem für Zellen mit einem linearen FSC-H/FSC-A-Verhältnis ausgewählt wird, da ein niedrigeres FSC-H/FSC-A-Verhältnis Doublets oder Zellklumpen enthält. Das unbefleckte Steuerbeispiel wird verwendet, um Zellsortierungsgates für Abstammung-, CD34+, CD38-, CD45RA-zu definieren. Zusätzlich können CD90 und CD49f verwendet werden, um zwischen Vorläuferzellen oder sich selbst erneuernden Stammzellen17 (Abbildung 2) zu unterscheiden. Die Indexsortierung ermöglicht die Nachverfolgung einzelner Zellen, und die sortierten Zellen werden als braune Punkte dargestellt. Während der Zellkultur können sich einzelne Klone in einem anderen Tempo ausdehnen, wobei sich einige Klone innerhalb von 3 Wochen ausdehnen, während andere Klone nur bis zur fünften Kulturwoche vollständig erweitert werden. Siehe Abbildung 3A,B für repräsentatives Koloniewachstum. Ein repräsentatives Bild einer nahezu konfluenten MSC-Massenkultur wird 11 Tage nach der Beschichtung gezeigt (Abbildung 3C).
Qualitätsprüfung nach Sequenzierung und Mutationsanalyse Gezeigt wird eine Beispielausgabe der von Control-FreeC14 generierten Kopiernummernanalyse, um nach Änderungen der Kopiernummer zu suchen (Abbildung 4). Karyotypische Informationen können angeben, welche Chromosomen während eines SNVFI-Laufs ausgeschlossen werden sollen (Schritt 7.6). Das von SNVFI erstellte VAF-Diagramm (Abbildung 5) ist ein Histogramm variantenr Allelfrequenzen in der Probe. Ein Spitzenwert im Dichtediagramm bei 0,5 gibt an, dass die Probe klonal ist. Um mehr Einblick in die zugrunde liegenden biologischen Ursachen hinter Mutationen zu erhalten, können diese mit dem R-Paket MutationalPatterns15analysiert werden. Hier ist eine typische Analyse dargestellt, die eine 96-Trinukleotid-Diagramm erzeugt (Abbildung 6). Neben der Quantifizierung verschiedener Mutationstypen kann mit diesem Werkzeug auch die Signaturextraktion durchgeführt werden.
Bau eines Entwicklungsstammbaums Mutationen, die unter Klonen geteilt werden oder in einem Klon (und bei niedrigem VAF) in der Keimbahnkontrolle vorhanden sind, werden mit IGV validiert. Mutationen gelten als wahr, wenn sie in der Probe vorhanden sind, und nicht bei hohen VAF-Werten in der Keimbahn (Abbildung 7A). Mutationen gelten als falsch, wenn sie in der IGV nicht vorhanden sind, was in schlecht zugeordneten Regionen auftreten kann (Abbildung 7B). In anderen Fällen sind von SNVFI entdeckte Ereignisse verpasste Keimbahnmutationen (Abbildung 7C). Für diese Mutationen in ausgewählten Klonen wird eine unabhängige Neusequenzierung von Mutationen durch gezielte Re-Sequenzierung empfohlen.  