Name: characterizing mutational load and clonal composition of human blood
Uploaded: 2019-07-11T15:00:00
Duration: 7 min 58 s
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इस अध्ययन के एक VIDI वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (NWO) (no. 016.Vidi.171.023) के लिए आर वी बी के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

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	<li>Osorio, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+Reveal+Lineage+Relationships+and+Age-Related+Mutagenesis+in+Human+Hematopoiesis.">Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis.</a> Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Hematopoiesis+and+Blood-Cancer+Risk+Inferred+from+Blood+DNA+Sequence.">Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Clonal+Hematopoiesis+Associated+with+Adverse+Outcomes.">Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).</li><li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+haematopoiesis+harbouring+AML-associated+mutations+is+ubiquitous+in+healthy+adults.">Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> Nature Communications. 7, 1-7 (2016).</li><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+Signatures+of+Mutational+Processes+Operative+in+Human+Cancer.">Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer.</a> Cell Reports. 3, 246-259 (2013).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500, 415-421 (2013).</li><li>Alexandrov, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Repertoire+of+Mutational+Signatures+in+Human+Cancer.">The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. 513, 422-425 (2014).</li><li>Blokzijl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mutation+accumulation+in+human+adult+stem+cells+during+life.">Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life.</a> Nature. 538, 260-264 (2016).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+Current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: Current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+identification+of+single-nucleotide+variants+in+whole-genome-amplified+single+cells.">Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells.</a> Nature Methods. 14, 491-493 (2017).</li><li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150, (2012).</li><li>Jager, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mutation+accumulation+in+single+human+adult+stem+cells+by+whole-genome+sequencing+of+organoid+cultures.">Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures.</a> Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).</li><li>Boeva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control-FREEC:+A+tool+for+assessing+copy+number+and+allelic+content+using+next-generation+sequencing+data.">Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data.</a> Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).</li><li>Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MutationalPatterns:+Comprehensive+genome-wide+analysis+of+mutational+processes.">MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes.</a> Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).</li><li>Thorvaldsd&#243;ttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Genomics+Viewer+(IGV):+High-performance+genomics+data+visualization+and+exploration.">Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+human+hematopoietic+stem+cells+capable+of+long-term+multilineage+engraftment.">Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.</a> Science. , (2011).</li><li>Lee-Six, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+of+normal+human+blood+inferred+from+somatic+mutations.">Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations.</a> Nature. 561, 473-478 (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. , (2014).</li></ol>

