Name: characterizing mutational load and clonal composition of human blood
Uploaded: 2019-07-11T15:00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood at JoVE.com

מחקר זה היה נתמך על ידי מענק VIDI של הארגון הולנד למחקר מדעי (NWO) (no 016. Vidi. 171.023) כדי R. v. B.

<ol>
	<li>Osorio, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+Reveal+Lineage+Relationships+and+Age-Related+Mutagenesis+in+Human+Hematopoiesis.">Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis.</a> Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Hematopoiesis+and+Blood-Cancer+Risk+Inferred+from+Blood+DNA+Sequence.">Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Clonal+Hematopoiesis+Associated+with+Adverse+Outcomes.">Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).</li><li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+haematopoiesis+harbouring+AML-associated+mutations+is+ubiquitous+in+healthy+adults.">Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> Nature Communications. 7, 1-7 (2016).</li><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+Signatures+of+Mutational+Processes+Operative+in+Human+Cancer.">Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer.</a> Cell Reports. 3, 246-259 (2013).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500, 415-421 (2013).</li><li>Alexandrov, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Repertoire+of+Mutational+Signatures+in+Human+Cancer.">The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. 513, 422-425 (2014).</li><li>Blokzijl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mutation+accumulation+in+human+adult+stem+cells+during+life.">Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life.</a> Nature. 538, 260-264 (2016).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+Current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: Current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+identification+of+single-nucleotide+variants+in+whole-genome-amplified+single+cells.">Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells.</a> Nature Methods. 14, 491-493 (2017).</li><li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150, (2012).</li><li>Jager, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mutation+accumulation+in+single+human+adult+stem+cells+by+whole-genome+sequencing+of+organoid+cultures.">Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures.</a> Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).</li><li>Boeva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control-FREEC:+A+tool+for+assessing+copy+number+and+allelic+content+using+next-generation+sequencing+data.">Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data.</a> Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).</li><li>Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MutationalPatterns:+Comprehensive+genome-wide+analysis+of+mutational+processes.">MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes.</a> Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).</li><li>Thorvaldsd&#243;ttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Genomics+Viewer+(IGV):+High-performance+genomics+data+visualization+and+exploration.">Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+human+hematopoietic+stem+cells+capable+of+long-term+multilineage+engraftment.">Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.</a> Science. , (2011).</li><li>Lee-Six, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+of+normal+human+blood+inferred+from+somatic+mutations.">Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations.</a> Nature. 561, 473-478 (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. , (2014).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

