Name: characterizing mutational load and clonal composition of human blood
Uploaded: 2019-07-11T15:00:00
Duration: 7 min 58 s
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이 연구는 네덜란드 과학 연구 기구 (NWO)의 VIDI 보조금에 의해 지원되었다 (No. 016.Vidi.171.023) R. v. B..

<ol>
	<li>Osorio, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+Reveal+Lineage+Relationships+and+Age-Related+Mutagenesis+in+Human+Hematopoiesis.">Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis.</a> Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Hematopoiesis+and+Blood-Cancer+Risk+Inferred+from+Blood+DNA+Sequence.">Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Clonal+Hematopoiesis+Associated+with+Adverse+Outcomes.">Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).</li><li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+haematopoiesis+harbouring+AML-associated+mutations+is+ubiquitous+in+healthy+adults.">Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> Nature Communications. 7, 1-7 (2016).</li><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+Signatures+of+Mutational+Processes+Operative+in+Human+Cancer.">Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer.</a> Cell Reports. 3, 246-259 (2013).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500, 415-421 (2013).</li><li>Alexandrov, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Repertoire+of+Mutational+Signatures+in+Human+Cancer.">The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. 513, 422-425 (2014).</li><li>Blokzijl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mutation+accumulation+in+human+adult+stem+cells+during+life.">Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life.</a> Nature. 538, 260-264 (2016).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+Current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: Current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+identification+of+single-nucleotide+variants+in+whole-genome-amplified+single+cells.">Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells.</a> Nature Methods. 14, 491-493 (2017).</li><li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150, (2012).</li><li>Jager, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mutation+accumulation+in+single+human+adult+stem+cells+by+whole-genome+sequencing+of+organoid+cultures.">Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures.</a> Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).</li><li>Boeva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control-FREEC:+A+tool+for+assessing+copy+number+and+allelic+content+using+next-generation+sequencing+data.">Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data.</a> Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).</li><li>Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MutationalPatterns:+Comprehensive+genome-wide+analysis+of+mutational+processes.">MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes.</a> Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).</li><li>Thorvaldsd&#243;ttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Genomics+Viewer+(IGV):+High-performance+genomics+data+visualization+and+exploration.">Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+human+hematopoietic+stem+cells+capable+of+long-term+multilineage+engraftment.">Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.</a> Science. , (2011).</li><li>Lee-Six, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+of+normal+human+blood+inferred+from+somatic+mutations.">Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations.</a> Nature. 561, 473-478 (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. , (2014).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

