Name: characterizing mutational load and clonal composition of human blood
Uploaded: 2019-07-11T15:00:00
Duration: 7 min 58 s
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この研究は、オランダ科学研究機構(NWO)のVIDI助成金(No. 016.Vidi.171.023)からR.v.Bに支援されました。

<ol>
	<li>Osorio, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+Reveal+Lineage+Relationships+and+Age-Related+Mutagenesis+in+Human+Hematopoiesis.">Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis.</a> Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Hematopoiesis+and+Blood-Cancer+Risk+Inferred+from+Blood+DNA+Sequence.">Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Clonal+Hematopoiesis+Associated+with+Adverse+Outcomes.">Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).</li><li>Young, A. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150, (2012).</li><li>Jager, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mutation+accumulation+in+single+human+adult+stem+cells+by+whole-genome+sequencing+of+organoid+cultures.">Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures.</a> Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).</li><li>Boeva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control-FREEC:+A+tool+for+assessing+copy+number+and+allelic+content+using+next-generation+sequencing+data.">Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data.</a> Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).</li><li>Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MutationalPatterns:+Comprehensive+genome-wide+analysis+of+mutational+processes.">MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes.</a> Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).</li><li>Thorvaldsd&#243;ttir, H., Robinson, J. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Genomics+Viewer+(IGV):+High-performance+genomics+data+visualization+and+exploration.">Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+human+hematopoietic+stem+cells+capable+of+long-term+multilineage+engraftment.">Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.</a> Science. , (2011).</li><li>Lee-Six, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+of+normal+human+blood+inferred+from+somatic+mutations.">Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations.</a> Nature. 561, 473-478 (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. , (2014).</li></ol>

著者は何も開示していない。

ここでは、個々のHSPCにおける生命の間に蓄積された変異を検出し、これらの変異データを用いて早期発達系統樹を構築する方法を示す。
これらのアッセイを正常に実行するには、いくつかの重要な要件を満たす必要があります。まず、試料の生存率を確保する必要があります。サンプルの速い処理はプロシージャの効率を保障するために重要である。第二に、成長因子の効力の喪失は、HSPCのクローン拡張に悪影響を及ぼす。高成長因子の効力を確保するためには、凍結解凍サイクルを避け、単一使用のアリコートを準備することが重要です。第3に、WGS、突然変異呼び出しおよびフィルタリングを行った後、クローンカルチャのクローナリティを検証することが重要である。培養物のクローン性を確認するために、変異のVAFは、通常の通常のサンプルで0.5の周りにクラスター化する必要があります(図3)。臍帯血HSPCのような低い突然変異負荷を有する細胞では、変異数が少ないためクローン性を決定することはより困難である。
我々のアプローチは、WGSを可能にするために単一細胞のインビトロ拡張に依存しています。したがって、我々のアプローチは、HSPCなど、クローン的に拡張する複製性を持つ細胞に限定されます。私たちの手の中では、すべての単一ソート細胞の約5%-30%が十分に膨張することができる。成長率が低下すると、選択バイアスが発生する可能性があります。前述したように、WGA を使用する方法は、この手法がセルの拡張に依存しないため、この選択バイアスを克服できます。しかし、WGAには独自の欠点があり、クローン増幅は、特に真の体性の低いサンプルにおいて、アレルドロップアウトやゲノムに沿った等しいカバレッジなしでゲノム全体の変異数を正確に決定する唯一の方法です。突然変異番号。
このアプローチを用いて生成されたデータは、図6に示すように、単一細胞で検出された変異が細胞系統を解剖するために使用することができるので、血行系の系統を決定するために使用することができる。通常、1つまたは2つの突然変異は、健全なドナー1の各分岐を定義することができる。系統は受胎後早く分岐するので、これらの最初の分岐を定義する変異は、生殖細胞変異体1、18、19を濾過するために使用された一致した正常サンプル中に低いVAFも存在する。この場合、MSCなどの非血行細胞の使用は、血行系からの発達の非常に早期に分離することが期待されるので好ましい。T細胞は造血起源であるため、生殖細胞変異体を濾過するために一致する正常サンプルとしてこれらの細胞を使用することは、発達系統樹の最も早い分岐の構築を混乱させる可能性がある。特定の成熟した血液集団における分岐特異的変異のサブクローナル存在は、標的深い配列決定によって測定することができ、その分岐の子孫がその成熟細胞型を生み出すことができることを示す。さらに、我々のアプローチは、生体内の変異原性暴露の突然変異的結果を評価し、最終的にこれが白血病の発症にどのように寄与するかを評価することを可能にする。