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

यहाँ प्रस्तुत उत्परिवर्तनों कि व्यक्तिगत HSPCs में जीवन के दौरान जमा का पता लगाने के लिए और इन उत्परिवर्तन डेटा का उपयोग कर एक प्रारंभिक विकासवंशी पेड़ का निर्माण करने के लिए एक विधि है.
कई महत्वपूर्ण आवश्यकताओं को पूरा किया जाना चाहिए ताकि सफलतापूर्वक इन परख प्रदर्शन करने के लिए. सबसे पहले, नमूने की व्यवहार्यता सुनिश्चित की जानी चाहिए। नमूना की त्वरित हैंडलिंग प्रक्रिया की दक्षता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। दूसरा, विकास कारक शक्ति की हानि नकारात्मक HSPCs के क्लोनल विस्तार को प्रभावित करेगा. उच्च विकास कारक शक्ति सुनिश्चित करने के लिए, फ्रीज-थॉव चक्र से बचने और एकल-उपयोग एलिकोट्स तैयार करना महत्वपूर्ण है। तीसरा, WGS प्रदर्शन करने के बाद, उत्परिवर्तन बुला और छानने, यह क्लोनल संस्कृति की clonality मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है. संस्कृति की क्लोनता की पुष्टि करने के लिए, उत्परिवर्तनों के VAF एक karyopetically सामान्य नमूने में 0.5 के आसपास क्लस्टर चाहिए (चित्र 3). एक कम उत्परिवर्तन लोड के साथ कोशिकाओं में, इस तरह की गर्भनाल रक्त HSPCs के रूप में, यह कम उत्परिवर्तन संख्या के कारण clonality निर्धारित करने के लिए और अधिक कठिन है.
हमारे दृष्टिकोण WGS के लिए अनुमति देने के लिए एकल कोशिकाओं के इन विट्रो विस्तार पर निर्भर करता है. इसलिए, हमारा दृष्टिकोण क्लोनी विस्तृत करने के लिए प्रतिकृति क्षमता है जो कक्षों के लिए प्रतिबंधित है, जैसे HSPCs. हमारे हाथों में, सभी एकल-सॉर्ट किए गए कोशिकाओं के बारे में 5%-30% पर्याप्त रूप से विस्तार करने में सक्षम हैं। कम वृद्धि दर संभावित एक चयन पूर्वाग्रह में परिणाम कर सकते हैं. जैसा कि पहले चर्चा की, WGA का उपयोग करने वाले तरीके इस चयन पूर्वाग्रह को दूर कर सकते हैं क्योंकि यह तकनीक कोशिकाओं के विस्तार पर निर्भर नहीं करती है। हालांकि, WGA अपनी कमियों है, और क्लोनल प्रवर्धन सही allelic dropouts और जीनोम के साथ बराबर कवरेज के बिना पूरे जीनोम में उत्परिवर्तनों की संख्या का निर्धारण करने के लिए एकमात्र तरीका रहता है, विशेष रूप से कम सच somatic के साथ नमूनों में उत्परिवर्तन संख्या.
इस प्रकिया का उपयोग करके उत्पन्न किए गए डेटा का उपयोग हीमाटोपोइटिक प्रणाली के जातिजनों का निर्धारण करने के लिए किया जा सकता है, क्योंकि एकल कोशिकाओं में पाए गए उत्परिवर्तनों का उपयोग कोशिका वंशों को विभाजित करने के लिए किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 6में दर्शाया गया है। आमतौर पर, एक या दो उत्परिवर्तनों एक स्वस्थ दाता1में प्रत्येक शाखा को परिभाषित कर सकते हैं. चूंकि वंशाधान के तुरंत बाद , इन पहली शाखाओं को परिभाषित करने वाले उत्परिवर्तन भी मेल-मिलाप वाले सामान्य नमूने में कम VAF के साथ उपस्थित होंगे जिसका उपयोग जर्मलाइन प्रकार1,18,19को छानने के लिए किया जाता था . इस मामले में, एमएससी जैसे गैर-हेमाटोपोइटिक कोशिकाओं का उपयोग पसंद किया जाता है क्योंकि हेमेटोपोएटिक प्रणाली से विकास के दौरान बहुत जल्दी अलग होने की उम्मीद की जाती है। चूंकि टी-कोशिकाएं हीमाटोपोएटिक मूल की हैं, इसलिए इन कोशिकाओं का उपयोग एक मेल सामान्य नमूने के रूप में germline वेरिएंट को फ़िल्टर करने के लिए किया जाता है इसलिए विकासवंशी पेड़ की जल्द से जल्द शाखाओं के निर्माण को भ्रमित कर सकता है। कुछ परिपक्व रक्त आबादी में शाखा-विशिष्ट उत्परिवर्तनों की अवतल उपस्थिति, जिसे लक्षित गहरी अनुक्रमण द्वारा मापा जा सकता है, यह संकेत देगा कि उस शाखा की संतति उस परिपक्व कोशिका प्रकार को जन्म दे सकती है। इसके अलावा, हमारे दृष्टिकोण विवो में mutagenic जोखिम के उत्परिवर्तन परिणामों का आकलन करने के लिए अनुमति देता है और अंत में यह ल्यूकेमिया विकास के लिए योगदान कर सकते हैं कि कैसे.

