Name: characterizing mutational load and clonal composition of human blood
Uploaded: 2019-07-11T15:00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione VIDI dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO) (n. 016.Vidi.171.023) a R. v. B.

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	<li>Osorio, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+Reveal+Lineage+Relationships+and+Age-Related+Mutagenesis+in+Human+Hematopoiesis.">Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis.</a> Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Hematopoiesis+and+Blood-Cancer+Risk+Inferred+from+Blood+DNA+Sequence.">Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Clonal+Hematopoiesis+Associated+with+Adverse+Outcomes.">Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).</li><li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+haematopoiesis+harbouring+AML-associated+mutations+is+ubiquitous+in+healthy+adults.">Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> Nature Communications. 7, 1-7 (2016).</li><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+Signatures+of+Mutational+Processes+Operative+in+Human+Cancer.">Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer.</a> Cell Reports. 3, 246-259 (2013).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500, 415-421 (2013).</li><li>Alexandrov, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Repertoire+of+Mutational+Signatures+in+Human+Cancer.">The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. 513, 422-425 (2014).</li><li>Blokzijl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mutation+accumulation+in+human+adult+stem+cells+during+life.">Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life.</a> Nature. 538, 260-264 (2016).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+Current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: Current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+identification+of+single-nucleotide+variants+in+whole-genome-amplified+single+cells.">Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells.</a> Nature Methods. 14, 491-493 (2017).</li><li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150, (2012).</li><li>Jager, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mutation+accumulation+in+single+human+adult+stem+cells+by+whole-genome+sequencing+of+organoid+cultures.">Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures.</a> Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).</li><li>Boeva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control-FREEC:+A+tool+for+assessing+copy+number+and+allelic+content+using+next-generation+sequencing+data.">Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data.</a> Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).</li><li>Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MutationalPatterns:+Comprehensive+genome-wide+analysis+of+mutational+processes.">MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes.</a> Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).</li><li>Thorvaldsd&#243;ttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Genomics+Viewer+(IGV):+High-performance+genomics+data+visualization+and+exploration.">Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+human+hematopoietic+stem+cells+capable+of+long-term+multilineage+engraftment.">Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.</a> Science. , (2011).</li><li>Lee-Six, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+of+normal+human+blood+inferred+from+somatic+mutations.">Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations.</a> Nature. 561, 473-478 (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. , (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Presentato qui è un metodo per rilevare le mutazioni che si sono accumulate durante la vita nei singoli HSPC e per costruire un albero di lignaggio dello sviluppo precoce utilizzando questi dati di mutazione.
Per eseguire correttamente questi saggi, è necessario soddisfare diversi requisiti critici. In primo luogo, deve essere garantita la fattibilità del campione. La gestione rapida del campione è fondamentale per garantire l'efficienza della procedura. In secondo luogo, la perdita di potenza del fattore di crescita influenzerà negativamente l'espansione clonale degli HSPC. Per garantire un elevato fattore di crescita, è importante evitare cicli di congelamento-scongelamento e preparare aliquote monouso. In terzo luogo, dopo aver eseguito WGS, chiamata di mutazione e filtraggio, è fondamentale convalidare la clonalità della coltura clonale. Per confermare la clonalità della coltura, il VAF delle mutazioni dovrebbe accoppiarsi intorno a 0,5 in un campione cariotipico normale (Figura 3). Nelle cellule con un basso carico mutazionale, come gli HSPC del sangue cordonale, è più difficile determinare la clonalità a causa dei bassi numeri di mutazione.
Il nostro approccio si basa sull'espansione in vitro di singole cellule per consentire il WGS. Pertanto, il nostro approccio è limitato alle cellule che hanno il potenziale replicativo di espandersi clonalmente, ad esempio gli HSPC. Nelle nostre mani, circa il 5%-30% di tutte le cellule singole sono in grado di espandersi adeguatamente. La riduzione dei tassi di crescita può potenzialmente comportare una distorsione della selezione. Come discusso in precedenza, i metodi che utilizzano WGA possono superare questa distorsione di selezione in quanto questa tecnica non si basa sull'espansione delle celle. Tuttavia, WGA ha le sue carenze, e l'amplificazione clonale rimane l'unico metodo per determinare con precisione il numero di mutazioni nell'intero genoma senza abbandoni allelici e una copertura equa lungo il genoma, soprattutto in campioni con bassa vera somatica numeri di mutazione.
I dati generati utilizzando questo approccio possono essere utilizzati per determinare le filogenie del sistema ematopoietico, in quanto le mutazioni rilevate nelle singole cellule possono essere utilizzate per sezionare le linee cellulari, come illustrato nella Figura 6. In genere, una o due mutazioni possono definire ogni ramo in un donatore sano1. Poiché i lignaggi si ramificano all'inizio del concepimento, le mutazioni che definiscono questi primi rami saranno presenti anche con un vaF basso nel campione normale abbinato che è stato utilizzato per filtrare le varianti germinali1,18,19. In questo caso, l'uso di cellule non ematopoietiche, come le MSC, è preferito in quanto si prevede che si separino molto presto durante lo sviluppo dal sistema ematopoietico. Poiché le cellule T sono di origine ematopoietica, l'uso di queste cellule come campione normale corrispondente per filtrare le varianti germinali potrebbe quindi confondere la costruzione della prima ramificazione dell'albero di lignaggio dello sviluppo. La presenza subclonale di mutazioni specifiche dei rami in alcune popolazioni di sangue maturo, che può essere misurata mediante sequenziamento profondo mirato, indicherà che la progenie di quel ramo può dare origine a quel tipo di cellula matura. Inoltre, il nostro approccio consente di valutare le conseguenze mutazionali dell'esposizione mutagena in vivo e, in ultima analisi, di come ciò possa contribuire allo sviluppo della leucemia.