여기에 제시된 것은 개별 HSPC에서 수명 동안 축적된 돌연변이를 검출하고 이러한 돌연변이 데이터를 사용하여 초기 발달 혈통 트리를 구성하는 방법이다.
이러한 검정을 성공적으로 수행하기 위해서는 몇 가지 중요한 요구 사항을 충족해야 합니다. 첫째, 샘플의 생존가능성을 보장해야 합니다. 시료의 신속한 처리는 절차의 효율성을 보장하는 열쇠입니다. 둘째, 성장 인자 효능의 손실은 HSPC의 클론 확장에 부정적인 영향을 미칩니다. 높은 성장 인자 효능을 보장 하기 위해, 동결 해동 주기를 방지 하 고 일회용 aliquots를 준비 하는 것이 중요 하다. 셋째, WGS, 돌연변이 호출 및 필터링을 수행 한 후, 클론 배양의 복제성을 확인하는 것이 중요합니다. 배양의 복제를 확인하기 위해, 돌연변이의 VAF는 카요전형 정상 샘플에서 0.5의주위에 클러스터되어야 한다(그림 3). 코드 혈액 HSPC와 같은 낮은 돌연변이 부하를 가진 세포에서는 낮은 돌연변이 수로 인해 복제를 결정하는 것이 더 어렵습니다.
우리의 접근은 WGS를 허용하기 위하여 단 하나 세포의 시험관 내 확장에 의존합니다. 따라서, 우리의 접근은 HSPC와 같은 복제 잠재력이 있는 세포로 제한됩니다. 우리의 손에, 모든 단일 정렬 된 세포의 약 5%-30%는 적당히 확장할 수 있습니다. 증가된 증가율은 잠재적으로 선택 편향을 초래할 수 있습니다. 앞서 설명한 바와 같이, WGA를 사용하는 방법은 이 기술이 세포의 확장에 의존하지 않기 때문에 이러한 선택 편향을 극복할 수 있다. 그러나 WGA는 그 자체의 단점을 가지고 있으며, 클론 증폭은 특히 낮은 진정한 체세포가있는 샘플에서 유전체 탈락및 동등한 범위없이 전체 게놈의 돌연변이 수를 정확하게 결정하는 유일한 방법입니다. 돌연변이 번호.
이 접근법을 사용하여 생성된 데이터는 단일 세포에서 검출된 돌연변이가 도6에 도시된 바와 같이 세포 계수를 해부하는데 사용될 수 있기 때문에 조혈 시스템의 생리를 결정하는데 사용될 수 있다. 전형적으로, 하나 또는 2개의 돌연변이는건강한 기증자 1에 있는 각 가지를 정의할 수 있습니다. 임신 후 일찍 계보 가점 이기 때문에, 이들 제1 분기를 정의하는 돌연변이는 또한 생식선 변이체 1,18,19를필터링하는 데 사용된 일치하는 정상 샘플에서 낮은 VAF로 존재할 것이다. 이 경우, MCS와 같은 비조혈세포의 사용은 조혈시스템에서 개발 중에 매우 일찍 분리될 것으로 예상되기 때문에 바람직하다. T 세포는 조혈 기원의, 생식선 변이체를 필터링하기 위하여 일치하는 정상 견본으로 이 세포의 사용은 그러므로 발달 혈통 트리의 초기 분기의 건축을 혼동할 수 있었습니다. 표적으로 한 깊은 순서에 의해 측정될 수 있는 특정 성숙한 혈액 인구에 있는 분지 특정 돌연변이의 subclonal 존재는, 그 가지의 자손은 그 성숙한 세포 모형을 초래할 수 있다는 것을 표시할 것입니다. 추가적으로, 우리의 접근은 생체내에서 돌연변이 노출의 돌연변이 결과를 평가하고 궁극적으로 이것이 백혈병 발달에 기여할 수 있는 방법을 허용합니다.