अंतर्जात या बाह्य म्यूटेजेनिक स्रोतों के लिए हेमेटोपोएटिक स्टेम और संतति कोशिकाओं (एचपीएससी) का एक्सपोजर जीवनकालके दौरान डीएनए में उत्परिवर्तनों के क्रमिक संचय में योगदान देता है। HSPCs1 में क्रमिक उत्परिवर्तन संचय उम्र से संबंधित clonal hematopoiesis (ARCH)2,3,जो एक गैर-प्रतीक स्थिति ल्यूकेमिया-ड्राइवर उत्परिवर्तनले जाने के HSPCs द्वारा संचालित है में परिणाम कर सकते हैं। शुरू में, यह सोचा गया था कि ARCH के साथ व्यक्तियों ल्यूकेमिया2,3के लिए एक बढ़ा जोखिम है. हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है 95% ARCH के बुजुर्ग व्यक्तियों में4, द्रोह के साथ सहयोग कम स्पष्ट बनाने और क्यों ARCH के साथ कुछ व्यक्तियों अंततः करते हैं या द्रोह का विकास नहीं करते का सवाल उठा. फिर भी, HSPCs में दैहिक उत्परिवर्तन गंभीर स्वास्थ्य जोखिम पैदा कर सकते हैं, के रूप में myelodysplastic विकारों और ल्यूकेमिया विशिष्ट कैंसर चालक उत्परिवर्तनों की उपस्थिति की विशेषता है.
उत्परिवर्तन प्रक्रियाओं की पहचान करने और रक्त क्लोनिलिटी का अध्ययन करने के लिए, व्यक्तिगत HSPCs में उत्परिवर्तन संचय की विशेषता की जरूरत है. उत्परिवर्तनीय प्रक्रियाएं जीनोम में विशिष्ट पैटर्न छोड़ देती हैं, तथाकथित उत्परिवर्तनात्मक हस्ताक्षर, जिन्हें पहचाना जा सकता है और उत्परिवर्तनों के जीनोम-व्यापी संग्रह ों में मात्रा निर्धारित की जा सकतीहै। उदाहरण के लिए, यूवी प्रकाश, alkylating एजेंटों के संपर्क में, और डीएनए की मरम्मत रास्ते में दोष प्रत्येक एक अलग उत्परिवर्तन हस्ताक्षर6,7के साथ जुड़ा हुआ है. इसके अलावा, उत्परिवर्तन संचय के stochastic प्रकृति के कारण, अधिग्रहीत उत्परिवर्तनों के सबसे (यदि सभी नहीं) कोशिकाओं के बीच अद्वितीय हैं. यदि एक ही व्यक्ति की अनेक कोशिकाओं के बीच उत्परिवर्तनों को साझा किया जाता है, तो यह इंगित करता है कि ये कोशिकाएं एक सामान्य पूर्वज8हैं। इसलिए, साझा उत्परिवर्तनों का आकलन करके, कोशिकाओं के बीच वंश संबंधों का निर्धारण किया जा सकता है और शाखा द्वारा एक विकासात्मक वंश के पेड़ का निर्माण किया जा सकता है। हालांकि, शारीरिक रूप से सामान्य कोशिकाओं में दुर्लभ दैहिक उत्परिवर्तनों को सूचीबद्ध करना स्वस्थ ऊतकों की पॉलीक्लोनल प्रकृति के कारण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है।
यहाँ प्रस्तुत सही पहचान और व्यक्तिगत HSPCs के जीनोम में दैहिक उत्परिवर्तनों का निर्धारण करने के लिए एक विधि है. यह इन विट्रो में HSPCs के अलगाव और क्लोनल विस्तार शामिल है. इन क्लोनल संस्कृतियों मूल सेल के आनुवंशिक मेकअप को प्रतिबिंबित (यानी, मूल सेल में उत्परिवर्तन संस्कृति में अन्य सभी कोशिकाओं द्वारा साझा किया जाएगा). यह दृष्टिकोण हमें पूरे जीनोम अनुक्रमण (WGS) के लिए पर्याप्त डीएनए प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है. हम पहले से पता चला है कि क्लोनल संस्कृति के दौरान इन विट्रो में जमा उत्परिवर्तन कोशिकाओं के एक सबसेट द्वारा साझा किया जाएगा. यह इन विट्रो उत्परिवर्तनों में सभी को फ़िल्टर करने में सक्षम बनाता है, क्योंकि ये विवो अर्जित उत्परिवर्तनों9की तुलना में रीड के एक छोटे अंश में मौजूद होंगे। पिछले तरीकों पूरे जीनोम प्रवर्धन (WGA)10का उपयोग कर WGS के लिए एक एकल कोशिका से पर्याप्त डीएनए प्राप्त किया है. हालांकि, WGA का मुख्य नुकसान जीनोम के अपने अपेक्षाकृत त्रुटि प्रवण और असंतुलित प्रवर्धन है, जो allele dropouts11में परिणाम कर सकते हैं. बहरहाल, के रूप में इस दृष्टिकोण एकल कोशिकाओं के इन विट्रो विस्तार पर निर्भर करता है, यह पर्याप्त प्रतिकृति क्षमता है, जो WGA निर्भर तरीकों के लिए मामला नहीं है के साथ रक्त कोशिकाओं तक ही सीमित है. इससे पहले के प्रयासों अनुक्रमण क्लोनल संस्कृतियों फीडर परतों का उपयोग करने पर भरोसा किया है एकल HSPCs12के क्लोनल प्रवर्धन सुनिश्चित करने के लिए . हालांकि, फीडर परतों से डीएनए संभावित क्लोनल संस्कृतियों के डीएनए दूषित कर सकते हैं, बाद में उत्परिवर्तन बुला और छानने confounding. यहाँ प्रस्तुत विधि पूरी तरह से क्लोन एकल HSPCs का विस्तार करने के लिए निर्दिष्ट माध्यम पर निर्भर करता है, और इसलिए डीएनए संदूषण के मुद्दे से बचा जाता है. अब तक, हम सफलतापूर्वक मानव अस्थि मज्जा पर इस विधि लागू किया है, गर्भनाल रक्त, viably जमे हुए अस्थि मज्जा, और परिधीय रक्त.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.20 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Syringe, Luer lock</td>
			<td>BD</td>
			<td>613-3925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301603</td>
			<td>Clone 3.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302005</td>
			<td>Clone 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 BV650</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300467</td>
			<td>Clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 BV421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343609</td>
			<td>561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38 PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303505</td>
			<td>Clone HIT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA PerCP/Cy5.5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304121</td>
			<td>Clone HI100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f PE/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313621</td>
			<td>Clone GoH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328113</td>
			<td>Clone 5E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 5 mL tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR plate, 384w, 130 &#181;L, F-bottom, TC, cover</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61965059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Flt3-Ligand, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-479</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78040.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (2.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78050.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TPO, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-095-752</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (12.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer 2.4</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12440061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>348701</td>
			<td>Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>#07861</td>
			<td>Used for Density gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in at Institute&#39;s facility. Commerically available PBS can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Antibiotic formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>56304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH800S Cell Sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM, 500mL</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mutational load and clonal composition of human blood

