Name: characterizing mutational load and clonal composition of human blood
Uploaded: 2019-07-11T15:00:00
Duration: 7 min 58 s
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Este estudo foi apoiado por uma concessão de uma VIDI da organização dos Países Baixos para a investigação científica (NWO) (no. 016. Vidi. 171.023) para R. v. B.

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	<li>Osorio, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+Reveal+Lineage+Relationships+and+Age-Related+Mutagenesis+in+Human+Hematopoiesis.">Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis.</a> Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Hematopoiesis+and+Blood-Cancer+Risk+Inferred+from+Blood+DNA+Sequence.">Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Clonal+Hematopoiesis+Associated+with+Adverse+Outcomes.">Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).</li><li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+haematopoiesis+harbouring+AML-associated+mutations+is+ubiquitous+in+healthy+adults.">Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> Nature Communications. 7, 1-7 (2016).</li><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+Signatures+of+Mutational+Processes+Operative+in+Human+Cancer.">Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer.</a> Cell Reports. 3, 246-259 (2013).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500, 415-421 (2013).</li><li>Alexandrov, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Repertoire+of+Mutational+Signatures+in+Human+Cancer.">The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. 513, 422-425 (2014).</li><li>Blokzijl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mutation+accumulation+in+human+adult+stem+cells+during+life.">Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life.</a> Nature. 538, 260-264 (2016).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+Current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: Current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+identification+of+single-nucleotide+variants+in+whole-genome-amplified+single+cells.">Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells.</a> Nature Methods. 14, 491-493 (2017).</li><li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150, (2012).</li><li>Jager, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mutation+accumulation+in+single+human+adult+stem+cells+by+whole-genome+sequencing+of+organoid+cultures.">Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures.</a> Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).</li><li>Boeva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control-FREEC:+A+tool+for+assessing+copy+number+and+allelic+content+using+next-generation+sequencing+data.">Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data.</a> Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).</li><li>Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MutationalPatterns:+Comprehensive+genome-wide+analysis+of+mutational+processes.">MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes.</a> Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).</li><li>Thorvaldsd&#243;ttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Genomics+Viewer+(IGV):+High-performance+genomics+data+visualization+and+exploration.">Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+human+hematopoietic+stem+cells+capable+of+long-term+multilineage+engraftment.">Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.</a> Science. , (2011).</li><li>Lee-Six, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+of+normal+human+blood+inferred+from+somatic+mutations.">Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations.</a> Nature. 561, 473-478 (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. , (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

É apresentado aqui um método para detectar as mutações que acumularam durante a vida em HSPCs individuais e para construir uma árvore desenvolvente adiantada da linhagem usando estes dados da mutação.
Vários requisitos críticos devem ser atendidos para realizar esses ensaios com sucesso. Em primeiro lugar, a viabilidade da amostra deve ser assegurada. O manuseio rápido da amostra é fundamental para garantir a eficiência do procedimento. Em segundo lugar, a perda da potência do fator de crescimento afetará negativamente a expansão clonal dos HSPCs. Para garantir a alta potência do fator de crescimento, é importante evitar ciclos de congelamento e degelo e preparar alíquotas de uso único. Em terceiro lugar, após a realização de WGS, chamada de mutação e filtragem, é crucial validar a clonalidade da cultura clonal. Para confirmar o clonality da cultura, o VAF das mutações deve agrupar ao redor de 0,5 em uma amostra karyotipicamente normal (Figura 3). Nas células com baixa carga mutacional, como os HSPCs do sangue do cordão umbilical, é mais difícil determinar a clonalidade devido aos baixos números de mutação.
A nossa abordagem baseia-se na expansão in vitro de células individuais para permitir a WGS. Portanto, nossa abordagem é restrita a células que têm o potencial replicativo para expandir clonalmente, como HSPCs. Em nossas mãos, cerca de 5%-30% de todas as células simples-classificadas são capazes de expandir adequadamente. Taxas de crescimento reduzidas podem potencialmente resultar em um viés de seleção. Como discutido previamente, os métodos que usam WGA podem superar este viés da seleção porque esta técnica é não confia na expansão das pilhas. Entretanto, WGA tem suas próprias deficiências, e a amplificação clonal permanece o único método para determinar exatamente o número de mutações no genoma inteiro sem desistências alélicas e a cobertura igual ao longo do genoma, especial nas amostras com baixo somático verdadeiro números de mutação.
Os dados gerados com essa abordagem podem ser utilizados para determinar filogenias do sistema hematopoiético, pois as mutações detectadas em células simples podem ser utilizadas para dissecar linhagens celulares, como descrito na Figura 6. Tipicamente, uma ou dois mutações podem definir cada filial em um doador saudável1. Uma vez que as linhagens se ramificam precocemente após a concepção, mutações que definem esses primeiros ramos também estarão presentes com um baixo VAF na amostra normal combinada que foi utilizada para filtrar as variantes do germline1,18,19. Neste caso, o uso de células não hematopoiéticas, como os MSCs, é preferível, pois eles devem se separar muito cedo durante o desenvolvimento do sistema hematopoiético. Porque as T-pilhas são da origem hematopoietic, o uso destas pilhas como uma amostra normal combinada para filtrar variações do germline poderia conseqüentemente confundir a construção da ramificação a mais adiantada da árvore desenvolvente da linhagem. A presença subclonal de mutações Branch-specific em determinadas populações maduras do sangue, que pode ser medida pelo sequenciamento profundo alvejado, indicará que a progêia desse ramo pode dar origem a esse tipo maduro da pilha. Além disso, nossa abordagem permite avaliar as conseqüências mutacionais da exposição mutagênica in vivo e, em última análise, como isso pode contribuir para o desenvolvimento da leucemia.