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 노출은 내인성 또는 외적 돌연변이 원원에 수명 동안 DNA에 있는 돌연변이의 점진적인축적에 기여합니다 1. HSPC1에서 점진적인 돌연변이 축적은 백혈병-드라이버 돌연변이를 운반하는 HSPC에 의해 구동되는 비증상 상태인 연령과 관련된 클론 조혈(ARCH)2,3을초래할 수 있다. 처음에, ARCH를 가진 개별이 백혈병을 위한 증가한리스크가 있다는 것을 생각되었습니다 2,3. 그러나, 최근 연구는 노인 개인에 있는 ARCH의95%의 부각을 보여주었습니다 4, 악성종양과의 협회를 보다 적게 명확히 하고 ARCH를 가진 몇몇 개별이 결국 악성을 개발하지 않는 이유의 질문을 제기하. 그럼에도 불구하고, HSPC에 있는 체세포 돌연변이는 골수이형성 장애 및 백혈병이 특정 암 드라이버 돌연변이의 존재를 특징으로 하기 때문에, 심각한 건강 위험을 초래할 수 있습니다.
돌연변이 과정을 확인하고 혈액 clonality를 공부하기 위하여는, 개별 HSPC에 있는 돌연변이 축적은 특성화될 필요가 있습니다. 돌연변이 과정은 게놈에 있는 특성 패턴을 남겨, 돌연변이 의 게놈 전체 집합에서 확인되고 정량화될 수 있는 소위 돌연변이 서명5. 예를 들어, UV 광에 노출, 알킬화제, DNA 복구 경로의 결함은 각각 다른돌연변이 시그니처 6,7과연관되어 있다. 또한, 돌연변이 축적의 스토상 특성으로 인해, 후천성 돌연변이의 대부분(전부는 아님)은 세포 들 사이에서 유일하다. 돌연변이가 동일한 개별의 다중 세포 사이에서 공유되는 경우에, 이세포가 일반적인 조상 8을 공유한다는 것을 표시합니다. 따라서, 공유 돌연변이를 평가함으로써, 세포와 발달 혈통 트리 사이에 계보 관계는 가지별로 생성될 수 있다. 그러나, 생리적으로 정상 세포에 있는 희소한 체세포 돌연변이를 분류하는 것은 건강한 조직의 polyclonal 특성 때문에 기술적으로 도전적입니다.
여기에 제시된 것은 개별 HSPC의 게놈에서 체세포 돌연변이를 정확하게 식별하고 결정하는 방법이다. 이것은 시험관에서 HSPC의 격리 그리고 클론 확장을 관련시킵니다. 이러한 클론 배양은 본래 세포의 유전적 구성을 반영한다(즉, 본래 세포의 돌연변이는 배양내의 다른 모든 세포에 의해 공유될 것이다). 이 접근은 우리가 전체 게놈 순서 (WGS)를 위한 충분한 DNA를 장악하는 것을 허용합니다. 우리는 이전에 클론 배양 도중 시험관내에서 축적된 돌연변이가 세포의 부분집합에 의해 공유될 것이라는 점을 보여주었습니다. 이는 생체외 에서 획득한 돌연변이 9에 비해 더 작은 판독분획에 존재할 것이기 때문에모든 시험관내 돌연변이의 필터링을 가능하게 한다. 이전 방법은 전체 게놈 증폭(WGA)10을사용하여 WGS에 대한 단일 세포로부터 충분한 DNA를 얻었다. 그러나, WGA의 주요 단점은 게놈의 상대적으로 오류가 발생하기 쉽고 불균형한 증폭이며, 이는알레일 탈락(11)을 초래할 수 있다. 그럼에도 불구 하 고, 이 접근 은 단일 세포의 생체 외 확장에 의존, 그것은 충분 한 복제 잠재력을 가진 혈액 세포에 제한, WGA 의존적인 방법에 대 한 경우. 클론 문화권 시퀀싱을 위한 이전의 노력은 단일 HSPC12의클론 증폭을 보장하기 위해 피더 레이어를 사용하는 데 의존해 온 것입니다. 그러나, 피더 층에서 DNA는 잠재적으로 클론 배양의 DNA를 오염시킬 수 있고, 후속 돌연변이 호출 및 필터링을 혼동할 수 있습니다. 여기에 제시된 방법은 단독으로 단일 HSPC를 복제하기 위해 지정된 배지에만 의존하므로 DNA 오염 문제를 방지합니다. 지금까지 우리는 인간의 골수, 제대혈, 유능하게 얼어 붙은 골수 및 말초 혈액에이 방법을 성공적으로 적용했습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.20 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Syringe, Luer lock</td>
			<td>BD</td>
			<td>613-3925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301603</td>
			<td>Clone 3.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302005</td>
			<td>Clone 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 BV650</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300467</td>
			<td>Clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 BV421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343609</td>
			<td>561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38 PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303505</td>
			<td>Clone HIT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA PerCP/Cy5.5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304121</td>
			<td>Clone HI100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f PE/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313621</td>
			<td>Clone GoH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328113</td>
			<td>Clone 5E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 5 mL tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR plate, 384w, 130 &#181;L, F-bottom, TC, cover</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61965059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Flt3-Ligand, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-479</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78040.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (2.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78050.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TPO, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-095-752</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (12.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer 2.4</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12440061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>348701</td>
			<td>Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>#07861</td>
			<td>Used for Density gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in at Institute&#39;s facility. Commerically available PBS can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Antibiotic formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>56304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH800S Cell Sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM, 500mL</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mutational load and clonal composition of human blood