हेमाटोपोएटिक स्टेम और संतति कोशिकाओं (एचपीएससी) धीरे-धीरे एक उम्र के दौरान डीएनए उत्परिवर्तन जमा, जो ल्यूकेमिया जैसे उम्र से जुड़े रोगों के लिए योगदान कर सकते हैं। उत्परिवर्तन संचय की विशेषता उम्र से जुड़े रोगों के ईटियोलॉजी की समझ में सुधार कर सकती है। यहाँ प्रस्तुत अलग-अलग HSPCs में दैहिक उत्परिवर्तनों को सूचीबद्ध करने के लिए एक विधि है, जो क्लोनल प्राथमिक सेल संस्कृतियों के पूरे जीनोम अनुक्रमण (डब्ल्यूजीएस) पर आधारित है। मूल कोशिका में मौजूद उत्परिवर्तनों को क्लोनल संस्कृति की सभी कोशिकाओं द्वारा साझा किया जाता है, जबकि कोशिका छँटाई के बाद इन विट्रो में प्राप्त उत्परिवर्तन कोशिकाओं के सबसेट में मौजूद होते हैं। इसलिए, इस विधि के लिए अलग-अलग HSPCs, जो जीवन के दौरान जमा के जीनोम में मौजूद दैहिक उत्परिवर्तनों का सही पता लगाने के लिए अनुमति देता है. दैहिक उत्परिवर्तनों की ये सूची हेमेटोपोएटिक ऊतक में सक्रिय उत्परिवर्तन प्रक्रियाओं में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है और इन प्रक्रियाओं से ल्यूकेमोजेनेसिस में कैसे योगदान होता है। इसके अलावा, दैहिक उत्परिवर्तनों का आकलन करके जो एक ही व्यक्ति के कई HSPCs के बीच साझा किए जाते हैं, क्लोनल वंश संबंधों और रक्त आबादी की जनसंख्या गतिशीलता निर्धारित किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण एकल कोशिकाओं के इन विट्रो विस्तार में पर निर्भर करता है के रूप में, विधि पर्याप्त प्रतिकृति क्षमता के साथ hematopoietic कोशिकाओं तक सीमित है.