造血性幹および前駆細胞(HSPC)を内因性または外因性変異源に曝露することは、寿命1の間にDNA中の変異の徐々な蓄積に寄与する。HSPC1における徐々に突然変異が蓄積すると、加齢性クローン型血統症(ARCH)2,3が起こり得る。当初、ARCHを持つ個人は白血病2,3のリスクが高いと考えられていた。しかし、最近の研究では、高齢者4のARCHの95%の発生率が示されており、悪性腫瘍との関連が明らかにならず、ARCHを持つ一部の個人が最終的に悪性腫瘍を発症しないか、または発症しないのかという疑問が生じ始めている。それにもかかわらず、HSPCの体細胞変異は、骨髄異形成障害および白血病が特定の癌ドライバ変異の存在によって特徴付けられるように、深刻な健康上のリスクをもたらす可能性がある。
突然変異過程を同定し、血液クローナリティを研究するためには、個々のHSPCにおける変異蓄積を特徴付ける必要がある。突然変異過程は、ゲノム中に特徴的なパターンを残し、いわゆる変異シグネチャを残し、これは変異のゲノム全体のコレクションで同定および定量することができる5。例えば、紫外線への曝露、アルキル化剤、およびDNA修復経路における欠陥は、それぞれ異なる変異シグネチャ6、7と関連している。さらに、突然変異蓄積の確率的性質のために、獲得した突然変異のほとんど(すべてではないにしても)は細胞間で一意である。変異が同じ個体の複数の細胞間で共有されている場合、これらの細胞が共通の祖先8を共有していることを示す。したがって、共有変異を評価することにより、細胞と発達系統樹と間の系統関係を決定することができ、分岐によって分岐を構築することができる。しかし、生理的に正常な細胞におけるまれな体細胞変異のカタログ化は、健康な組織の多クローン性質のために技術的に困難である。
本例では、個々のHSPCのゲノムにおける体細胞変異を正確に同定し、決定する方法を示す。これには、インビトロでのHSPCの分離とクローン拡張が含まれます。これらのクローン培養は、元の細胞の遺伝的構成を反映する(すなわち、元の細胞の突然変異は、培養中の他のすべての細胞によって共有される)。このアプローチにより、全ゲノムシーケンシング(WGS)に十分なDNAを得ることができる。我々は以前、クローン培養中にインビトロで蓄積された突然変異が細胞のサブセットによって共有されることを示した。これは、インビトロ変異のフィルタリングを可能にし、これらは生体内で獲得された変異9と比較して読み取りの小さな割合で存在する。従来の方法では、全ゲノム増幅(WGA)10を用いたWGSに対して単一細胞から十分なDNAを得ている。しかし、WGAの主な欠点は、ゲノムの比較的誤差がちで不均衡な増幅であり、対立遺伝子のドロップアウト11を引き起こす可能性がある。それにもかかわらず、このアプローチは単一細胞のインビトロ膨張に依存するため、WGA依存的な方法では十分な複製電位を有する血液細胞に限定される。クローナルカルチャをシーケンシングする以前の取り組みは、単一のHSPC12のクローン増幅を確実にするためにフィーダー層を使用することに依存していました。しかし、フィーダー層からのDNAは、クローナル培養物のDNAを汚染する可能性があり、その後の変異の呼び出しとフィルタリングを混乱させる可能性があります。ここで提示される方法は、単一のHSPCをクローン的に拡張するために指定された媒体のみに依存しているため、DNA汚染の問題を回避します。これまで、ヒト骨髄、臍帯血、凍結した骨髄、末梢血に応用してきました。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.20 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Syringe, Luer lock</td>
			<td>BD</td>
			<td>613-3925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301603</td>
			<td>Clone 3.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302005</td>
			<td>Clone 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 BV650</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300467</td>
			<td>Clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 BV421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343609</td>
			<td>561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38 PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303505</td>
			<td>Clone HIT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA PerCP/Cy5.5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304121</td>
			<td>Clone HI100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f PE/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313621</td>
			<td>Clone GoH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328113</td>
			<td>Clone 5E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 5 mL tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR plate, 384w, 130 &#181;L, F-bottom, TC, cover</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61965059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Flt3-Ligand, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-479</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78040.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (2.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78050.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TPO, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-095-752</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (12.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer 2.4</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12440061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>348701</td>
			<td>Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>#07861</td>
			<td>Used for Density gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in at Institute&#39;s facility. Commerically available PBS can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Antibiotic formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>56304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH800S Cell Sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM, 500mL</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mutational load and clonal composition of human blood