L'esposizione di cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HPG) a fonti mutagene endogene o estrinseche contribuisce al graduale accumulo di mutazioni nel DNA durante una vita1. L'accumulo graduale di mutazioni negli HSPC1 può provocare l'ematopoiesi clonale legata all'età (ARCH)2,3, che è una condizione non sintomatica guidata da HSPC che trasportano mutazioni leucemia-driver. Inizialmente, si è pensato che gli individui con ARCH hanno un aumentato rischio di leucemia2,3. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato un'incidenza del 95% di ARCH negli individui anziani4, rendendo meno chiara l'associazione con le neoplasie e sollevando la questione del motivo per cui alcuni individui con ARCH alla fine sviluppano neoplasie. Ciò nonostante, le mutazioni somatiche negli HSPC possono comportare gravi rischi per la salute, poiché i disturbi della mielidisticità e la leucemia sono caratterizzati dalla presenza di specifiche mutazioni del driver del cancro.
Per identificare i processi mutazionali e studiare la clonalità del sangue, è necessario caratterizzare l'accumulo di mutazioni nei singoli HSPC. I processi mutazionali lasciano modelli caratteristici nel genoma, le cosiddette firme mutazionali, che possono essere identificate e quantificate in raccolte di mutazioni a livello di genoma5. Ad esempio, l'esposizione alla luce UV, gli agenti alchilanti e i difetti nelle vie di riparazione del DNA sono stati associati a una diversa firma mutazionale6,7. Inoltre, a causa della natura stocastica degli accumuli di mutazione, la maggior parte (se non tutte) delle mutazioni acquisite sono uniche tra le cellule. Se le mutazioni sono condivise tra più cellule dello stesso individuo, indica che queste cellule condividono un antenato comune8. Pertanto, valutando le mutazioni condivise, le relazioni di lignaggio possono essere determinate tra le cellule e un albero di lignaggio dello sviluppo può essere costruito ramo per ramo. Tuttavia, catalogare rare mutazioni somatiche nelle cellule fisiologicamente normali è tecnicamente impegnativo a causa della natura policlonale dei tessuti sani.
Presentato qui è un metodo per identificare e determinare con precisione le mutazioni somatiche nei genomi dei singoli HSPC. Ciò comporta l'isolamento e l'espansione clonale degli HSPC in vitro. Queste colture clonali riflettono la composizione genetica della cellula originale (cioè le mutazioni nella cellula originale saranno condivise da tutte le altre cellule della coltura). Questo approccio ci permette di ottenere DNA sufficiente per il sequenziamento dell'intero genoma (WGS). Abbiamo dimostrato in precedenza che le mutazioni accumulate in vitro durante la coltura clonale saranno condivise da un sottoinsieme di cellule. Ciò consente il filtraggio di tutte le mutazioni in vitro, in quanto queste saranno presenti in una frazione più piccola di letture rispetto alle mutazioni acquisite in vivo9. I metodi precedenti hanno ottenuto DNA sufficiente da una singola cellula per il WGS utilizzando l'amplificazione dell'intero genoma (WGA)10. Tuttavia, lo svantaggio principale di WGA è la sua amplificazione relativamente soggetta a errori e sbilanciata del genoma, che può provocare abbandoni degli alleli11. Ciò nonostante, poiché questo approccio si basa sull'espansione in vitro di singole cellule, è limitato alle cellule del sangue con un potenziale replicativo sufficiente, che non è il caso per i metodi dipendenti da WGA. Gli sforzi precedenti di sequenziamento delle colture clonali si sono affidati all'utilizzo di strati di alimentazione per garantire l'amplificazione clonale di singoli HSPC12. Tuttavia, il DNA proveniente dagli strati dell'alimentatore può potenzialmente contaminare il DNA delle colture clonali, confondendo la successiva chiamata e filtraggio della mutazione. Il metodo qui presentato si basa esclusivamente su un mezzo specificato per espandere clonalmente singoli HSPC, evitando quindi il problema della contaminazione del DNA. Fino ad ora, abbiamo applicato con successo questo metodo sul midollo osseo umano, sul sangue del cordone, sul midollo osseo congelato e sul sangue periferico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.20 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Syringe, Luer lock</td>
			<td>BD</td>
			<td>613-3925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301603</td>
			<td>Clone 3.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302005</td>
			<td>Clone 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 BV650</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300467</td>
			<td>Clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 BV421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343609</td>
			<td>561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38 PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303505</td>
			<td>Clone HIT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA PerCP/Cy5.5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304121</td>
			<td>Clone HI100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f PE/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313621</td>
			<td>Clone GoH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328113</td>
			<td>Clone 5E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 5 mL tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR plate, 384w, 130 &#181;L, F-bottom, TC, cover</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61965059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Flt3-Ligand, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-479</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78040.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (2.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78050.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TPO, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-095-752</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (12.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer 2.4</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12440061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>348701</td>
			<td>Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>#07861</td>
			<td>Used for Density gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in at Institute&#39;s facility. Commerically available PBS can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Antibiotic formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>56304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH800S Cell Sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM, 500mL</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mutational load and clonal composition of human blood