조혈 줄기와 전구 세포 (HSPC)는 백혈병과 같은 연령 관련 질병에 기여할 수 있는 수명 도중 DNA 돌연변이를 점차적으로 축적합니다. 돌연변이 축적을 특성화하면 연령과 관련된 질병의 병인에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 클론 1차 세포 배양의 전체 게놈 시퀀싱(WGS)에 기초한 개별 HSPC에서 체세포 돌연변이를 분류하는 방법이다. 본래 세포에 존재하는 돌연변이는 클로날 배양내의 모든 세포에 의해 공유되는 반면, 세포 선별 후 시험관 내에서 획득된 돌연변이는 세포의 하위 집합에 존재한다. 따라서,이 방법은 수명 동안 축적 개별 HSPC의 게놈에 존재하는 체세포 돌연변이의 정확한 검출을 할 수 있습니다. 체세포 돌연변이의 이 카탈로그는 조혈 조직에서 활성화된 돌연변이 프로세스에 귀중한 통찰력을 제공하고 이 프로세스가 백혈구 발생에 어떻게 기여하는지 제공할 수 있습니다. 추가적으로, 동일 개별의 다중 HSPC 사이에서 공유되는 체세포 돌연변이를 평가해서, 혈액 인구의 클론 계보 관계 및 인구 역학은 결정될 수 있습니다. 이 접근법은 단일 세포의 시험관 내 확장에 의존하기 때문에, 방법은 충분한 복제 잠재력을 가진 조혈 세포로 제한된다.

실험 절차 실험 워크플로는 그림1에 설명되어 있습니다. 입력 재료의 유형에 따라 다른 단계를 따라야 합니다. 도 2에서 코드 혈 세포 정렬의 유동 세포 측정 출력이 도시되어 있다. 첫째, 모든 단핵 세포는 느슨하게이 인구 주위에 게이트를 그려선택됩니다. 그런 다음, 싱글트는 더 낮은 FSC-H/FSC-A 비율이 더블트 또는 셀 덩어리를 포함하기 때문에 선형 FSC-H/FSC-A 비율을 가진 셀을 선택하여 단리된다. 스테인드되지 않은 제어 샘플은 계보에 대한 셀 정렬 게이트를 정의하는 데 사용됩니다- ,CD34+, CD38-, CD45RA-. 부가적으로, CD90 및 CD49f는 선조 세포 또는 자가 갱신 줄기세포(17)를 구별하기 위해 사용될 수 있다(도 2). 인덱스 정렬을 사용하면 개별 셀을 다시 추적할 수 있으며 정렬된 셀은 갈색 점으로 표시됩니다. 세포 배양 도중, 개별 클론은 다른 속도로 확장할 수 있습니다, 몇몇 클론은 3 주 안에 확장하는 상태에서, 그밖 클론은 배양의 다섯 번째 주까지만 완전히 확장되는 동안. 대표적인 식민지 의 성장은 그림 3A, B를 참조하십시오. 대표적인 사진은 도금 후 11일 에서 거의 동급MSC벌크 배양에 대한 도시(도 3C).
시퀀싱 및 돌연변이 분석 후 품질 확인 도시된 것은 Control-FreeC14에 의해 생성된 복사 수 분석의 예출력으로, 복사수 변경을 확인한다(도 4). Karyotypic 정보는 SNVFI 실행 중에 제외할 염색체를 나타낼 수 있습니다(단계 7.6). SNVFI에 의해 생성된 VAF 플롯(그림 5)은 샘플에서 변이체 알레르 주파수의 히스토그램이다. 밀도 플롯의 피크가 0.5이면 샘플이 복제임을 나타냅니다. 돌연변이 의 뒤에 근본적인 생물학 원인에 있는 추가 통찰력을 얻기 위하여는, 이들은 R 포장 돌연변이 패턴15를사용하여 분석될 수 있습니다. 여기서 도시된 96-삼뉴클레오티드 플롯을생성하는 전형적인 분석(도 6). 다른 돌연변이 유형의 정량화 외에도 이 도구를 사용하여 시그니처 추출을 수행할 수도 있습니다.