造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)は、寿命の間に徐々にDNA変異を蓄積し、白血病などの年齢関連疾患に寄与する可能性があります。突然変異の蓄積を特徴付けすることは、年齢関連疾患の病因の理解を向上させることができる。ここでは、クローン一次細胞培養の全ゲノムシーケンシング(WGS)に基づく個々のHSPCにおける体細胞変異をカタログ化する方法を示す方法を示す。元の細胞に存在する突然変異はクローン培養内のすべての細胞で共有されますが、細胞選別後にインビトロで獲得された変異は細胞のサブセットに存在します。したがって、この方法は、生命の間に蓄積する個々のHSPCのゲノムに存在する体細胞変異の正確な検出を可能にする。体細胞変異のこれらのカタログは、血管組織で活性な変異プロセスに関する貴重な洞察を提供し、これらのプロセスが白血病形成にどのように寄与するかを提供することができます。さらに、同じ個体の複数のHSPC間で共有される体細胞変異を評価することにより、血液集団のクローン系統関係および集団ダイナミクスを決定することができる。このアプローチは単一細胞のインビトロ膨張に依存するので、この方法は十分な複製電位を有する血化細胞に限定される。

実験手順 実験ワークフローを図 1に示します。入力材料のタイプに基づいて、異なる手順に従う必要があります。図2では、臍帯血細胞ソートのフロー細胞測定出力が図示されている。まず、すべての単球細胞は、この集団の周りに緩やかにゲートを描画することによって選択されます。次いで、単一は、線形FSC-H/FSC-A比を持つ細胞に対して選択することによって単離され、より低いFSC-H/FSC-A比は二重または細胞束を含む。染色されていないコントロールサンプルは、系統のセル選別ゲートを定義するために使用されます-, CD34+, CD38-, CD45RA-.さらに、CD90およびCD49fは、前駆細胞または自己更新幹細胞17を区別するために使用することができる(図2)。インデックスの並べ替えにより、個々のセルの再トレースが可能になり、並べ替えられたセルは茶色のドットで表示されます。細胞培養中、個々のクローンは異なるペースで拡大し、一部のクローンは3週間以内に拡大し、他のクローンは培養の第5週まで完全に拡張されます。代表的なコロニーの成長については、図3A,Bを参照してください。代表的な写真は、めっき後11日目にほぼコンフルエントなMSCバルク培養物を示しています(図3C)。
シーケンス解析と変異解析後の品質の確認 Control-FreeC14によって生成されたコピー番号分析の出力の例を示し、コピー番号の変更をチェックします(図4)。角ティクスピック情報は、SNVFI実行中に除外する染色体を示すことができます(ステップ7.6)。SNVFI(図5)によって作成されたVAFプロットは、サンプル中のバリアント対立遺伝子周波数のヒストグラムです。密度プロットのピークが0.5の場合は、サンプルがクローンであることを示します。突然変異の背後にある根本的な生物学的原因についてより多くの洞察を得るために、これらはRパッケージ変異パターン15を使用して分析することができる。ここに描かれているのは、96-トリヌクレオチドプロットを産生する典型的な分析である(図6)。異なる変異タイプの定量化に加えて、シグネチャ抽出もこのツールで実行できます。
発達系統ツリーの構築 クローン間で共有される変異、または生殖細胞系制御のクローン(および低VAF)に存在する変異は、IGVを使用して検証されます。変異は、生殖細胞系の高いVAFレベルではなく、サンプル中に存在する場合に真と見なされます(図7A)。IGV に存在しない場合、変異は偽と見なされ、マッピングが不十分な領域で発生する可能性があります (図 7B)。他のケースでは、SNVFIによって検出された事象は生殖細胞変異を見逃している(図7C)。選択したクローンにおけるこれらの突然変異については、標的再配列決定による変異の独立した再配列化を強く推奨します。 クローン間の共有体細胞変異を検出した後、バイナリマトリックスが生成されます(ステップ10.8)。ヒートマップは、共有変異A-Mの有無にかかわらず細胞を含む構成される。このヒートマップの上に、発達系統ツリーが示されています(図8)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig1.jpg"> 図1:入力材料に基づく実験手順を示すフローチャート。