A exposição da haste hematopoiética e das células progenitoras (HSPCs) a fontes mutagâmicas endógenas ou extrínmicas contribui para o acúmulo gradual de mutações no DNA durante uma vida útil1. A acumulação gradual da mutação em hspcs1 pode conduzir ao hematopoiese clonal idade-relacionado (arco)2,3, que é uma circunstância não-sintomática conduzida por hspcs que carreg mutações do leucemia-excitador. Inicialmente, pensava-se que indivíduos com arco têm um risco aumentado de leucemia2,3. No entanto, estudos recentes têm demonstrado uma incidência de 95% de ARCH em idosos4, tornando a associação com malignidades menos claras e levantando a questão de por que alguns indivíduos com Arch eventualmente fazer ou não desenvolver malignidades. No entanto, mutações somáticas em HSPCs podem representar sérios riscos à saúde, como distúrbios mielodisplásicos e leucemia são caracterizados pela presença de mutações específicas do condutor de cancro.
Para identificar os processos mutacionais e estudar a clonalidade sanguínea, a acumulação de mutações em HSPCs individuais precisa ser caracterizada. Os processos mutacionais deixam padrões característicos no genoma, as chamadas assinaturas mutacionais, que podem ser identificadas e quantificadas em coleções de mutações em todo o genoma5. Por exemplo, a exposição à luz UV, aos agentes alquilantes e aos defeitos nas vias de reparo do DNA tem sido associada a uma assinatura mutacional diferente6,7. Além, devido à natureza estocástico de acumulações da mutação, a maioria (se não todas) das mutações adquiridas são originais entre pilhas. Se as mutações forem compartilhadas entre várias células do mesmo indivíduo, ela indicará que essas células compartilham um ancestral comum8. Conseqüentemente, avaliando mutações compartilhadas, as relações da linhagem podem ser determinadas entre pilhas e uma árvore desenvolvente da linhagem pode ser filial construída pela filial. Entretanto, catalogar mutações somáticas raras em pilhas fisiologicamente normais é tecnicamente desafiante devido à natureza Polyclonal de tecidos saudáveis.
É apresentado aqui um método para identificar com precisão e determinar mutações somáticas nos genomas de HSPCs individuais. Isto envolve o isolamento e a expansão clonal de HSPCs in vitro. Essas culturas clonais refletem a composição genética da célula original (ou seja, mutações na célula original serão compartilhadas por todas as outras células da cultura). Esta aproximação permite que nós obtenhamos o ADN suficiente para arranjar em seqüência do genoma inteiro (WGS). Nós mostramos previamente que as mutações acumuladas in vitro durante a cultura clonal serão compartilhadas por um subconjunto das pilhas. Isto permite a filtração de todas as mutações in vitro, porque estas estarão atuais em uma fração menor das leituras comparadas às mutações in vivo adquiridas9. Os métodos precedentes obtiveram o ADN suficiente de uma única pilha para WGS usando a amplificação do inteiro-genoma (WGA)10. Entretanto, a desvantagem principal de WGA é sua amplificação relativamente erro-propensa e desequilibrada do genoma, que pode conduzir aos desistentes11do alelo. No entanto, como esta abordagem depende da expansão in vitro de células individuais, limita-se a células sanguíneas com potencial replicativo suficiente, o que não é o caso para os métodos dependentes de WGA. Os esforços mais adiantados que sequenciam culturas clonal confiaram em usar camadas do alimentador para assegurar a amplificação clonal de únicos HSPCs12. No entanto, o DNA das camadas do alimentador pode potencialmente contaminar o DNA das culturas clonais, confunde a chamada de mutação subsequente e filtragem. O método aqui apresentado depende unicamente do meio especificado para expandir clonalmente os HSPCs únicos e, portanto, evita a questão da contaminação do DNA. Até agora, temos aplicado com sucesso este método na medula óssea humana, sangue do cordão umbilical, viável congelado medula óssea, e sangue periférico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.20 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Syringe, Luer lock</td>
			<td>BD</td>
			<td>613-3925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301603</td>
			<td>Clone 3.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302005</td>
			<td>Clone 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 BV650</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300467</td>
			<td>Clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 BV421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343609</td>
			<td>561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38 PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303505</td>
			<td>Clone HIT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA PerCP/Cy5.5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304121</td>
			<td>Clone HI100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f PE/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313621</td>
			<td>Clone GoH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328113</td>
			<td>Clone 5E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 5 mL tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR plate, 384w, 130 &#181;L, F-bottom, TC, cover</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61965059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Flt3-Ligand, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-479</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78040.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (2.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78050.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TPO, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-095-752</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (12.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer 2.4</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12440061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>348701</td>
			<td>Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>#07861</td>
			<td>Used for Density gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in at Institute&#39;s facility. Commerically available PBS can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Antibiotic formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>56304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH800S Cell Sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM, 500mL</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mutational load and clonal composition of human blood