प्रायोगिक प्रक्रिया प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह चित्र 1में दर्शाया गया है. इनपुट सामग्री के प्रकार के आधार पर, विभिन्न चरणों का पालन किया जाना चाहिए। चित्र 2 में गर्भनाल रक्त कोशिका प्रकार का प्रवाह साइटोमेट्रिक आउटपुट दर्शाया गया है। सबसे पहले, सभी monocytic कोशिकाओं ढीला इस आबादी के आसपास एक गेट ड्राइंग द्वारा चयन कर रहे हैं. फिर, एकल एक रेखीय FSC-H/FSC-A अनुपात के साथ कोशिकाओं के लिए चयन करके अलग कर रहे हैं, के रूप में एक कम FSC-H/FSC-A अनुपात doubts या सेल clumps शामिल हैं. बिना दाग वाले नियंत्रण नमूने का प्रयोग वंश के सेल छँटाई द्वारों को परिभाषित करने के लिए किया जाता है-, सीडी 34+, सीडी 38-, सीडी 45आरए-. इसके अतिरिक्त, CD90 और CD49f का उपयोग संतति कोशिकाओं या स्वयं-नवीनीकरण स्टेम कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए किया जा सकताहै 17 (चित्र 2)। अनुक्रमणिका सॉर्टिंग अलग-अलग कक्षों के पुन: ट्रैक करने में सक्षम बनाता है, और सॉर्ट किए गए कक्षों को भूरे रंग के बिंदुओं के रूप में चित्रित किया जाता है. सेल संस्कृति के दौरान, व्यक्तिगत क्लोन एक अलग गति से विस्तार कर सकते हैं, कुछ क्लोन 3 सप्ताह के भीतर विस्तार के साथ, जबकि अन्य क्लोन केवल पूरी तरह से संस्कृति के पांचवें सप्ताह तक विस्तार कर रहे हैं. प्रतिनिधि कॉलोनी के लिए चित्र 3A,B देखें। एक प्रतिनिधि चित्र चढ़ाना के बाद 11 दिनों में एक लगभग confluent एमएससी थोक संस्कृति का दिखाया गया है (चित्र 3C) .
अनुक्रमण और उत्परिवर्तन विश्लेषण के बाद गुणवत्ता की जाँच दिखाया गया प्रतिलिपि संख्या परिवर्तन के लिए जाँच करने के लिए नियंत्रण-FreeC14 द्वारा जनरेट की गई प्रतिलिपि संख्या विश्लेषण का एक उदाहरण आउटपुट है (चित्र 4)। Karyotypic जानकारी जो गुणसूत्रों एक SNVFI चलाने के दौरान बाहर करने के लिए संकेत कर सकते हैं (चरण 7.6). SNVFI द्वारा बनाई गई VAF साजिश (चित्र 5) नमूने में संस्करण allele आवृत्तियों का एक हिस्टोग्राम है. 0.5 पर घनत्व भूखंड में एक चोटी नमूना क्लोनल है इंगित करता है। उत्परिवर्तनों के पीछे अंतर्निहित जैविक कारणों में अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए, इन का विश्लेषण आर पैकेज म्यूटेशनल पैटर्न्स15का उपयोग करके किया जा सकता है। यहाँ चित्रित एक विशिष्ट विश्लेषण है जो 96-ट्रिन्यूक्लिओटाइड आलेख का निर्माण करता है (चित्र 6)। विभिन्न उत्परिवर्तन प्रकार के परिमाणीकरण के अलावा, हस्ताक्षर निष्कर्षण भी इस उपकरण के साथ किया जा सकता है.
एक विकासात्मक वंश के पेड़ का निर्माण क्लोन के बीच साझा उत्परिवर्तन या एक क्लोन में मौजूद (और कम VAF पर) germline नियंत्रण में आईजीवी का उपयोग कर मान्य कर रहे हैं. जब नमूने में उपस्थित होते हैं तो उत्परिवर्तनों को सही माना जाता है न कि जननरेखा में उच्च VAF स्तरपर (चित्र 7क) । आईजीवी में उपस्थित न होने पर उत्परिवर्तनों को गलत माना जाता है, जो खराब मैप किए गए क्षेत्रों में हो सकता है (चित्र 7ख)। अन्य मामलों में, SNVFI द्वारा पता लगाया घटनाओं germline उत्परिवर्तनों याद कर रहे हैं (चित्र 7C). लक्षित पुन: अनुक्रमद्वारा उत्परिवर्तनों का स्वतंत्र पुन: अनुक्रमन चयनित क्लोनों में इन उत्परिवर्तनों के लिए अत्यधिक अनुशंसित है।  क्लोन के बीच साझा दैहिक उत्परिवर्तनों का पता लगाने के बाद, एक द्विआधारी मैट्रिक्स उत्पन्न होता है (चरण 10.8). एक heatmap के साथ और साझा उत्परिवर्तनए एम के बिना कोशिकाओं से युक्त निर्माण किया है. इस ताप मानचित्र के ऊपर विकासात्मक वंश वृक्ष दर्शाया गया है (चित्र 8)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig1.jpg"> चित्र 1: फ्लोचार्ट इनपुट सामग्री पर आधारित प्रयोगात्मक प्रक्रिया का चित्रण करता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig2.jpg"> चित्र 2: कक्ष सॉर्टिंग रणनीति. सबसे पहले, gating छोटे मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं पर किया जाता है. दूसरा, एकल कोशिकाओं रैखिक अंश के चयन द्वारा gated रहे हैं. वंश नकारात्मक कोशिकाओं द्वार कर रहे हैं. सभी CD34+ CD38- CD45- कक्ष एकल कक्ष-सॉर्ट किए गए हैं. भूरे रंग में कोशिकाओं के अंश ध्यान दिया जाना चाहिए, जो हल किए गए कक्षों विकल्प द्वारा हाइलाइट किए गए हैं "इंडेक्स छँटाई". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig3.jpg"> चित्र 3: प्रतिनिधि कक्ष संस्कृति परिणाम. प्रतिनिधि HSPC एक 384 अच्छी तरह से थाली में क्लोन (ए) चढ़ाना के बाद 2 सप्ताह और (बी) चढ़ाना के बाद 4 सप्ताह. (सी) मध्यम प्रतिस्थापन के 2 सप्ताह के बाद एमएससी संस्कृति. स्केल बार ] 100 डिग्री मी. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig4.jpg"> चित्र 4: Karyotypes. (क) क्लोनल एचएसपीसी संस्कृति और (बी) एमएससी थोक नमूना. केरियोटाइप्स का निर्धारण पठन-गहराई विश्लेषण द्वारा किया जाता था। दोनों रेखांकन एक karyoआमतः सामान्य नमूना संकेत मिलता है. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig4large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig5.jpg"> चित्र 5: संस्करण allele आवृत्तियों के हिस्टोग्राम. SNVFI के अंतिम फ़िल्टरिंग चरण से पहले क्लोन में भिन्न रूपों की विभिन्न आवृत्तियों का हिस्टोग्राम (VAF और 0.3). VAF पर एक चोटी - 0.5 इंगित करता है कि नमूना क्लोनल है. कम VAF के साथ subclonal उत्परिवर्तनS SNVFI (VAF और 0.3) के अंतिम फ़िल्टरिंग चरण के दौरान बाहर रखा गया है. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig5large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig6.jpg"> चित्रा 6: एक HSPC नमूने में दैहिक उत्परिवर्तनों के प्रतिनिधि उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम विश्लेषण. चित्रित कुल स्पेक्ट्रम के लिए प्रत्येक trinucleotide परिवर्तन (जिसमें से मध्य आधार उत्परिवर्तित है) के सापेक्ष योगदान है. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig6large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig7.jpg"> चित्र 7: आईजीवी16का उपयोग कर उत्परिवर्तनों के मैनुअल निरीक्षण | (ए) जब क्लोन में उपस्थित होते हैं तो उत्परिवर्तनों को सही माना जाता है न कि थोक नमूने में। (ख) एक खराब प्रतिचित्रित क्षेत्र में उपस्थित होने पर उत्परिवर्तनों को गलत धनात्मक माना जाता है। (ग) जब जर्मलाइन नियंत्रण में उपस्थित होते हैं तो उत्परिवर्तनों को गलत धनात्मक माना जाता है। ऊर्ध्वाधर रेखा उत्परिवर्तन नामक की स्थिति को इंगित करती है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig7large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig8.jpg"> चित्र 8: एक विकासात्मक वंश के पेड़ का निर्माण। चित्रित एक डेंड्रोग्राम है जो विकास के दौरान विभाजित विकास वंशों को दर्शाता है। डेन्ड्रोग्राम के तहत हीटमैप विभिन्न क्लोन में उत्परिवर्तनों की उपस्थिति को इंगित करता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig8large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