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig2.jpg"> 図 2: セルの並べ替え戦略。まず、小さな単核細胞に対してゲーティングを行います。第二に、単一の細胞は、線形分の選択によってゲートされる。系統陰性細胞がゲートされる。すべての CD34+ CD38- CD45-セルは単一セルソート済みである。茶色の細胞の割合は、オプション「インデックスソート」によって強調表示されたソートされた細胞である、注意する必要があります。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig3.jpg"> 図3:代表的な細胞培養結果。代表的なHSPCクローンは、めっき後2週間後および(B)メッキ後4週間で(A)で384ウェルプレートに入れた。(C)MSC培養2週間後の培地置換。スケールバー = 100 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig4.jpg"> 図4:カリオタイプ。(A) クローンHSPC培養および(B)MSCバルクサンプル。核型は、読み取り深度解析によって決定された。どちらのグラフも、通常のカリオを示す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig4large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig5.jpg"> 図5:バリアント対立遺伝子周波数のヒストグラム。SNVFIの最後のフィルタリングステップ(VAF >0.3)の前のクローンにおけるバリアントのバリアント対立遺伝子頻度のヒストグラム。VAF = 0.5 のピークは、サンプルがクローンであることを示します。VAFが低いサブクローナ変異は、SNVFI(VAF>0.3)の最後のフィルタリングステップ中に除外されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig5large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig6.jpg"> 図6:HSPC試料における体細胞変異の代表的な変異スペクトル解析図示されているのは、各トリヌクレオチド変化(中間塩基が変異している)の全スペクトルに対する相対的な寄与である。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig6large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig7.jpg"> 図7:IGV16を用いて変異を手動検査する。(A) 突然変異は、クローン内に存在し、バルクサンプルに存在しない場合は真と見なされます。(B) 不十分にマッピングされた領域に存在する場合、突然変異は偽陽性と見なされます。(C) 生殖細胞系のコントロールに存在する場合、変異は偽陽性と見なされる。垂直線は、呼び出された突然変異の位置を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig7large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig8.jpg"> 図8:発達系統樹の構築描かれているのは、発達中に分裂した発達系統を示すデンドログラムである。デンドログラムの下のヒートマップは、異なるクローンの突然変異の存在を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig8large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood

ヒト血液の突然変異負荷とクローン組成の特徴付け

細胞内の体性変異パターンは、以前の変異型暴露を反映し、発達系統の関係を明らかにすることができる。ここでは、個々の造血幹細胞および前駆細胞における体細胞変異をカタログ化および分析する方法論を示す。

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) gradually accumulate DNA mutations during a lifespan, which can contribute to age-associated diseases such ...