As pilhas hematopoietic da haste e do progenitor (HSPCs) acumulam gradualmente mutações do ADN durante um Lifespan, que possa contribuir às doenças idade-associadas tais como a leucemia. Caracterizar a acumulação da mutação pode melhorar a compreensão da etiologia de doenças idade-associadas. É apresentado aqui um método para catalogar mutações somáticas em HSPCs individuais, que é baseado no sequenciamento do todo-genoma (WGS) de culturas primárias clonais da pilha. As mutações que estão atuais na pilha original são compartilhadas por todas as pilhas na cultura clonal, visto que as mutações adquiridas in vitro após a classificação da pilha estão atuais em um subconjunto das pilhas. Conseqüentemente, este método permite a deteção exata das mutações somáticas atuais nos genomas de HSPCs individuais, que se acumulam durante a vida. Esses catálogos de mutações somáticas podem fornecer insights valiosos sobre processos mutacionais ativos no tecido hematopoiético e como esses processos contribuem para a leucoemogênese. Além, avaliando as mutações somáticas que são compartilhadas entre os HSPCs múltiplos do mesmo indivíduo, as relações clonal da linhagem e a dinâmica da população de populações do sangue podem ser determinadas. Como essa abordagem se baseia na expansão in vitro de células individuais, o método é limitado a células hematopoiéticas com potencial replicativo suficiente.