מוצג כאן היא שיטה לזהות מוטציות שהצטברו במהלך החיים HSPCs הפרט לבנות עץ השושלת התפתחותית מוקדם באמצעות נתונים אלה מוטציה.
יש להכיר מספר דרישות קריטיות כדי לבצע בהצלחה את התנאים הבאים. ראשית, יש להבטיח את הכדאיות של המדגם. טיפול מהיר של המדגם הוא המפתח כדי להבטיח את יעילות ההליך. שנית, אובדן העוצמה של גורם הגדילה ישפיע לרעה על התפשטות השבטים של HSPCs. כדי להבטיח עוצמת גידול גבוהה הצמיחה, חשוב למנוע הקפאת ההפשרה מחזורים ולהכין מחזורי שימוש יחיד. שלישית, לאחר ביצוע WGS, קורא מוטציה וסינון, זה חיוני כדי לאמת את הclonality של תרבות המשובטים. כדי לאשר את הclonality של התרבות, VAF של המוטציות צריך אשכול סביב 0.5 ב karyotypically דרך כלל מדגם רגיל (איור 3). בתאים עם עומס מיתר נמוך, כגון HSPCs דם טבורי, קשה יותר לקבוע הclonality בשל מספרים מוטציה נמוכה.
הגישה שלנו מסתמכת על התרחבות מבחנה של תאים בודדים כדי לאפשר WGS. לכן, הגישה שלנו מוגבלת לתאים בעלי הפוטנציאל הclonally להתרחב, כגון HSPCs. בידינו, כ-5%-30% מכלל התאים הממוינים בודדים מסוגלים להתרחב כראוי. שיעורי גדילה מופחתים עלולים לגרום להטיה בחירה. כפי שהוזכר קודם לכן, שיטות המשתמשות ב-WGA יכולות להתגבר על הטיית בחירה זו, כאשר טכניקה זו אינה נשענת על התרחבות התאים. עם זאת, WGA יש חסרונות משלו, והגברה שבטיים נשאר השיטה היחידה כדי לקבוע במדויק את מספר המוטציות בגנום כולו ללא allelic מתלהבים וכיסוי שווה לאורך הגנום, במיוחד בדגימות עם סומאטיק אמיתי נמוך . מספרי מוטציה
הנתונים שנוצרו באמצעות גישה זו ניתן להשתמש כדי לקבוע phylogenies של המערכת המטטית, כמו המוטציות שזוהו בתאים בודדים ניתן להשתמש כדי לנתח את התאים בזמן, כפי שמתואר באיור 6. בדרך כלל, מוטציות אחת או שתיים יכולות להגדיר כל ענף בתורם בריא1. מאז הענף ליננות מוקדם לאחר ההתעברות, מוטציות המגדירות ענפים אלה הראשון יהיה גם נוכח vaf נמוכה במדגם רגיל בהתאמה ששימש לסינון משתני germline1,18,19. במקרה זה, השימוש בתאים שאינם המטבטיים, כגון MSCs, הם מועדפים כפי שהם צפויים להפריד מוקדם מאוד במהלך הפיתוח של המערכת המטתית. כמו T-תאים הם של מוצא המטמית, השימוש בתאים אלה כמדגם נורמלי תואם לסנן משתני germline יכול אפוא לבלבל את הבנייה של הסתעפות המוקדם בעץ השושלת ההתפתחותית. נוכחות תת-שבטיים של מוטציות ספציפיות לענף באוכלוסיות דם בוגרות מסוימות, אשר ניתן למדוד על ידי רצף ממוקד עמוק, יציין כי צאצאי הענף הזה יכול להצמיח את סוג התא הבוגר. בנוסף, הגישה שלנו מאפשרת להעריך את ההשלכות המוטלות של חשיפה מוטרית בvivo ובסופו של דבר כיצד זה עשוי לתרום להתפתחות לוקמיה.