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Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood

मानव रक्त के म्यूटेशनलोड और क्लोनल संरचना की विशेषता

कोशिकाओं में कायिक उत्परिवर्तन पैटर्न पिछले mutagenic जोखिम को प्रतिबिंबित और विकासवंशीय वंश संबंधों को प्रकट कर सकते हैं. यहाँ प्रस्तुत सूची और व्यक्तिगत hematopoietic स्टेम और जनक कोशिकाओं में दैहिक उत्परिवर्तनों का विश्लेषण करने के लिए एक पद्धति है.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) gradually accumulate DNA mutations during a lifespan, which can contribute to age-associated diseases such ...

इस विधि के साथ, हम एक ही हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल में म्यूटेशन की संख्या को सही ढंग से निर्धारित कर सकते हैं। इन उत्परिवर्तनों का उपयोग उत्परिवर्तनीय प्रक्रियाओं को समझने और हेमेटोपोइटिक वंश को विच्छेदन करने के लिए किया जा सकता है। हमारी विधि विट्रो में हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं की क्लोनिंग करके पूरे जीनोम प्रवर्धन तकनीकों के उपयोग से बचती है, जिसके परिणामस्वरूप कम त्रुटि दर और लाभ डाउनस्ट्रीम विश्लेषण होते हैं।हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं के जीनोम में मौजूद उत्परिवर्तनीय पैटर्न म्यूटेजेनिक और डीएनए मरम्मत प्रक्रियाओं को प्रकट कर सकते हैं, जिनसे वे उजागर हुए थे। पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित नमूना सामग्री और धुंधला के साथ इस प्रक्रिया को शुरू करें, फिर हेमेटोपोइटिक स्टेम और जनक सेल, या एचएसपीसी संस्कृति माध्यम के 25 मिलीलीटर तैयार करें। प्रत्येक कुएं में एचएसपीसी संस्कृति माध्यम के 75 माइक्रोलीटर के साथ एक सेल संस्कृति 384 अच्छी तरह से प्लेट भरें।बाहरी कुओं में माध्यम के वाष्पीकरण को रोकने के लिए, बाहरी कुओं को बाँझ पानी या पीबीएस के 75 माइक्रोलीटर से भरें, और सेल छंटाई के लिए इन कुओं का उपयोग न करें। व्यवहार्य संकेत एचएसपीसी की सही छंटाई इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम है। दाग नमूने से 10, 000 कोशिकाओं में एक दाग नियंत्रण के आधार पर एचएसपीसी छंटाई के लिए गेट्स सेट करें।गेट एकल कोशिकाओं रैखिक आगे तितर बितर ऊंचाई बनाम आगे तितर बितर क्षेत्र अंश के आसपास एक फाटक ड्राइंग द्वारा। वंश अंश के लिए एक गेट आकर्षित करने के लिए दागदार नियंत्रण अंश का उपयोग करें। CD34 सकारात्मक कोशिकाओं के लिए गेट ड्रा करें और सीडी 38 नकारात्मक, सीडी 45RA नकारात्मक कोशिकाओं के लिए एक विशिष्ट गेट सेट करके इस सबसेट की विशेषता है।फैक्स मशीन पर 384-अच्छी तरह से प्लेट लोड करें और एकल कोशिकाओं को सॉर्ट करें। यदि फैक्स मशीन पर लागू होता है, तो सॉर्ट की गई कोशिकाओं के रिट्रेसिंग को सक्षम करने के लिए इंडेक्स सॉर्टिंग डेटा रखने के विकल्प पर टॉगल करें। अकेले एचएससी हल संस्कृति के लिए, पारदर्शी पॉलीथीन लपेटो में ढक्कन के साथ ३८४ अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट लपेटो ।5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ एक आर्द्र ३७ डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के लिए ३८४ अच्छी तरह से थाली हस्तांतरण और यह तीन से चार सप्ताह के लिए इनक्यूबेटर में रखने के लिए जब तक दिखाई क्लोन दिखाई देते हैं । चार सप्ताह की खेती के बाद, यह निर्धारित करें कि किन कुओं में 30% या उससे अधिक की एक योग्यता है। प्रत्येक शंकु के लिए, 1% बीएसए और पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ 1.5 मिलीलीटर माइक्रोट्यूब प्रीफिल करें और इसी कुएं के अनुसार ट्यूब लेबल करें।पिपेट टिप से चिपके कोशिकाओं की संख्या को कम करने के लिए 1% बीएसए और पीबीएस के साथ एक पिपेट टिप को प्री-वेट करें। 75 माइक्रोलीटर पर सेट 200 माइक्रोलीटर पिपेट के साथ कुएं के नीचे को स्क्रैप करते हुए कम से कम पांच बार मध्यम को तेजी से ऊपर और नीचे पिपेट करें। लेबल वाले माइक्रोट्यूब में सेल सस्पेंशन ले लीजिए जो कुएं से मेल खाती है।कोशिकाओं का अधिकतम तेज सुनिश्चित करने के लिए ताजा 1% बीएसए और पीबीएस के 75 माइक्रोलीटर तक के साथ अच्छी तरह से पिपटिंग दोहराएं। क्लोनली सुसंस्कृत कोशिकाएं कुएं के नीचे से चिपक सकती हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी कोशिकाओं को एकत्र किया गया है या नहीं, एक मानक, उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कुओं का निरीक्षण करें।