개발 계보 트리 구축 클론 사이에 공유되거나 클론 (및 낮은 VAF에서)에 존재하는 돌연변이는 IGV를 사용하여 검증됩니다. 돌연변이는 생식선에서 높은 VAF 수준이 아닌 시료에 존재할때 사실로 간주된다(도 7A). 돌연변이는 IGV에 존재하지 않을 때 거짓으로 간주되며, 이는제대로 매핑되지 않은 영역에서 발생할 수 있다(그림 7B). 다른 경우에, SNVFI에 의해 검출된 사건은 세균선돌연변이를 놓친다(도 7C). 표적 재염기에 의한 돌연변이의 독립적인 재염기는 선택된 클론에서 이러한 돌연변이에 대해 적극 권장된다.  클론 들 간의 공유 체세포 돌연변이의 검출 후, 이진 매트릭스가 생성된다 (단계 10.8). 히트맵은 공유 돌연변이 A-M의 유무에 관계없이 세포를 포함하는 구성됩니다. 이 히트맵 위에 는 발달 혈통트리가 표시됩니다(그림 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig1.jpg"> 그림 1: 입력 재료를 기반으로 한 실험 절차를 묘사하는 순서도입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig2.jpg"> 그림 2: 셀 정렬 전략. 첫째, 게이팅은 작은 단핵 세포에서 수행됩니다. 둘째, 단일 셀은 선형 분획의 선택에 의해 게이트됩니다. 계보 음세포가 게이트됩니다. 모든 CD34+ CD38- CD45- 셀은 단일 셀 정렬됩니다. 갈색의 셀 의 분율은 "인덱스 정렬"옵션으로 강조 표시된 정렬 된 셀입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig3.jpg"> 도 3: 대표적인 세포 배양 결과. 대표적인 HSPC 클론은 도금 후 2주 후(A) 384웰 플레이트에서 도금 후 4주 후에 클론한다. (C) MSC 배양 후 2 주 간의 중간 교체. 배율 막대 = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig4.jpg"> 그림 4: 카요타입. (A) 클론 HSPC 배양 및 (B) MSC 대량 샘플. 핵종은 읽기 심도 분석에 의해 결정되었다. 두 그래프 모두 karyo전형 정상 샘플을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig5.jpg"> 그림 5: 변이체 말기 주파수의 히스토그램. SNVFI (VAF >0.3)의 마지막 필터링 단계 전에 복제본에서 변이체의 변이체의 히스토그램. VAF = 0.5의 피크는 샘플이 복제임을 나타냅니다. 낮은 VAF를 가진 subclonal 돌연변이는 SNVFI의 마지막 필터링 단계 도중 제외됩니다 (VAF >0.3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig6.jpg"> 도 6: HSPC 샘플에서 체세포 돌연변이의 대표적인 돌연변이 스펙트럼 분석. 묘사된 것은 전체 스펙트럼에 대한 각 삼중뉴클레오티드 변화(중간 염기가 돌연변이되는)의 상대적 기여이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig7.jpg"> 그림 7: IGV16을사용한 돌연변이의 수동 검사. (A) 돌연변이는 대량 샘플이 아닌 복제본에 존재할 때 true로 간주됩니다. (B) 돌연변이는 제대로 매핑되지 않은 영역에 존재할 때 거짓 긍정으로 간주됩니다. (C) 돌연변이는 생식선 대조군에서 존재할 때 거짓 양성으로 간주된다. 수직 선은 호출된 돌연변이의 위치를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig8.jpg"> 그림 8: 개발 계보 트리의 건설. 묘사된 것은 개발 중에 분리되는 발달 혈통을 나타내는 덴드로그램입니다. 덴드로그램 아래의 히트맵은 다른 클론에 돌연변이가 있음을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood

인간의 혈액의 돌연변이 하중과 클론 구성 특성화

세포에 있는 체세포 돌연변이 패턴은 이전 돌연변이 노출을 반영하고 발달 혈통 관계를 밝힐 수 있습니다. 여기에 제시된 개별 조혈 줄기 및 전구 세포에서 체세포 돌연변이를 분류하고 분석하는 방법론이 제시된다.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) gradually accumulate DNA mutations during a lifespan, which can contribute to age-associated diseases such ...

이 방법을 사용하면 단일 조혈 줄기 세포에서 돌연변이 수를 정확하게 결정할 수 있습니다. 이 돌연변이는 돌연변이 프로세스를 해독하고 조혈 혈통을 해부하기 위하여 이용될 수 있습니다. 우리의 방법은 체외에서 조혈 줄기 세포를 복제하여 전체 게놈 증폭 기술의 사용을 방지하여 다운스트림 분석의 오차율과 이점을 초래합니다.조혈 줄기 세포의 게놈에 존재하는 돌연변이 패턴은 그들이 노출된 돌연변이 및 DNA 복구 프로세스를 밝힐 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 샘플 재료의 제조 및 염색으로 이 절차를 시작한 다음 조혈 줄기 및 선조 세포 또는 HSPC 배양 배지의 25 밀리리터를 준비합니다. 각 웰에 75 마이크로리터의 HSPC 배양 배지로 세포 배양 384웰 플레이트를 채웁니다.외부 우물에서 배지의 증발을 방지하기 위해, 멸균 물 또는 PBS의 75 마이크로 리터와 외부 우물을 채우고, 세포 분류에 이러한 우물을 사용하지 마십시오. 실행 가능한 신호 HSPC의 올바른 정렬은 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. 스테인드 샘플에서 10, 000 셀에서 스테인드 되지 않은 제어를 기반으로 HSPC 정렬게이트를 설정합니다.선형 전방 분산 높이 대 전방 분산 영역 분획 주위에 게이트를 그리는 게이트 단일 셀. 스테인드 되지 않은 컨트롤 분획을 사용하여 계보 분수의 게이트를 그립니다. CD34 양수 세포에 대한 게이트를 그리고 CD38 음성, CD45RA 음성 셀에 대한 특정 게이트를 설정하여 이 하위 집합을 더욱 특성화합니다.팩스 기에 384웰 플레이트를 로드하고 단일 셀을 정렬합니다. 팩스 기에 해당하는 경우 인덱스 정렬 데이터를 유지하여 정렬된 셀을 다시 볼 수 있도록 하는 옵션을 전환합니다. SMC를 교양하려면 투명한 폴리에틸렌 랩으로 뚜껑으로 384웰 배양판을 감쌉시다.384웰 플레이트를 5%의 이산화탄소로 가습된 섭씨 37도의 인큐베이터로 옮기고 눈에 보이는 클론이 나타날 때까지 3~4주 동안 인큐베이터에 보관하십시오. 배양 의 4 주 후, 어떤 우물의 합류가 결정 30% 이상. 각 콘에 대해, 1%BSA와 PBS의 1밀리리터로 1.5 밀리리터 마이크로튜브를 미리 채우고 해당 우물에 따라 튜브에 라벨을 붙입니다.파이펫 팁에 달라붙는 셀수를 최소화하기 위해 1%BSA 및 PBS로 파이펫 팁을 미리 적시합니다. 75 마이크로리터로 설정된 200 마이크로리터 파이펫으로 우물 바닥을 긁으면서 배지를 위아래로 5회 이상 격렬하게 피펫합니다. 우물에 해당하는 표지된 마이크로튜브에서 세포 현탁액을 수집합니다.최대 75마이크로리터의 신선한 1%BSA 및 PBS를 사용하여 세포의 최대 섭취량을 보장합니다. 복제 배양 된 세포는 우물의 바닥에 충실 할 수 있습니다. 모든 세포가 수집되었는지 확인하기 위해 표준, 반전 된 빛 현미경을 사용하여 우물을 검사합니다.30% 이상의 응력을 가진 모든 우물이 수확된 경우, 384웰 플레이트를 인큐베이터에 다시 놓습니다. 복제 배양은 최대 5주 동안 증식할 수 있습니다. 세포 현탁액을 350배 g에서 5분간 회전시합니다.작은 펠릿을 볼 수 있어야 합니다. 상체의 약 5 마이크로 리터를 제외한 모든 것을 조심스럽게 제거하십시오. 세포 펠릿은 영하 20도에서 동결되고 DNA 격리 전에 여러 달 동안 보관할 수 있습니다.혈통의 첫 번째 가지에 존재하는 돌연변이는 또한 벌크 샘플에 서브 복제존재될 것이다. 이후 분기 혈통은 HSPC 간에만 공유되는 돌연변이에 의해 정의됩니다. 클론의 하위 집합에 존재하는 돌연변이를 식별하고 대량에 미묘하게 존재하는 돌연변이를 확인하기 위해, 클론 사이에 공유되는 체성 돌연변이에 대한 첫 번째 필터.유닉스 기반 터미널에서 필터링을 편집합니다. ne 파일은 퍼트를 설정하고 다른 매개 변수를 조정합니다. 필터 를 실행합니다.파이 스크립트. 낮은VAF 벌크를 사용하여 대량에서 아끼고 존재하는 돌연변이를 위한 필터. 