חשיפת תאים גזע המטפאות ומחולל קדמון (HSPCs) כדי אנדודוגני או מקורות מוטאריים חיצוניים תורמת להצטברות הדרגתית של מוטציות ב-DNA במהלך תוחלת חיים1. הצטברות מוטציה הדרגתית ב hspcs1 יכול לגרום לגיל שבטיים הקשור המטפיאה (ARCH)2,3, שהוא מצב שאינו סימפטומטי מונע על ידי הנושאים hspcs נושאת לוקמיה-מוטציות הנהג. בתחילה, הוא חשב כי אנשים עם קשת יש סיכון מוגבר עבור לוקמיה2,3. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו שכיחות של 95% של קשת באנשים קשישים4, מה שהופך את הקשר עם ממאירות פחות ברור להעלות את השאלה למה אנשים מסוימים עם ARCH בסופו של דבר לעשות או לא לפתח ממאירות. עם זאת, מוטציות סומטיים ב HSPCs יכול להוות סיכונים בריאותיים רציניים, כמו הפרעות מיאלואידית ולוקמיה מאופיינים על ידי נוכחות של מוטציות ספציפיות של מנהלי התקן סרטן.
כדי לזהות את תהליכי הזיהוי והקלאליות של דם לימוד, הצטברות מוטציה ב-HSPCs הפרט צריך להיות מאופיין. תהליכי הדפוס משאירים דפוסים אופייניים בגנום, כביכול חתימות מודמות, שניתן לזהות ולכמת באוספי הגנום הרחב של מוטציות5. למשל, חשיפה לאור אולטרא סגול, סוכני al, ופגמים במסלולי תיקון DNA יש כל אחד נקשר עם חתימת מוסיקה שונה6,7. בנוסף, בשל האופי הסטוכסטי של צטברויות מוטציה, רוב (אם לא כולם) של המוטציות הנרכשים הם ייחודיים בין התאים. אם מוטציות משותפות בין תאים מרובים של אותו אדם, הוא מציין כי תאים אלה חולקים אבקדמון משותף. לכן, על-ידי הערכת מוטציות משותפות, ניתן לקבוע קשרי שושלת היוחסין בין תאים לבין עץ השושלת ההתפתחותי ניתן לבנות ענף בענף. עם זאת, קיטלוג מוטציות סומאליות נדירות בתאים מבחינה פיזיולוגית הוא מאתגר באופן טכני בשל הטבע polyclonal בטים של רקמות בריאות.
המוצג כאן הוא שיטה לזהות במדויק ולקבוע מוטציות סומטיים בתוך הגנום של HSPCs הפרט. זה כולל את הבידוד ואת התפשטות המשובטים של HSPCs ב מבחנה. תרבויות אלה שבטים לשקף את האיפור הגנטי של התא המקורי (כלומר, מוטציות בתא המקורי יהיה משותף על ידי כל התאים האחרים בתרבות). גישה זו מאפשרת לנו להשיג די. אן. איי עבור רצף הגנום השלם (WGS). הצגנו בעבר כי מוטציות שהצטברו בתוך מבחנה במהלך תרבות שבטיים ישותפו על ידי קבוצת משנה של תאים. זה מאפשר סינון של כל מוטציות חוץ גופית, כמו אלה יהיה נוכח חלק קטן יותר של קריאות לעומת vivo רכשה מוטציות9. שיטות קודמות השיגו די. אן. איי מתא אחד עבור WGS באמצעות הגברה שלמה של הגנום (WGA)10. עם זאת, החיסרון העיקרי של WGA הוא הגברה שגיאה יחסית מועדת ובלתי מאוזנת של הגנום, אשר יכול לגרום לאלה מתלהבים האלה11. עם זאת, כאשר גישה זו מסתמכת על התרחבות מבחנה של תאים בודדים, היא מוגבלת לתאי דם עם פוטנציאל replicative שאינו המקרה עבור שיטות התלויות ב-WGA. מאמצים קודמים ברצף תרבויות המשובטים הסתמך על שימוש בשכבות ממזין כדי להבטיח הגברה של השבטים של HSPCs12. עם זאת, ה-DNA מן השכבות ממזין יכול לזהם את ה-DNA של תרבויות המשובטים, הקמת הקורא מוטציה לאחר מכן סינון. השיטה המוצגת כאן מסתמכת אך ורק על בינוני שצוין כדי clonally להרחיב HSPCs בודד, ולכן נמנע את הנושא של זיהום DNA. עד עכשיו, יש לנו בהצלחה להחיל את השיטה הזאת על מח עצם אנושי, דם טבורי, מח עצם קפוא למדי, דם היקפי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.20 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Syringe, Luer lock</td>
			<td>BD</td>
			<td>613-3925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301603</td>
			<td>Clone 3.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302005</td>