Procedimento experimental O fluxo de trabalho experimental é representado na Figura 1. Com base no tipo de material de entrada, diferentes etapas devem ser seguidas. Na Figura 2 , uma saída citométrica de fluxo de uma espécie de célula de sangue do cordão umbilical é descrita. Em primeiro lugar, todas as células monocíticas são selecionadas vagamente desenhando uma porta em torno desta população. Em seguida, as singelas são isoladas selecionando-se para as células com uma relação FSC-H/FSC-A linear, uma relação FSC-H/FSC-a mais baixa inclui doublets ou aglomerantes de células. A amostra de controle não manchada é usada para definir os portões de classificação de células para Lineage-, CD34+, CD38-, CD45RA-. Adicionalmente, CD90 e CD49f podem ser usados para distinguir entre células progenitoras ou células-tronco autorenovadas17 (Figura 2). Classificação de índice habilita o re-Tracing de células individuais e as células classificadas são representadas como pontos marrons. Durante a cultura celular, clones individuais podem se expandir em um ritmo diferente, com alguns clones se expandindo dentro de 3 semanas, enquanto outros clones só são totalmente expandidos até a quinta semana de cultura. Ver Figura 3a, B para o crescimento representativo da colônia. Um retrato representativo é mostrado de uma cultura maioria quase confluente do MSC em 11 dias após o chapeamento (Figura 3C).
Verificando a qualidade após sequenciamento e análise de mutação É mostrado um exemplo de saída da análise de número de cópia gerada pelo Control-FreeC14 para verificar as alterações de número de cópia (Figura 4). A informação de karyotypic pode indicar que cromossomas a excluir durante uma corrida de SNVFI (etapa 7,6). O gráfico VAF criado pelo SNVFI (Figura 5) é um histograma de frequências alélicas variantes na amostra. Um pico no gráfico de densidade em 0,5 indica que a amostra é clonal. Para obter mais informações sobre as causas biológicas subjacentes por trás de mutações, elas podem ser analisadas usando o pacote R MutationalPatterns15. Representado aqui é uma análise típica produzindo uma parcela de 96-trinucleotídeo (Figura 6). Além da quantificação de diferentes tipos de mutação, a extração de assinatura também pode ser realizada com esta ferramenta.
Construindo uma árvore de linhagem de desenvolvimento Mutações compartilhadas entre clones ou presentes em um clone (e em baixo VAF) no controle de germline são validadas usando IGV. As mutações são consideradas verdadeiras quando presentes na amostra e não em níveis elevados de VAF na linha germinal (Figura 7a). As mutações são consideradas falsas quando não estão presentes na IGV, o que pode acontecer em regiões mal mapeadas (Figura 7B). Em outros casos, os eventos detectados pelo SNVFI são as mutações do germline perdidas (Figura 7C). O re-sequenciamento independente das mutações pelo re-seqüenciamento alvejado é altamente-recomendado para estas mutações em clones selecionados.  Após a detecção de mutações somáticas compartilhadas entre clones, uma matriz binária é gerada (etapa 10,8). Um heatmap é construído contendo células com e sem as mutações compartilhadas a-M. Acima deste mapa de calor é indicada a árvore de linhagem de desenvolvimento (Figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig1.jpg"> Figura 1: fluxograma representando o procedimento experimental baseado no material de entrada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig2.jpg"> Figura 2: estratégia de classificação de células. Primeiro, a gating é realizada em pequenas células mononucleares. Em segundo lugar, as células individuais são bloqueadas por seleção da fração linear. Células negativas de linhagem são bloqueadas. Todos os CD34+ CD38- CD45- Cells são únicos Cell-Sorted. A fração de células em marrom deve ser anotada, que são as células classificadas destacadas pela opção "classificação do índice". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig3.jpg"> Figura 3: resultados representativos da cultura celular. Clones representativos de HSPC em uma placa do poço 384 em (a) 2 semanas após o chapeamento e (B) 4 semanas após o chapeamento. (C) cultura MSC após 2 semanas de reposição média. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig4.jpg"> Figura 4: cariótipos. (A) cultura CLONAL hspc e (B) MSC Bulk Sample. Os karyotypes foram determinados pela análise da ler-profundidade. Ambos os gráficos indicam uma amostra karyotipicamente normal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig5.jpg"> Figura 5: Histograma de frequências alélicas variantes. Histograma de frequências alélicas variantes das variações em um clone antes da última etapa de filtragem de SNVFI (VAF > 0,3). Um pico na VAF = 0,5 indica que a amostra é clonal. As mutações subclonais com baixo VAF são excluídas durante a última etapa de filtração de SNVFI (VAF > 0.3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig6.jpg"> Figura 6: análise do espectro mutacional representativo de mutações somáticas em uma amostra de HSPC. Representado é a contribuição relativa de cada mudança de trinucleotídeo (da qual a base média é mutada) para o espectro total. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig7.jpg"> Figura 7: inspeção manual de mutações utilizando IGV16. (A) as mutações são consideradas verdadeiras quando presentes no clone e não na amostra a granel. (B) as mutações são consideradas como falsos positivos quando presentes em uma região mal mapeada. (C) as mutações são consideradas como falsos positivos quando presentes em um controle de germline. A linha vertical indica a posição de uma mutação chamada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig8.jpg"> Figura 8: construção de uma árvore de linhagem de desenvolvimento. Representado é um dendrograma que indica linhagens de desenvolvimento que se separam durante o desenvolvimento. O mapa de calor o dendrograma indica a presença de mutações em diferentes clones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig8large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood

Caracterizando a carga mutacional e a composição clonal do sangue humano

Os padrões de mutação somática nas células refletem a exposição mutagênica prévia e podem revelar relações de linhagem de desenvolvimento. Aqui apresentamos uma metodologia para catalogar e analisar mutações somáticas em células hematopoiéticas individuais e progenitoras.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) gradually accumulate DNA mutations during a lifespan, which can contribute to age-associated diseases such ...

Com este método, podemos determinar com precisão o número de mutações em uma única célula-tronco hematopoiética. Essas mutações podem ser usadas para decifrar processos mutacionais e dissecar linhagens hematopoiéticas. Nosso método evita o uso de técnicas de amplificação do genoma inteiro clonando as células-tronco hematopoiéticas in vitro, o que resulta em menores taxas de erro e benefícios à análise a jusante.Os padrões mutacionais presentes nos genomas das células-tronco hematopoiéticas podem revelar os processos de reparação mutagênico e o DNA aos quais foram expostos. Inicie este procedimento com a preparação de material amostral e coloração conforme descrito no protocolo de texto, em seguida, prepare 25 mililitros de haste hematopoiética e célula progenitora, ou meio de cultura HSPC. Encha uma cultura celular 384 bem-placa com 75 microliters de meio de cultura HSPC em cada poço.Para evitar a evaporação do meio nos poços externos, encha os poços externos com 75 microliters de água estéril ou PBS, e não use esses poços para triagem celular. A classificação correta dos HSPCs de sinal viável é o passo mais crítico neste protocolo. Definir portões para a classificação HSPC com base em um controle não manchado em 10.000 células da amostra manchada.Gate únicas células desenhando um portão em torno da altura de dispersão linear para a frente versus fração da área de dispersão para a frente. Use a fração de controle não manchada para desenhar um portão para a fração de linhagem. Desenhe portões para células positivas CD34 e caracterize ainda mais este subconjunto definindo um portão específico para células negativas cd38, CD45RA.Carregue a placa de 384 poços na máquina de fax e classifique células únicas. Se aplicável à máquina de fax, alterne a opção de manter dados de classificação de índices para permitir a retração das células classificadas. Para cultivar HSCs singly ordenado, enrole a placa de cultura 384-well com tampa em plástico de polietileno transparente.Transfira a placa de 384 poços para uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% e mantenha-a na incubadora por três a quatro semanas até que os clones visíveis apareçam. Após quatro semanas de cultivo, determine quais poços têm uma confluência de 30% ou mais. Para cada cone, pré-enchimento 1,5 mililitro microtubos com um mililitro de 1%BSA e PBS e rotular o tubo de acordo com o poço correspondente.Pré-molhar uma ponta de pipeta com 1%BSA e PBS para minimizar o número de células grudadas na ponta da pipeta. Pipeta vigorosamente o meio para cima e para baixo pelo menos cinco vezes enquanto raspa a parte inferior do poço com a pipeta de 200 microliteres fixada em 75 microliters. Colete a suspensão celular no microtubo rotulado que corresponde ao poço.Repita a tubulação no poço com até 75 microliters de 1%BSA fresco e PBS para garantir a absorção máxima das células. Células clonalmente cultivadas podem ficar no fundo do poço. Inspecione os poços usando um microscópio de luz invertido padrão para garantir se todas as células foram coletadas.Se todos os poços com maior confluência de 30% forem colhidos, coloque a placa de 384 poços de volta na incubadora. Culturas clonais podem proliferar por até cinco semanas. Gire a suspensão do celular por cinco minutos a 350 vezes g.Uma pequena pelota deve ser visível. Remova cuidadosamente todos, exceto cerca de cinco microlitrais do supernatante. As pelotas celulares podem ser congeladas a menos 20 graus Celsius e armazenadas por vários meses antes do isolamento do DNA.Mutações presentes nos primeiros ramos da linha também estarão sub clonalmente presentes na amostra a granel. As linhagens posteriores de ramificação