Le cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HPG) accumulano gradualmente mutazioni del DNA durante una vita, che possono contribuire a malattie associate all'età come la leucemia. Caratterizzare l'accumulo di mutazioni può migliorare la comprensione dell'eziologia delle malattie associate all'età. Presentato qui è un metodo per catalogare le mutazioni somatiche nei singoli HSPC, che si basa sul sequenziamento dell'intero genoma (WGS) delle colture cellulari primarie clonali. Le mutazioni presenti nella cellula originale sono condivise da tutte le cellule della coltura clonale, mentre le mutazioni acquisite in vitro dopo lo smistamento delle cellule sono presenti in un sottoinsieme di cellule. Pertanto, questo metodo consente di rilevare accuratamente le mutazioni somatiche presenti nei genomi dei singoli HSPC, che si accumulano durante la vita. Questi cataloghi di mutazioni somatiche possono fornire preziose informazioni sui processi mutazionali attivi nel tessuto ematopoietico e su come questi processi contribuiscono alla leucemogenesi. Inoltre, valutando le mutazioni somatiche condivise tra più HPC dello stesso individuo, è possibile determinare le relazioni di lignaggio clonale e le dinamiche della popolazione delle popolazioni ematiche. Poiché questo approccio si basa sull'espansione in vitro di singole cellule, il metodo è limitato alle cellule ematopoietiche con un potenziale replicativo sufficiente.