			<td>Clone 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 BV650</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300467</td>
			<td>Clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 BV421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343609</td>
			<td>561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38 PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303505</td>
			<td>Clone HIT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA PerCP/Cy5.5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304121</td>
			<td>Clone HI100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f PE/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313621</td>
			<td>Clone GoH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328113</td>
			<td>Clone 5E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 5 mL tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR plate, 384w, 130 &#181;L, F-bottom, TC, cover</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61965059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Flt3-Ligand, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-479</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78040.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (2.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78050.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TPO, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-095-752</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (12.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer 2.4</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12440061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>348701</td>
			<td>Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>#07861</td>
			<td>Used for Density gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in at Institute&#39;s facility. Commerically available PBS can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Antibiotic formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>56304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH800S Cell Sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM, 500mL</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mutational load and clonal composition of human blood

גזע המטפאות ומחולל הזרע (HSPCs) בהדרגה לצבור מוטציות DNA במהלך תוחלת חיים, אשר יכול לתרום לגיל הקשורים מחלות כגון לוקמיה. אפיון הצטברות מוטציה יכול לשפר את ההבנה של האטיולוגיה של מחלות הקשורות לגיל. הציגו כאן היא שיטה לקטלג מוטציות סומטיים ב-HSPCs הפרט, אשר מבוסס על רצף הגנום השלם (WGS) של תרביות תאים שבטיים הראשי. מוטציות הקיימות בתא המקורי משותפות על ידי כל התאים בתרבות המשובטים, בעוד מוטציות שנרכשו בחוץ לאחר מיון התא נמצאים בקבוצת משנה של תאים. לכן, שיטה זו מאפשרת זיהוי מדויק של מוטציות סומטיים נוכח הגנום של HSPCs הפרט, אשר מצטברים במהלך החיים. הקטלוגים הללו של מוטציות סומטיים יכולים לספק תובנות יקרות לתהליכי ממוגרפיה הפעילים ברקמות המטפאות וכיצד תהליכים אלה תורמים ללוקבגנזה. בנוסף, על ידי הערכת מוטציות סומטיים המשותפים בין HSPCs מרובים של אותו אדם, יחסי השושלת השיבטיים והדינמיקה האוכלוסין של אוכלוסיות דם ניתן לקבוע. כאשר גישה זו נשענת על התרחבות מבחנה של תאים בודדים, השיטה מוגבלת לתאים המטבטיים עם פוטנציאל replicative מספיק.