Nach dem Nachweis gemeinsamer somatischer Mutationen zwischen Klonen wird eine binäre Matrix erzeugt (Schritt 10.8). Eine Heatmap wird mit Zellen mit und ohne die gemeinsamen Mutationen A-M erstellt. Oberhalb dieser Heatmap ist der Entwicklungslinienbaum angegeben (Abbildung 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig1.jpg"> Abbildung 1: Flussdiagramm, das experimentelle Verfahren auf der Grundlage von Eingabematerial darstellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig2.jpg"> Abbildung 2: Zellsortierungsstrategie. Zunächst wird das Gating an kleinen mononukleären Zellen durchgeführt. Zweitens werden einzelne Zellen durch Auswahl des linearen Bruchs abgegrenzt. Liniennegative Zellen sind abgegrenzt. Alle CD34+ CD38- CD45- Zellen sind einzelzellensortiert. Der Anteil der Zellen in Braun sollte beachtet werden, d. h. die sortierten Zellen, die durch die Option "Indexsortierung" hervorgehoben werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig3.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative Zellkulturergebnisse. Repräsentative HSPC-Klone in einer 384-Well-Platte bei (A) 2 Wochen nach der Beschichtung und (B) 4 Wochen nach der Beschichtung. (C) MSC-Kultur nach 2 Wochen mittlerer Ersetzung. Skalenbalken = 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig4.jpg"> Abbildung 4: Karyotypen. (A) Klonale HSPC-Kultur und (B) MSC-Massenstichprobe. Die Karyotypen wurden durch Lesetiefenanalyse bestimmt. Beide Graphen weisen auf eine karyotypische normale Probe hin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig5.jpg"> Abbildung 5: Histogramm der Variantenallelefrequenzen. Histogramm der Variantenallelefrequenzen der Varianten in einem Klon vor dem letzten Filterschritt von SNVFI (VAF >0.3). Ein Peak bei VAF = 0,5 gibt an, dass die Probe klonal ist. Die subklonalen Mutationen mit niedrigem VAF werden beim letzten Filterschritt von SNVFI (VAF >0.3) ausgeschlossen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig6.jpg"> Abbildung 6: Repräsentative Mutationsspektrumanalyse somatischer Mutationen in einer HSPC-Probe. Dargestellt wird der relative Beitrag jeder Trinukleotid-Änderung (von der die mittlere Basis mutiert ist) zum Gesamtspektrum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig7.jpg"> Abbildung 7: Manuelle Inspektion von Mutationen mit IGV16. (A) Mutationen gelten als wahr, wenn sie im Klon und nicht in der Massenprobe vorhanden sind. (B) Mutationen werden als falsch positive Werte betrachtet, wenn sie in einer schlecht zugeordneten Region vorhanden sind. (C) Mutationen werden als falsch positive Werte betrachtet, wenn sie in einer Keimbahnkontrolle vorhanden sind. Die vertikale Linie gibt die Position einer aufgerufenen Mutation an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig8.jpg"> Abbildung 8: Bau eines Entwicklungsstammbaums. Dargestellt ist ein Dendrogramm, das auf entwicklungsfördernde Linien hinweist, die sich während der Entwicklung abspalten. Die Heatmap unter dem Dendrogramm zeigt das Vorhandensein von Mutationen in verschiedenen Klonen an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood

Charakterisierung der Mutationslast und der klonalen Zusammensetzung des menschlichen Blutes

Somatische Mutationsmuster in Zellen spiegeln die vorherige mutagene Exposition wider und können Entwicklungslinienbeziehungen aufzeigen. Hier wird eine Methodik zum Katalogisieren und Analysieren somatischer Mutationen in einzelnen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen vorgestellt.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) gradually accumulate DNA mutations during a lifespan, which can contribute to age-associated diseases such ...

Mit dieser Methode können wir die Anzahl der Mutationen in einer einzelnen hämatopoetischen Stammzelle genau bestimmen. Diese Mutationen können verwendet werden, um Mutationsprozesse zu entschlüsseln und hämatopoetische Linien zu sezieren. Unsere Methode vermeidet den Einsatz von Vollgenom-Amplifikationstechniken durch Klonen der hämatopoetischen Stammzellen in vitro, was zu niedrigeren Fehlerraten führt und eine nachgelagerte Analyse begünstigt.Die Mutationsmuster in den Genomen hämatopoetischer Stammzellen können die mutagenen und DNA-Reparaturprozesse aufdecken, denen sie ausgesetzt waren. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung von Probenmaterial und Färbung, wie im Textprotokoll beschrieben, und bereiten Sie dann 25 Milliliter hämatopoetischen Stamm und Vorläuferzelle oder HSPC-Kulturmedium vor. Füllen Sie eine Zellkultur 384 Well-Platte mit 75 Mikroliter HSPC Kulturmedium in jedem Brunnen.Um eine Verdunstung des Mediums in den äußeren Brunnen zu verhindern, füllen Sie die äußeren Brunnen mit 75 Mikroliter sterilem Wasser oder PBS und verwenden Sie diese Brunnen nicht für die Zellsortierung. Die korrekte Sortierung von hSPCs für lebensfähige Signale ist der wichtigste Schritt in diesem Protokoll. Stellen Sie Tore für die HSPC-Sortierung auf der Grundlage einer ungefärbten Steuerung in 10.000 Zellen aus der gebeizten Probe ein.Beorchen Sie einzelne Zellen, indem Sie ein Tor um die lineare Vorwärtsstreuhöhe im Vergleich zum Punktierbereich nach vorne zeichnen. Verwenden Sie die ungefärbte Kontrollfraktion, um ein Tor für die Abstammungsfraktion zu zeichnen. Zeichnen Sie Tore für CD34-positive Zellen und charakterisieren Sie diese Teilmenge weiter, indem Sie ein bestimmtes Gate für CD38-negative CD45RA-Negativzellen setzen.Laden Sie die 384-Well-Platte auf das Faxgerät und sortieren Sie einzelne Zellen. Wenn für das Faxgerät anwendbar, schalten Sie die Option zum Beibehalten von Indexsortierdaten ein, um die Rückverfolgung der sortierten Zellen zu ermöglichen. Um singart sortierte HSCs zu kulturieren, wickeln Sie die 384-Well-Kulturplatte mit Deckel in transparente Polyethylenfolie.Übertragen Sie die 384-Well-Platte auf einen befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator mit 5% Kohlendioxid und halten Sie sie drei bis vier Wochen im Inkubator, bis sichtbare Klone erscheinen. Bestimmen Sie nach vier Wochen Kultivierung, welche Brunnen eine Konfluenz von 30% oder höher haben. Für jeden Kegel 1,5 Milliliter Mikroröhren mit einem Milliliter 1%BSA und PBS vorfüllen und das Rohr entsprechend dem entsprechenden Brunnen beschriften.Vorbefeuchten einer Pipettenspitze mit 1%BSA und PBS, um die Anzahl der Zellen zu minimieren, die an der Pipettenspitze kleben. Das Medium mindestens fünfmal kräftig nach oben und unten pipette, während der Boden des Brunnens mit der 200-Mikroliter-Pipette auf 75 Mikroliter abkratzt wird. Sammeln Sie die Zellsuspension in der beschrifteten Mikroröhre, die dem Brunnen entspricht.Wiederholen Sie die Pipettierung im Brunnen mit bis zu 75 Mikrolitern frischer 1%BSA und PBS, um eine maximale Aufnahme der Zellen zu gewährleisten. Klonal kultivierte Zellen können am Boden des Brunnens kleben. Prüfen Sie die Brunnen mit einem standardierten, invertierten Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt wurden.Wenn alle Brunnen mit mehr als 30% Konfluenz geerntet wurden, legen Sie die 384-Well-Platte wieder in den Inkubator. Klonkulturen können sich bis zu fünf Wochen lang ausbreiten. Drehen Sie die Zellsuspension für fünf Minuten bei 350 mal g.Ein kleines Pellet sollte sichtbar sein. Entfernen Sie vorsichtig alle bis auf etwa fünf Mikroliter des Überstandes. Zellpellets können bei minus 20 Grad Celsius eingefroren und mehrere Monate vor der DNA-Isolierung gelagert werden.Mutationen, die in den ersten Zweigen der Abstammung vorhanden sind, werden auch subklonal in der Massenprobe vorhanden sein. Spätere Verzweigungslinien werden durch Mutationen definiert, die nur von HSPCs gemeinsam genutzt werden. Um Mutationen zu identifizieren, die in einer Teilmenge der Klone vorhanden sind und subklonierend in der Masse vorhanden sind, filtert zuerst somatische Mutationen, die