Procedura sperimentale Il flusso di lavoro sperimentale è illustrato nella Figura 1. In base al tipo di materiale di input, è necessario seguire diversi passaggi. Nella Figura 2 è raffigurata una produzione citometrica di flusso di un tipo di cellule del sangue cordonale. In primo luogo, tutte le celle monocitiche vengono selezionate disegnando vagamente un cancello intorno a questa popolazione. Quindi, i singlet vengono isolati selezionando le celle con un rapporto lineare FSC-H/FSC-A, poiché un rapporto FSC-H/FSC-A più basso include doppie o ciuffi di cellule. Il campione di controllo non colorato viene utilizzato per definire i gate di ordinamento delle celle per il lignaggio-, CD34,CD38-, CD45RA-. Inoltre, CD90 e CD49f possono essere utilizzati per distinguere tra cellule progenitrici o cellule staminali auto-rinnovanti17 (Figura 2). L'ordinamento degli indici consente di ritracciare le singole celle e le celle ordinate sono rappresentate come punti marroni. Durante la coltura cellulare, i singoli cloni possono espandersi a un ritmo diverso, con alcuni cloni che si espandono entro 3 settimane, mentre altri cloni sono completamente estesi solo fino alla quinta settimana di cultura. Vedere la figura 3A,B per la escrescenza della colonia rappresentativa. Viene mostrato un quadro rappresentativo di una cultura di massa MSC quasi confluente a 11 giorni dopo la placcatura (Figura 3C).
Controllo della qualità dopo il sequenziamento e l'analisi delle mutazioni L'esempio è un output di esempio dell'analisi del numero di copia generata da Control-FreeC14 per verificare la presenza di alterazioni dei numeri di copia (Figura 4). Le informazioni karyotipiche possono indicare quali cromosomi escludere durante una corsa SNVFI (passaggio 7.6). Il grafico VAF creato da SNVFI (Figura 5) è un istogramma delle frequenze di alleli varianti nel campione. Un picco nel grafico di densità a 0,5 indica che il campione è clonale. Per ottenere maggiori informazioni sulle cause biologiche sottostanti dietro le mutazioni, queste possono essere analizzate utilizzando il pacchetto R MutationalPatterns15. Qui è illustrata un'analisi tipica che produce un grafico a 96 trinucleotidi (Figura 6). Oltre alla quantificazione di diversi tipi di mutazione, l'estrazione della firma può essere eseguita anche con questo strumento.
Costruzione di un albero di lignaggio dello sviluppo Le mutazioni condivise tra i cloni o presenti in un clone (e a basso VAF) nel controllo della linea germinale vengono convalidate utilizzando IGV. Le mutazioni sono considerate vere quando presenti nel campione e non ad alti livelli di VAF nella linea germinale (Figura 7A). Le mutazioni sono considerate false quando non sono presenti in IGV, che può verificarsi in regioni scarsamente mappate (Figura 7B). In altri casi, gli eventi rilevati dalla SNVFI vengono perse mutazioni germinali (Figura 7C). La ri-sequenziazione indipendente delle mutazioni mediante un ri-sequenziamento mirato è altamente raccomandata per queste mutazioni nei cloni selezionati.  