この方法により、単一造血幹細胞の変異数を正確に特定することができます。これらの突然変異は、突然変異過程を解読し、造血系統を解剖するために使用することができる。我々の方法は、造血幹細胞をインビトロでクローニングすることによって全ゲノム増幅技術の使用を避け、エラー率が低下し、下流分析に利益をもたらす。造血幹細胞のゲノムに存在する突然変異パターンは、変異原性およびそれらが暴露されたDNA修復プロセスを明らかにすることができる。テキストプロトコルに記載されているようにサンプル材料と染色の調製からこの手順を開始し、その後、造血幹細胞および前駆細胞、またはHSPC培地の25ミリリットルを調製する。細胞培養384ウェルプレートに各ウェルに75マイクロリットルのHSPC培養培地を充填する。外側のウェル内の媒体の蒸発を防ぐために、75マイクロリットルの無菌水またはPBSで外ウェルを充填し、細胞の選別のためにこれらの井戸を使用しないでください。実行可能なシグナル HSPCs の正しいソートは、このプロトコルの中で最も重要なステップです。染色されたサンプルから10,000個のセルに未染色コントロールに基づいてHSPCソート用のゲートを設定します。線形前方散乱高さと前方散乱領域の分率の周囲にゲートを描画して、単一セルをゲートします。未染色の制御分数を使用して、線分の分数のゲートを描画します。CD34陽性セルのゲートを描画し、CD38陰性、CD45RA陰性セルに特定のゲートを設定することによって、このサブセットをさらに特徴付けます。ファックス機に384ウェルプレートを積み込み、単一のセルをソートします。FAX マシンに適用可能な場合は、インデックスの並べ替えデータを保持するオプションをオンにして、並べ替えられたセルの再トレースを有効にします。1かまって選別されたHSCを培養するには、384ウェルの培養プレートを透明なポリエチレンラップで蓋で包みます。384ウェルプレートを5%の二酸化炭素で加湿した37°Cインキュベーターに移し、目に見えるクローンが現れるまで3〜4週間インキュベーターに保管します。4週間の培養後、どのウェルが30%以上の合流性を有するかを決定する。各コーンについて、1.5ミリリットルのマイクロチューブを1%BSAおよびPBSの1ミリリットルで予め充填し、対応するウェルに従ってチューブにラベルを付ける。ピペットチップを1%BSAおよびPBSで予め湿潤し、ピペット先端に付着する細胞の数を最小限に抑える。75マイクロリットルに設定された200マイクロリットルのピペットでウェルの底部を削りながら、培地を少なくとも5回上下に激しくピペットします。ウェルに対応するラベル付きマイクロチューブに細胞懸濁液を回収する。新鮮な1%BSAとPBSの最大75マイクロリットルでウェル内でパイプを繰り返し、細胞の最大取り込みが確実になります。クローン培養細胞は、ウェルの底部にくっつくことができます。標準の反転光顕微鏡を使用してウェルを検査し、すべての細胞が収集されたかどうかを確認します。30%以上の合流率を持つすべてのウェルが収穫された場合は、384ウェルプレートをインキュベーターに戻します。クローンの文化は最大5週間増殖する可能性があります。350回gで5分間細胞懸濁液をスピンダウンします。小さなペレットが見えるはずです。上清の約5マイクロリットルを除くすべてを慎重に取り除きます。細胞ペレットはマイナス20度で凍結し、DNA単離前に数ヶ月間保存することができます。系統の第1の枝に存在する突然変異も、バルクサンプル中にサブクローン的に存在する。後の分岐系統は HSPCs 間で共有される変異によってのみ定義されます。クローンのサブセットに存在し、バルク中にサブクローナに存在する突然変異を同定するために、クローン間で共有される体細胞突然変異を第1にフィルター処理する。Unix ベースのターミナルで、フィルターソマティックを編集します。は、pats を設定し、他のパラメータを調整するファイルです。フィルターソマティックを実行します。pi スクリプト。低VAFバルクを決定してバルク中にサブクローナ的に存在する突然変異をフィルター処理する。unix ベースのターミナルで r スクリプトを実行します。これにより、共有およびユニークな単一ヌクレオチドバリアント用の別々のvcfファイルが生成されます。全ての突然変異位置を重ねることによって、バルクサンプルに存在しないクローン間で共有されるすべての突然変異を決定する。