유닉스 기반 터미널의 r 스크립트입니다.이렇게 하면 공유 및 고유 단일 뉴클레오티드 변이체에 대해 별도의 vcf 파일을 생성합니다. 모든 돌연변이 위치를 겹쳐서 벌크 샘플에 존재하지 않는 클론 간에 공유되는 모든 돌연변이를 결정합니다. 통합 유전체 뷰어를 사용하여 수동 검사로 거짓 긍정을 제외, 약식 IGV.돌연변이는 돌연변이가 모든 클론에 있는 생식선에서 존재할 때 또는 제대로 매핑된 지구에 있을 때 존재하지 않을 때 거짓으로 여겨됩니다. 참된 돌연변이는 2개의 클론 사이에서 공유될 수 있고 또는 대량에서 아끼게 존재할 수 있습니다. 표적 또는 sanger 시퀀싱을 사용하여 공유 된 모든 loci를 독립적으로 다시 시퀀싱합니다.공유 돌연변이를 사용하여 돌연변이가 존재하지 않는다는 것을 나타내는 돌연변이 대 서열 클론대 돌연변이의 이진 테이블을 구축하고 돌연변이의 존재를 나타내는 돌연변이를 나타낸다. 돌연변이 바이너리 테이블을 R 기반 함수를 사용하여 세포 간의 계보 관계를 나타내는 dendrogram과 함께 열 맵으로 출력합니다. 열 맵은 각 셀의 돌연변이 상태를 나타냅니다.복사 번호 변경을 확인하기 위해 제어 3 c에 의해 생성된 복사 번호 해석의 예제 출력으로 도시됨. 단일 뉴클레오티드 변이체 필터링에 의해 생성된 이체 알레일 분획 플롯은 시료내의 이체 알레일 주파수의 히스토그램이다. 밀도 플롯이 0.5의 피크는 샘플이 복제임을 나타냅니다.여기에 묘사된 96개의 트리뉴클레오티드 플롯을 생성하는 전형적인 돌연변이 패턴 분석이 있습니다. 상이한 돌연변이 유형의 정량화 외에도 이 도구를 사용하여 서명 추출을 수행할 수도 있습니다. 클론 사이에 공유되거나 생식선 대조군에서 클론에 존재하는 돌연변이는 IGV를 사용하여 검증된다.돌연변이는 생식선에 있는 높은 변이체 유전자 주파수 수준이 아닌 견본에 존재할 때 사실로 여겨됩니다. 돌연변이는 IGV에 존재하지 않을 때 거짓으로 간주됩니다, 이는 제대로 매핑 된 지역에서 발생할 수 있습니다. 다른 경우에, 단 하나 뉴클레오티드 변이체 필터링에 의해 검출된 사건은 생식선 이체를 놓친다.표적 재퀀싱에 의한 돌연변이의 독립적인 재열은 선택된 클론에 있는 이 돌연변이를 위해 높게 추천됩니다. 클론 간의 공유 체세포 돌연변이를 검출한 후, 이진 매트릭스가 생성되고, M.를 통해 공유 돌연변이 A를 포함하는 열맵이 생성된다. 여기에 제시된 메타에 대한 다음 단계로, 혈우경 줄기 세포에서 활성 돌연변이 과정은 돌연변이 서명 분석을 사용하여 결정될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

갓 고립 된 인간의 산모 Cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 및 EMSA 분석

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

연구

유전학

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

에듀 염색에 의한 초파리 성인 난소에서 미토콘드리아 DNA 복제의 제자리 라벨에

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

풀링된 shRNA MeCP2 재 활성화 비활성화 X 염색체에 대 한 화면

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

확산 및 무부하 인간의 섬유 아 세포의 게놈 넓은 사본 감소율을 결정

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

절연, 특성화 및 예측에 관한 기반 유전자 조작 인간 치과 여 포 줄기 세포의

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

마우스 배아 줄기 세포 사용 하 여 남부 럽 연쇄 반응에서에서 동종 재결합 이벤트의 식별

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

효 모 신경 Proteinopathy 모델에서 특성화 히스톤 포스트 번역 상 수정 변경

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

나노 포어 시퀀싱을 사용 하 여 전 혈에서 mRNA의 시퀀싱

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

단세포 RNA 시퀀싱 및 인간 췌장 섬 분석

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...