הליך ניסיוני זרימת העבודה הניסיונית מתוארת באיור 1. בהתבסס על סוג חומר הקלט, יש לעקוב אחר צעדים שונים. באיור 2 הפלט של cytometric הזרימה של מיון תא דם טבורי מתוארת. ראשית, כל התאים המונלוציטיים נבחרים על ידי ציור רופף של שער סביב האוכלוסיה. לאחר מכן, מבודדים באמצעות בחירה עבור תאים בעלי היחס FSC-H/FSC ליניארי-a/fsc-היחס הנמוך ביותר כולל כdoublets או גושי תאים. דגימת השליטה הבלתי מוכתמת משמשת להגדרת שערי מיון תאים לשושלת היוחסין-, CD34+, CD38-, CD45RA-. בנוסף, CD90 ו-CD49f יכולים לשמש כדי להבדיל בין תאים מחולל קדמון או בתאי גזע מחדש17 (איור 2). מיון אינדקס מאפשר את המעקב מחדש של תאים בודדים, והתאים הממוינים מתוארים כנקודות חום. במהלך תרבות התא, שיבוטים בודדים יכולים להתרחב בקצב שונה, עם כמה שיבוטים הרחבת בתוך 3 שבועות, בעוד שיבוטים אחרים מורחבים רק עד השבוע החמישי של התרבות. ראה איור 3 א, B לגידול מושבה ייצוגית. תמונה ייצוגית מוצגת על התרבות הגורפת של MSC כמעט שוטפת ב -11 ימים לאחר ציפוי (איור 3C).
בדיקת איכות לאחר קביעת רצף וניתוח מוטציה מוצג הוא פלט דוגמה של ניתוח מספרי ההעתקה שנוצר על-ידי Control-FreeC14 כדי לבדוק אם יש שינויים במספר העותקים (איור 4). המידע karyotypic יכול לציין אילו כרומוזומים לא לכלול במהלך הפעלה SNVFI (שלב 7.6). העלילה vaf שנוצר על ידי snvfi (איור 5) היא היסטוגרמה של תדרים אלל variant במדגם. שיא במגרש הצפיפות ב 0.5 מציין כי המדגם הוא שבטים. כדי לקבל תובנה נוספת על הגורמים הביולוגיים הבסיסיים מאחורי מוטציות, ניתן לנתח את אלה באמצעות חבילת R מערכת הדפוס15. מתוארים כאן הוא ניתוח טיפוסי הפקת מגרש 96-trinucleotide גאות (איור 6). בנוסף לכמת של סוגי מוטציה שונים, מיצוי החתימה יכול להתבצע גם עם כלי זה.
בניית עץ השושלת ההתפתחותי מוטציות משותפות בין שיבוטים או להציג בשכפול (ו-VAF נמוכה) בפקד germline מאומתים באמצעות IGV. מוטציות נחשבות נכון כאשר נוכח במדגם ולא ברמות VAF גבוה ב-germline (איור 7A). מוטציות נחשבות false כאשר לא נמצאים ב IGV, אשר יכול לקרות באזורים ממופים גרוע (איור 7B). במקרים אחרים, אירועים שזוהו על ידי SNVFI הם החמיץ מוטציות germline (איור 7C). הרצף מחדש עצמאי של מוטציות על ידי ממוקדות רצף מחדש הוא מומלץ מאוד עבור מוטציות אלה במשובטים שנבחרו.  לאחר גילוי של מוטציות סומטיים משותפות בין שיבוטים, מטריצה בינארית נוצרת (שלב 10.8). מפת חום בנויה המכילה תאים עם ובלי מוטציות משותפות A-M. מעל מפת החום הזאת מצוין עץ היוחסין ההתפתחותי (איור 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig1.jpg"> איור 1: תרשים זרימה המתאר הליך ניסיוני המבוסס על חומר קלט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig2.jpg"> איור 2: אסטרטגיית מיון התא. ראשית, השידור מבוצע. על תאים קטנים וברורים שנית, תאים בודדים מגודרת על-ידי בחירה של השבר הליניארי. תאים שליליים בשושלת היוחסין מגודרת. כל CD34+ CD38- CD45- תאים ממוינים בתא בודד. יש לציין את חלקיק התאים בחום, שהם התאים הממוינים המסומנים באפשרות "מיון אינדקס". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig3.jpg"> איור 3: תוצאות תרבות התא הנציג. נציג HSPC שיבוטים ב 384 צלחת באר ב (א) 2 שבועות לאחר ציפוי ו (ב) 4 שבועות לאחר ציפוי. (ג) MSC תרבות לאחר שבועיים של מחליף בינוני. סרגל קנה מידה = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig4.jpg"> איור 4: Karyotypes. (א) תרבות השבטיים ו-(ב) MSC דוגמה גורפת. הקריוטיפוסים נקבעו על ידי ניתוח עומק לקריאה. שני הגרפים מצביעים על. דגימה נורמלית בדרך כלל <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig5.jpg"> איור 5: היסטוגרמה של תדרי אלל של variant. היסטוגרמה של תדרים אלל של variant של המשתנים בשכפול לפני שלב הסינון האחרון של snvfi (vaf > 0.3). שיא ב-VAF = 0.5 מציין שהמדגם הוא שבטים. המוטציות התת-שבטיים עם VAF נמוכה אינן נכללות במהלך הסינון האחרון של SNVFI (VAF > 0.3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig6.jpg"> איור 6: ניתוח הספקטרום הייצוגי של מוטציות סומטיים במדגם HSPC. מתוארת היא התרומה היחסית של כל שינוי של כל טריאוקלאואלי (שעליו מוטציה הבסיס האמצעי) לספקטרום הכולל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig7.jpg"> איור 7: בדיקה ידנית של מוטציות באמצעות IGV16. (א) מוטציות נחשבות לאמיתיות כאשר הן נמצאות בשכפול ולא במדגם הצובר. (ב) מוטציות נחשבות כתוצאות חיוביות שקריות כשהן קיימות באזור שמופה בצורה גרועה. (ג) מוטציות נחשבות כתוצאות חיוביות שגויות כאשר הם נוכחים בפקד germline. הקו האנכי מציין את מיקומו של מוטציה שנקראה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig8.jpg"> איור 8: בניית עץ השושלת ההתפתחותי. מתוארת היא שהיא בעלת העצים המעידים על התפתחות בזמן הפיתוח. מפת החום מתחת לגודגרמה מצביעה על נוכחות של מוטציות במשובטים שונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood at JoVE.com

Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood

אפיון מטען והרכב שבטים של דם אנושי

דפוסי המוטציה הסומטיים בתאים משקפים חשיפה מוטרית קודמת ויכולים לחשוף קשרים התפתחותיים של השושלת. המוצג כאן הוא מתודולוגיה לקטלג ולנתח מוטציות סומטיות בתאי גזע ומחולל המטפאות בודדים.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) gradually accumulate DNA mutations during a lifespan, which can contribute to age-associated diseases such ...

בשיטה זו, אנו יכולים לקבוע במדויק את מספר המוטציות בתא גזע hematopoietic יחיד. מוטציות אלה יכולות לשמש לפענוח תהליכים מוטציה ולניתחו שושלת hematopoietic. השיטה שלנו נמנעת משימוש בטכניקות הגברה של גנום שלם על ידי שיבוט תאי הגזע המטופויטיים במבחנה, מה שתוותו שיעורי שגיאה נמוכים יותר והטבות ניתוח במורד הזרם.הדפוסים המוטציה הקיימים בגנומים של תאי גזע hematopoietic יכול לחשוף את mutagenic ואת תהליכי תיקון DNA שאליו הם נחשפו. התחל הליך זה עם הכנת חומר מדגם וכתמים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, ולאחר מכן להכין 25 מיליליטר של גזע hematopoietic ותא אביה, או מדיום תרבות HSPC. מלאו תרבות תאים 384 היטב צלחת עם 75 microliters של תרבות HSPC בינוני בכל באר.כדי למנוע אידוי של המדיום בארות החיצוניות, למלא את הבארים החיצוניות עם 75 microliters של מים סטריליים או PBS, ולא להשתמש בארות אלה למיון תאים. מיון נכון של HSPCs של אותות בני קיימא הוא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה. הגדר שערים עבור מיון HSPC בהתבסס על פקד לא מוכתם ב- 10,000 תאים מהדגימה המוכתמת.שער תאים בודדים על ידי ציור שער סביב גובה פיזור ליניארי קדימה לעומת שבר שטח פיזור קדימה. השתמש בשבר הבקרה שאינו נגוע כדי לצייר שער עבור שבר השושלת. צייר שערים עבור תאים חיוביים CD34 ואפיין עוד יותר קבוצת משנה זו על-ידי הגדרת שער ספציפי עבור CD38 שלילי, CD45RA תאים שליליים.טען את לוחית ה- 384 בארות במכונת הפקס ומיין תאים בודדים. אם הדבר ישים עבור מכשיר הפקס, החלף מצב באפשרות לשמור על נתוני מיון אינדקס כדי לאפשר חזרה של התאים ממוינים. לתרבות HSCs ממוינים בנפרד, לעטוף את צלחת התרבות 384 באר עם מכסה לעטוף פוליאתילן שקוף.מעבירים את צלחת ה-384 היטב לחה 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ולשמור אותו באינקובטור במשך שלושה עד ארבעה שבועות עד שיבוטים גלויים מופיעים. לאחר ארבעה שבועות של פולחן, לקבוע אילו בארות יש confluency של 30% ומעלה. עבור כל חרוט, לפני מילוי 1.5 microtubes מיליליטר עם מיליליטר אחד של 1%BSA ו PBS ולתייג את הצינור על פי הבאר המתאימה.הרטבה מראש של קצה פיפטה עם 1%BSA ו- PBS כדי למזער את מספר התאים הנדבקים לקצה הפיפיט. במרץ pipette את המדיום למעלה ולמטה לפחות חמש פעמים תוך גירוד החלק התחתון של באר עם פיפטה 200 microliter להגדיר על 75 microliters. לאסוף את ההשעיה התא microtube שכותרתו שמתאים ל הבאר.חזרו על צינורות באר עם עד 75 מיקרוליטרים של 1%BSA ו-PBS טריים כדי להבטיח ספיגה מקסימלית של תאים. תאים מתורבתים קלונליים יכולים להידבק לתחתית באר. בדוק את בארות באמצעות מיקרוסקופ אור סטנדרטי, הפוך כדי להבטיח אם כל התאים נאספו.אם נקצרו כל הבארים עם יותר מ־30%, חזרו לאנקובטור 384 בארות. תרבויות שיבוט יכול להתרבות עד חמישה שבועות. סובב את ההשעיה של התא לחמש דקות ב-350 פעמים.גלולה קטנה צריכה להיות גלויה. הסר בזהירות את כל המיקרוליטרים מלבד חמישה מיקרוליטרים של העל-טבעי. כדורי תא ניתן להקפיא במינוס 20 מעלות צלזיוס ומאוחסן במשך מספר חודשים לפני בידוד DNA.מוטציות הקיימות בענפים הראשונים של שושלת היוחסין יהיו גם הן קיימות באופן תת-קלוני בדגימה בתפזורת. שושלת הסתעפות מאוחרת יותר מוגדרת על-ידי מוטציות המשותפות בין HSPCs בלבד. כדי לזהות מוטציות הקיימות בתת-קבוצה של השיבוטים ותת-קטגוריות הקיימות בתפזורת, מסנן תחילה למוטציות סומטיות המשותפות לשיבוטים.