Dopo il rilevamento di mutazioni somatiche condivise tra cloni, viene generata una matrice binaria (passaggio 10.8). Viene costruita una mappa di calore contenente cellule con e senza le mutazioni condivise A-M. Sopra questa mappa di calore è indicato l'albero di lignaggio dello sviluppo (Figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig1.jpg"> Figura 1: Diagramma di flusso che illustra la procedura sperimentale basata sul materiale di input. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig2.jpg"> Figura 2: Strategia di ordinamento delle celle. In primo luogo, il gating viene eseguito su piccole celle mononucleari. In secondo luogo, le singole celle sono gated dalla selezione della frazione lineare. Le cellule negative di lignaggio sono recintate. Tutte le celle CD34- CD38- CD45- sono ordinate a cella singola. La frazione di celle in marrone dovrebbe essere notato, che sono le celle ordinate evidenziate dall'opzione "ordinamento indice". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig3.jpg"> Figura 3: Risultati della coltura cellulare rappresentativa. Rappresentante HSPC cloni in un 384 piastra di pozzo a (A) 2 settimane dopo placcatura e (B) 4 settimane dopo placcatura. (C) cultura MSC dopo 2 settimane di sostituzione media. Barra della scala: 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig4.jpg"> Figura 4: Karyotypes. (A) Esempio di massa MSC per colture HSPC clonale e (B), di massa di MSC. I cariotipi sono stati determinati da un'analisi di lettura. Entrambi i grafici indicano un campione cariotipico normale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig5.jpg"> Figura 5: Istogramma delle frequenze degli alleli varianti. Istogramma delle frequenze allele varianti delle varianti in un clone prima dell'ultimo passaggio di filtraggio di SNVFI (VAF >0.3). Un picco a VAF - 0,5 indica che il campione è clonale. Le mutazioni subclonali con vaF basso sono escluse durante l'ultima fase di filtraggio di SNVFI (VAF >0.3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig6.jpg"> Figura 6: Analisi rappresentativa dello spettro mutazionale delle mutazioni somatiche in un campione HSPC. Rappresentato è il contributo relativo di ogni cambiamento trinucleotide (di cui la base centrale è mutata) allo spettro totale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig6large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig7.jpg"> Figura 7: Ispezione manuale delle mutazioni mediante IGV16. (A) Le mutazioni sono considerate vere quando sono presenti nel clone e non nel campione di massa. (B) Le mutazioni sono considerate falsi positivi quando sono presenti in una regione scarsamente mappata. (C) Le mutazioni sono considerate falsi positivi quando sono presenti in un controllo germinale. La linea verticale indica la posizione di una mutazione chiamata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig7large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig8.jpg"> Figura 8: Costruzione di un albero di lignaggio dello sviluppo. Rappresentato è un dendrogramma che indica linee di sviluppo che si sciolgono durante lo sviluppo. La mappa termica sotto il dendrogramma indica la presenza di mutazioni in diversi cloni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig8large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood

Caratterizzare il carico mutazionale e la composizione clonale del sangue umano

I modelli di mutazione somatica nelle cellule riflettono una precedente esposizione mutagena e possono rivelare relazioni di lignaggio dello sviluppo. Qui è presentata una metodologia per catalogare e analizzare le mutazioni somatiche nelle singole cellule staminali ematopoietiche e progenitrici.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) gradually accumulate DNA mutations during a lifespan, which can contribute to age-associated diseases such ...

Con questo metodo, possiamo determinare con precisione il numero di mutazioni in una singola cellula staminale ematopoietica. Queste mutazioni possono essere usate per decifrare processi mutazionali e sezionare lignaggi ematopoietici. Il nostro metodo evita l'uso di tecniche di amplificazione dell'intero genoma clonando le cellule staminali ematopoietiche in vitro, il che si traduce in tassi di errore più bassi e beneficia dell'analisi a valle.I modelli mutazionali presenti nei genomi delle cellule staminali ematopoietiche possono rivelare i processi mutageni e di riparazione del DNA a cui sono state esposte. Iniziare questa procedura con la preparazione del materiale campione e la colorazione come descritto nel protocollo di testo, quindi preparare 25 millilitri di gambo ematopoietico e cellula progenitrice, o mezzo di coltura HSPC. Riempire una piastra di coltura cellulare 384 con 75 microlitri di mezzo di coltura HSPC in ogni pozzo.Per evitare l'evaporazione del mezzo nei pozzi esterni, riempire i pozzi esterni con 75 microlitri di acqua sterile o PBS e non utilizzare questi pozzi per la cernita cellulare. L'ordinamento corretto degli HSPC di segnale validi è il passaggio più critico di questo protocollo. Impostare i gate per l'ordinamento HSPC in base a un controllo non macchiato in 10.000 celle del campione macchiato.Cancello di singole celle disegnando un cancello attorno all'altezza di dispersione in avanti lineare rispetto alla frazione dell'area di dispersione in avanti. Utilizzare la frazione di controllo non macchiata per disegnare un cancello per la frazione di lignaggio. Disegnare gate per le celle positive CD34 e caratterizzare ulteriormente questo sottoinsieme impostando un gate specifico per le celle negative CD38, CD45RA.Caricare la piastra da 384 po' sul fax e ordinare singole celle. Se applicabile al fax, attivare l'opzione per mantenere i dati di ordinamento dell'indice per consentire il ritrascimento delle celle ordinate. Per la coltura degli HSC ordinati singolarmente, avvolgere la piastra di coltura a 384 polietilene con coperchio in involucro di polietilene trasparente.Trasferire la piastra da 384 po 'in un incubatore umidificato di 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica e tenerlo nell'incubatrice per tre o quattro settimane fino a quando non compaiono cloni visibili. Dopo quattro settimane di ristrutturazione, determinare quali pozzi hanno una confluenza del 30% o superiore. Per ogni cono, precompittare microtubi da 1,5 millilitri con un millilitro di 1%BSA e PBS ed etichettare il tubo in base al pozzo corrispondente.Pre-bagnare una punta di pipetta con 1%BSA e PBS per ridurre al minimo il numero di celle che si attaccano alla punta della pipetta. Pipettare vigorosamente il mezzo su e giù almeno cinque volte raschiando il fondo del pozzo con la pipetta da 200 microlitri impostata a 75 microlitri. Raccogliere la sospensione cellulare nel microtubo etichettato che corrisponde al pozzo.Ripetere la tubazione nel pozzo con un massimo di 75 microlitri di fresco 1%BSA e PBS per garantire il massimo assorbimento delle cellule. Le cellule coltivate clonally possono attaccarsi al fondo del pozzo. Ispezionare i pozzi utilizzando un microscopio a luce invertito standard per assicurarsi che tutte le cellule siano state raccolte.Se tutti i pozzi con una confluenza superiore al 30% sono stati raccolti, riposizionare la piastra di 384 pozzi nell'incubatore. Le colture clonali possono proliferare fino a cinque settimane. Far girare la sospensione cellulare per cinque minuti a 350 volte g.Dovrebbe essere visibile un piccolo pellet. Rimuovere con cura tutti tranne circa cinque microlitri del supernatante. I pellet cellulari possono essere congelati a meno 20 gradi Celsius e conservati per più mesi prima dell'isolamento del DNA.Le mutazioni presenti nei primi rami della lineageria saranno presenti anche nel campione sfuso. I lignaggi di ramificazione successivi sono definiti solo da mutazioni condivise tra gli HSPC. Per identificare le mutazioni presenti in un sottoinsieme dei cloni e sottoclonaly presenti in massa, primo filtro per mutazioni somatiche condivise