IGVを省略した統合ゲノムビューアを使用して手動検査で偽陽性を除外します。突然変異が存在しない場合、突然変異が全てのクローンの生殖細胞系列に存在する場合、または不十分にマッピングされた領域に存在する場合には、偽と見なされます。真の突然変異は、2つのクローン間で共有することも、バルク中にサブクローナに存在することも可能です。ターゲットまたはサンガーシーケンシングを使用して、すべての共有軌跡を個別に再シーケンス化します。共有突然変異を使用して、突然変異と配列化されたクローンのバイナリー表を構築し、その突然変異が存在しないことを示すゼロと、突然変異の存在を示す2つの表を構築する。Rベースの関数を使用してセル間の系統関係を示すデンドログラムと共に、変換バイナリテーブルをヒートマップとして出力する。ヒート マップは、各セルの突然変異状態を示します。コピー番号の変更をチェックするために、制御3 cによって生成されたコピー番号分析の出力例として示します。一塩基変異体フィルタリングによって作成された変異型アレグル画分プロットは、サンプル中の変異型アレーレ周波数のヒストグラムである。密度プロットの 0.5 のピークは、サンプルがクローンであることを示します。ここに示されているのが、96トリヌクレオチドプロットを生成する典型的な変異パターン分析である。異なる突然変異タイプの定量化に加えて、シグネチャ抽出もこのツールで行うことができます。生殖細胞系列制御中のクローン内に存在するクローン間で共有または存在する変異は、IGVを使用して検証される。突然変異は、生殖細胞系列の高い変異アレス頻度レベルではなく、サンプルに存在する場合に真であると考えられる。IGVに存在しない場合、突然変異は偽と見なされ、マッピング不良の領域で起こり得る。他の場合には、一塩基変異体フィルタリングによって検出された事象は、生殖細胞系列変異体を見逃している。標的型再配列による突然変異の独立した再配列決定は、選択されたクローンにおけるこれらの突然変異に対して強く推奨される。クローン間の共有体細胞突然変異の検出後、二項行列が生成され、M.M.を通じて共有突然変異Aを有する細胞と無関係に含むヒートマップが構築される。ここで提示するメタの次のステップとして、造血幹細胞に活性な変異過程は、突然変異性シグネチャ解析を用いて決定することができる。

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

新たに単離したヒト絨毛細胞栄養芽層に対するsiRNAトランスフェクションおよびEMSA分析

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

EDU染色によりショウジョウバエアダルト卵巣内のミトコンドリアDNA複製のその場の標識で

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

プールされた shRNA MeCP2 再アクティブ化非アクティブ X 染色体上の画面

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

ひと線維芽細胞の増殖静止ゲノムワイドな転写減衰率を決定します。

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

分離の特性と人間の歯小嚢細胞のマイクロ Rna を用いた遺伝子組み換え

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

南しみが付くことおよびポリメラーゼの連鎖反応を使用してマウス胚性幹細胞での相同組換えイベントの識別

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

酵母神経変性認知症予備モデルにおけるヒストン翻訳後修飾変化の特性

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

ナノポアシーケンシングを用いた全血からの mRNA の配列決定

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

ヒト膵島の単一細胞RNAシーケンシングと解析

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...