zwischen Klonen gemeinsam genutzt werden.Bearbeiten Sie in einem Unix-basierten Terminal die Filtersomatik. ne-Datei, um die Pats einzustellen und die anderen Parameter anzupassen. Führen Sie die Filtersomatik aus.pi-Skript. Filter für Mutationen, die subklonaly in der Masse vorhanden sind, mit der bestimmen lowVAF Masse. r-Skript in einem Unix-basierten Terminal.Dadurch werden separate vcf-Dateien für gemeinsam genutzte und eindeutige Single-Nukleotid-Varianten generiert. Bestimmen Sie alle Mutationen, die von Klonen gemeinsam genutzt werden, die nicht in der Massenstichprobe vorhanden sind, indem Sie alle Mutationspositionen überlappen. Schließen Sie falsche Positivmeldungen durch manuelle Inspektion mit Integrative Genomic Viewer, abgekürzt IGV, aus.Mutationen gelten als falsch, wenn sie nicht vorhanden sind, wenn die Mutation in allen Klonen in der Keimbahn vorhanden ist oder wenn sie in schlecht kartierten Regionen vorhanden sind. Wahre Mutationen können zwischen zwei Klonen geteilt werden oder subkloniert in der Masse vorhanden sein. Resequence alle freigegebenen loci unabhängig mit gezielten oder Sanger-Sequenzierung.Verwenden Sie die freigegebenen Mutationen, um eine binäre Tabelle von Mutationen im Vergleich zu sequenzierten Klonen zu erstellen, wobei Null darauf hinweist, dass die Mutation nicht vorhanden ist, und eine, die auf das Vorhandensein der Mutation hinweist. Geben Sie die Mutationsbinärtabelle als Heatmap zusammen mit einem Dendrogramm aus, das Linienbeziehungen zwischen Zellen mit R-basierten Funktionen angibt. Die Heatmap zeigt den Mutationsstatus für jede Zelle an.Als Beispielausgabe der Kopiernummernanalyse, die von Steuerelement drei c generiert wurde, um nach Änderungen der Kopiernummer zu suchen. Die Variante Allelfraktionsdiagramm, das durch einzelne Nukleotid-Variantenfilterung erzeugt wird, ist ein Histogramm der Variantenallelfrequenzen in der Probe. Ein Spitzenwert im Dichtediagramm bei 0,5 gibt an, dass die Probe klonal ist.Hier ist eine typische Mutationsmusteranalyse dargestellt, die eine 96 Trinukleotid-Diagramm produziert. Neben der Quantifizierung verschiedener Mutationstypen kann mit diesem Werkzeug auch die Signaturextraktion durchgeführt werden. Mutationen, die unter Klonen geteilt werden oder in einem Klon in der Keimbahnkontrolle vorhanden sind, werden mit IGV validiert.Mutationen gelten als wahr, wenn sie in der Probe vorhanden sind und nicht bei hohen Varianten-Allel-Frequenzen in der Keimbahn. Mutationen gelten als falsch, wenn sie in der IGV nicht vorhanden sind, was in schlecht kartierten Regionen geschehen kann. In anderen Fällen werden Ereignisse, die durch die Filterung einzelner Nukleotid-Varianten erkannt werden, Keimbahnvarianten übersehen.Für diese Mutationen in ausgewählten Klonen wird eine unabhängige Resequenzierung von Mutationen durch gezielte Resequenzierung empfohlen. Nach dem Nachweis gemeinsamer somatischer Mutationen zwischen Klonen wird eine binäre Matrix erzeugt, eine Heatmap wird erstellt, die Zellen mit und ohne die gemeinsamen Mutationen A bis M enthält. Als nächster Schritt für das hier vorgestellte Meta können Mutationsprozesse, die in hämopoetischen Stammzellen aktiv sind, mittels mutationaler Signaturanalyse bestimmt werden.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA-Transfektion und EMSA-Analysen auf frisch isolierten menschlichen Villöse Cytotrophoblasten

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Forschung

Genetik

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling der mitochondrialen DNA - Replikation in Drosophila Adult Ovarien von EdU Anfärben

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Gepoolte ShRNA Bildschirm für die Reaktivierung des MeCP2 auf dem inaktiven X-Chromosom

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Bestimmung genomweite Transkript Verfall Tarife im wuchernden und ruhenden menschlichen Fibroblasten

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolierung, Charakterisierung und RNA-basierte gentechnische Veränderung von menschlichen Dental follikelstimulierendes Stammzellen

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikation der homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern Blotting und Polymerase-Kettenreaktion

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Charakterisierung von Histon Post-translationale Modifikation Veränderungen in Hefe Neurodegenerative Proteinopathy Modelle

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequenzierung von mRNA aus Vollblut mit Nanopore-Sequenzierung

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Einzellige RNA-Sequenzierung und Analyse menschlicher Pankreas-Inseln

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...