tra cloni.In un terminale basato su Unix, modificate il filtersomatic. ne per impostare i pats e regolare gli altri parametri. Eseguire il filtersomatic.pi greco script. Filtrare le mutazioni che sono sottoclonaly presenti in blocco utilizzando la massa lowVAF determinare. r in un terminale basato su Unix.In questo modo verranno generati file vcf separati per varianti nucleotidiche singole condivise e univoche. Determinare tutte le mutazioni condivise tra cloni che non sono presenti nel campione di massa, sovrapponendo tutte le posizioni di mutazione. Escludere i falsi positivi mediante ispezione manuale utilizzando Integrative Genomic Viewer, abbreviato IGV.Le mutazioni sono considerate false quando non sono presenti quando la mutazione è presente nella linea germinale in tutti i cloni o quando sono presenti in regioni scarsamente mappate. Le vere mutazioni possono essere condivise tra due cloni o essere sottoclonaly presenti nella massa. Risequenza tutti i loci condivisi in modo indipendente utilizzando il sequenziamento mirato o sanger.Usa le mutazioni condivise per costruire una tabella binaria di mutazioni rispetto ai cloni sequenziati, con zero che indica che la mutazione non è presente e una che indica la presenza della mutazione. Produrre la tabella binaria della mutazione come mappa termica insieme a un dendrogramma che indica le relazioni di lignaggio tra le cellule usando funzioni basate su R. La mappa termica indica lo stato di mutazione per ogni cellula.Mostrato come output di esempio dell'analisi del numero di copia generata dal controllo tre c per verificare la presenza di modifiche al numero di copia. Il grafico a frazione allele variante creato dal filtro a variante nucleotidica singola, è un istogramma delle frequenze alleliche varianti nel campione. Un picco nel grafico di densità a 0,5 indica che il campione è clonale.Qui è raffigurata una tipica analisi dei modelli mutazionali che produce una trama di 96 trinucleotide. Oltre alla quantificazione di diversi tipi di mutazione, l'estrazione della firma può essere eseguita anche con questo strumento. Le mutazioni condivise tra cloni o presenti in un clone nel controllo della linea germinale vengono convalidate utilizzando IGV.Le mutazioni sono considerate vere quando presenti nel campione e non ad alti livelli di frequenza allele variante nella linea germinale. Le mutazioni sono considerate false quando non sono presenti nell'IGV, il che può verificarsi in regioni scarsamente mappate. In altri casi, gli eventi rilevati dal filtro a variante nucleotidica singola sono varianti di linea germinale perse.La resequenza indipendente delle mutazioni mediante resequenza mirata è altamente raccomandata per queste mutazioni in cloni selezionati. Dopo il rilevamento di mutazioni somatiche condivise tra cloni, viene generata una matrice binaria, viene costruita una mappa termica contenente cellule con e senza le mutazioni condivise da A a M.L'albero del lignaggio dello sviluppo è indicato. Come passo successivo per il meta presentato qui, i processi mutazionali attivi nelle cellule staminali emopoietiche possono essere determinati utilizzando l'analisi della firma mutazionale.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA Transfection e l&#39;EMSA Analisi su appena isolate umani dei villi citotrofoblasti

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Ricerca

Genetica

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ etichettatura di DNA mitocondriale di replica in Drosophila adulti ovaie di Edu colorazione

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

In pool shRNA schermo per riattivazione di MeCP2 sul cromosoma di X inattivo

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Determinazione dei tassi di decadimento di trascrizione del genoma in fibroblasti umani proliferanti e quiescenti

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolamento, caratterizzazione e MicroRNA-basato di modificazione genetica di cellule staminali del follicolo dentale umano

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identificazione di eventi di ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali del Mouse mediante Southern Blotting e reazione a catena della polimerasi

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Alterazioni di modificazione post-traduzionale istone caratterizzante nel lievito Neurodegenerative Proteinopathy modelli

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequenziamento dell'mRNA da sangue intero utilizzando il sequenziamento di NanoPore

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula e analisi delle isole pancreatiche umane

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...