यदि 30% से अधिक उदारता वाले सभी कुओं को काटा गया है, तो 384-अच्छी तरह से प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस रखें। क्लोनल संस्कृतियों को पांच सप्ताह तक के लिए पैदा कर सकते हैं । 350 बार जी पर पांच मिनट के लिए सेल निलंबन नीचे स्पिन।एक छोटी सी गोली दिखाई नी चाहिए। ध्यान से सभी लेकिन सुपरनिटर के बारे में पांच माइक्रोलीटर को हटा दें। सेल छर्रों को शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज किया जा सकता है और डीएनए अलगाव से पहले कई महीनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।लाइनएगरी की पहली शाखाओं में मौजूद म्यूटेशन भी थोक नमूने में उप क्लोनली रूप से मौजूद होंगे। बाद में ब्रांचिंग वंश को केवल एचएसपीसी के बीच साझा किए गए म्यूटेशन द्वारा परिभाषित किया जाता है। क्लोन और थोक में मौजूद उप-10 के सबसेट में मौजूद म्यूटेशन की पहचान करने के लिए, क्लोन के बीच साझा किए गए दैहिक उत्परिवर्तनों के लिए पहला फ़िल्टर।एक यूनिक्स आधारित टर्मिनल में, फ़िल्टरसोमैटिक को संपादित करें। पैट सेट करने और अन्य मापदंडों को समायोजित करने के लिए ne फ़ाइल। फिल्टर को चलाएं।पीआई स्क्रिप्ट। निर्धारित लोवाफ बल्क का उपयोग करके थोक में मौजूद म्यूटेशन के लिए फ़िल्टर करें। एक Unix आधारित टर्मिनल में आर स्क्रिप्ट।यह साझा और अद्वितीय एकल न्यूक्लियोटाइड वेरिएंट के लिए अलग-अलग वीसीएफ फाइलें उत्पन्न करेगा। सभी उत्परिवर्तन पदों को ओवरलैप करके, थोक नमूने में मौजूद नहीं हैं कि क्लोन के बीच साझा सभी उत्परिवर्तन का निर्धारण करें। एकीकृत जीनोमिक व्यूअर, संक्षिप्त आईजीवी का उपयोग करके मैनुअल निरीक्षण द्वारा झूठी सकारात्मक को बाहर करें।म्यूटेशन को तब झूठा माना जाता है जब उत्परिवर्तन सभी क्लोनों में जर्मलाइन में मौजूद होता है या खराब मैप किए गए क्षेत्रों में मौजूद होता है। सच्चे उत्परिवर्तनों को दो क्लोनों के बीच साझा किया जा सकता है या थोक में उप-ढंग से मौजूद किया जा सकता है। सभी साझा लोकी स्वतंत्र रूप से लक्षित या सेंगर अनुक्रमण का उपयोग करते हुए पुनः प्राप्त करें।उत्परिवर्तन बनाम अनुक्रमित क्लोन की बाइनरी टेबल बनाने के लिए साझा म्यूटेशन का उपयोग करें, शून्य के साथ यह दर्शाता है कि उत्परिवर्तन मौजूद नहीं है और उत्परिवर्तन की उपस्थिति का संकेत देता है। आर आधारित कार्यों का उपयोग कर कोशिकाओं के बीच वंश संबंधों का संकेत एक डेंड्रोग्राम के साथ एक गर्मी के नक्शे के रूप में उत्परिवर्तन बाइनरी टेबल उत्पादन। गर्मी नक्शा प्रत्येक कोशिका के लिए उत्परिवर्तन की स्थिति को इंगित करता है।कॉपी नंबर परिवर्तन की जांच करने के लिए नियंत्रण तीन सी द्वारा उत्पन्न कॉपी नंबर विश्लेषण के एक उदाहरण आउटपुट के रूप में दिखाया गया है। एकल न्यूक्लियोटाइड वैरिएंट फ़िल्टरिंग द्वारा बनाया गया संस्करण एलील अंश प्लॉट, नमूने में वैरिएंट एलील आवृत्तियों का एक हिस्टोग्राम है। 0.5 पर घनत्व भूखंड में एक चोटी इंगित करता है कि नमूना क्लोनल है।यहां चित्रित एक ठेठ उत्परिवर्तनीय पैटर्न विश्लेषण है जो 96 त्रिन्यूक्लियोटाइड साजिश का उत्पादन करता है। विभिन्न उत्परिवर्तन प्रकारों के परिमाणीकरण के अलावा, इस उपकरण के साथ हस्ताक्षर निष्कर्षण भी किया जा सकता है। क्लोन के बीच साझा किए गए उत्परिवर्तन या जर्मलाइन नियंत्रण में क्लोन में मौजूद आईजीवी का उपयोग करके मान्य किए जाते हैं।उत्परिवर्तन सही माना जाता है जब नमूना में मौजूद है और अंकुरण में उच्च संस्करण allele आवृत्ति स्तर पर नहीं । आईजीवी में मौजूद नहीं होने पर म्यूटेशन को गलत माना जाता है, जो खराब मैप किए गए क्षेत्रों में हो सकता है। अन्य मामलों में, एकल न्यूक्लियोटाइड संस्करण फ़िल्टरिंग द्वारा पता की गई घटनाओं को जर्मलाइन वेरिएंट से चूक किया जाता है।चयनित क्लोनों में इन उत्परिवर्तनों के लिए लक्षित पुनर्सीमा द्वारा उत्परिवर्तनों की स्वतंत्र पुनर्सीमा की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। क्लोन के बीच साझा दैहिक उत्परिवर्तनों का पता लगाने के बाद, एक बाइनरी मैट्रिक्स उत्पन्न होता है, एक गर्मी मानचित्र का निर्माण किया जाता है जिसमें साझा उत्परिवर्तनों के साथ और बिना कोशिकाओं को शामिल किया जाता है। यहां प्रस्तुत मेटा के लिए अगले कदम के रूप में, हीमोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं में सक्रिय उत्परिवर्तनीय प्रक्रियाओं को उत्परिवर्तनीय हस्ताक्षर विश्लेषण का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