במסוף מבוסס Unix, ערוך את הסינוןסומטי. ne כדי להגדיר את טפיחות ולהתאים את הפרמטרים האחרים. הפעל את המסנניםסומטיים.פאי סקריפט. סנן עבור מוטציות הקיימות בתת-קטגוריה בצובר באמצעות קביעת נפח lowVAF. r סקריפט במסוף מבוסס יוניקס.פעולה זו תיצור קבצי VCF נפרדים עבור וריאנטים משותפים וייחודיים של נוקלאוטיד יחיד. קבע את כל המוטציות המשותפות בין שיבוטים שאינם קיימים בדגימה בתפזורת, על-ידי חפיפה של כל תנוחות המוטציה. אל תכלול תוצאות חיוביות שגויות על-ידי בדיקה ידנית באמצעות מציג גנומי אינטגרטיבי, IGV מקוצר.מוטציות נחשבות שקריות כאשר המוטציה קיימת בנבט בכל השיבוטים או כאשר היא קיימת באזורים ממופים בצורה גרועה. מוטציות אמיתיות יכולות להיות משותפות בין שני שיבוטים או להיות נוכחות בתת-קטגוריה בכמויות גדולות. הסר את כל הלוצ'י המשותף באופן עצמאי באמצעות רצף ממוקד או רצף סנגר.השתמש במוטציות המשותפות כדי לבנות טבלה בינארית של מוטציות לעומת שיבוטים רצפים, כאשר אפס מצביע על כך שהמוטציה אינה קיימת ואחד המציין נוכחות של המוטציה. פלט הטבלה הבינארית של המוטציה כמפת חום יחד עם דנדרוגרמה המציינת קשרי שושלת בין תאים באמצעות פונקציות מבוססות R. מפת החום מציינת מצב מוטציה עבור כל תא.מוצג כפלט לדוגמה של ניתוח מספר ההעתקה שנוצר על-ידי פקד 3 c כדי לבדוק אם קיימים שינויים במספרי ההעתקה. עלילת שבר אלל הגרסה שנוצרה על-ידי סינון משתנה נוקלאוטייד יחיד, היא היסטוגרמה של תדרי אלל משתנים בדגימה. שיא בחלקת הצפיפות ב-0.5 מצביע על כך שהדגימה משובשת.מתואר כאן הוא ניתוח דפוסים מוטציה טיפוסי לייצר עלילה trinucleotide 96. בנוסף לכימות של סוגי מוטציות שונים, מיצוי חתימה יכול להתבצע גם עם כלי זה. מוטציות המשותפות בין שיבוטים או נוכחות בשיבוט בבקרת הנבט מאומתות באמצעות IGV.מוטציות נחשבות נכונות כאשר הן קיימות בדגימה ולא ברמות גבוהות של תדר אלל בחיידק. מוטציות נחשבות שקריות כאשר אינן קיימות ב- IGV, דבר שיכול לקרות באזורים ממופים בצורה גרועה. במקרים אחרים, אירועים שזוהו על ידי סינון משתנה נוקלאוטיד יחיד הם גרסאות נבטים שלא נענו.resequencing עצמאי של מוטציות על ידי resequencing ממוקד מומלץ מאוד עבור מוטציות אלה שיבוטים נבחרים. לאחר גילוי מוטציות סומטיות משותפות בין שיבוטים, נוצרת מטריצה בינארית, נבנית מפת חום המכילה תאים עם וללא המוטציות המשותפות A דרך M.The עץ השושלת ההתפתחותי מצוין. כשלד הבא עבור המטה המוצג כאן, ניתן לקבוע תהליכים מוטציה הפעילים בתאי גזע המופויטיים באמצעות ניתוח חתימות מוטציה.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

ניתוח Transfection siRNA ו Emsa על Cytotrophoblasts Villous אדם המבודד טרי

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

באתרו תיוג של דנ&quot;א מיטוכונדריאלי שכפול תסיסנית למבוגרים השחלות ידי edu מכתים

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

במאגר shRNA מסך עבור הפעלה מחדש של MeCP2 על כרומוזום X לא פעיל

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

קביעת הגנום כולו התעתיק הניוון ב Fibroblasts האדם מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

בידוד, אפיון, ההנדסה הגנטית מבוסס-MicroRNA, בתאי גזע אנושיים זקיק שיניים

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

זיהוי של אירועי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג הדרומי ואת תגובת שרשרת פולימראזית

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

אפיון שינויים Post-translational שינוי היסטון במודלים ניווניות Proteinopathy שמרים

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

רצף של mRNA מתוך דם שלם באמצעות רצפי Nanopore

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

תא בודד RNA רצף וניתוח של איי הלבלב האנושי

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...