पर हौसले अलग मानव विलस Cytotrophoblasts siRNA अभिकर्मक और EMSA विश्लेषण

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Edu धुंधला द्वारा ड्रोसोफिला एडल्ट अंडाशय में mitochondrial डीएनए प्रतिकृति के सीटू लेबलिंग में

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र पर MeCP2 के पुनः सक्रिय करने के लिए परित shRNA स्क्रीन

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Proliferating और Quiescent मानव Fibroblasts में जीनोम चौड़ा प्रतिलिपि क्षय दरों का निर्धारण

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Murine और मानव टेम जनक कोशिकाओं के अत्यधिक कुशल जीन व्यवधान CRISPR द्वारा Cas9/

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

अलगाव, लक्षण वर्णन और मानव दंत कूप स्टेम सेल के MicroRNA आधारित आनुवंशिक संशोधन

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

माउस भ्रूण में मुताबिक़ पुनर्संयोजन की घटनाओं की पहचान स्टेम दक्षिणी सोख्ता और पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया का उपयोग कोशिकाओं

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

विशेषता हिस्one पोस्ट-translational में संशोधन परिवर्तन खमीर न्यूरोडेजेनेरेटिव प्रोटिनोपैथी मॉडल

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

पूरे रक्त से mRNA के अनुक्रमण नैनोकोर अनुक्रमण का उपयोग

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण और मानव अग्नाशय Islets का विश्लेषण

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...