são definidas por mutações compartilhadas apenas entre HSPCs. Para identificar mutações presentes em um subconjunto dos clones e subclonaly presentes no volume, primeiro filtro para mutações somáticas compartilhadas entre clones.Em um terminal baseado em Unix, edite o filtrosomáticos. ne arquivo para definir os tapinhas e ajustar os outros parâmetros. Execute o filtrosomáticos.pi script. Filtrar para mutações que estão subclonaly presentes no volume usando o volume determinar lowVAF. r script em um terminal baseado em Unix.Isso gerará arquivos vcf separados para variantes de nucleotídeos únicos compartilhados e únicos. Determine todas as mutações compartilhadas entre clones que não estão presentes na amostra em massa, sobrepondo todas as posições de mutação. Exclua falsos positivos por inspeção manual usando o Visualizador Genômico Integrativo, IGV abreviado.Mutações são consideradas falsas quando não estão presentes quando a mutação está presente na germe em todos os clones ou quando presentes em regiões mal mapeadas. Mutações verdadeiras podem ser compartilhadas entre dois clones ou estar subclonaly presente no volume. Reseqüência de todos os loci compartilhados independentemente usando sequenciamento direcionado ou sanger.Use as mutações compartilhadas para construir uma tabela binária de mutações versus clones sequenciados, com zero indicando que a mutação não está presente e uma indicando presença da mutação. Exatar a tabela binária de mutação como um mapa de calor juntamente com um dendrograma indicando relações de linhagem entre células usando funções baseadas em R. O mapa de calor indica o estado de mutação para cada célula.Mostrado como um exemplo de saída da análise do número de cópia gerada pelo controle três c para verificar se há alterações no número da cópia. O gráfico de fração de alelo variante criado pela filtragem de variantes de nucleotídeos único, é um histograma de frequências de alelos variantes na amostra. Um pico na parcela de densidade em 0,5 indica que a amostra é clonal.Retratado aqui é uma análise típica de padrões mutacionais produzindo uma trama de trinucleotídeos de 96. Além da quantificação de diferentes tipos de mutação, a extração de assinaturas também pode ser realizada com esta ferramenta. Mutações compartilhadas entre clones ou presentes em um clone no controle de germes são validadas usando IGV.Mutações são consideradas verdadeiras quando presentes na amostra e não em altos níveis de frequência de alelo variante na linha germinal. Mutações são consideradas falsas quando não estão presentes no IGV, o que pode acontecer em regiões mal mapeadas. Em outros casos, eventos detectados pela filtragem de variantes de nucleotídeos únicos são variantes germinas perdidas.O resequenciamento independente de mutações por resequenciamento direcionado é altamente recomendado para essas mutações em clones selecionados. Após a detecção de mutações somáticas compartilhadas entre clones, uma matriz binária é gerada, um mapa de calor é construído contendo células com e sem as mutações compartilhadas A através de M.A árvore de linhagem do desenvolvimento é indicada. Como próximo passo para o meta apresentado aqui, processos mutacionais ativos em células-tronco hemopoiéticas podem ser determinados usando análise de assinatura mutacional.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

As análises siRNA transfecção e EMSA sobre recentemente isolados das vilosidades citotrofoblastos Humanos

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Genética

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Rotulagem de replicação de DNA mitocondrial em Drosophila Adulto Ovários por Edu Coloração

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Em pool shRNA tela para reativação de MeCP2 no cromossomo X inativo

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Determinação das taxas de decaimento transcrição de todo o genoma em quiescentes e proliferação de fibroblastos humanos

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolamento, caracterização e baseada em MicroRNA modificação genética de células-tronco humanas folículo Dental

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identificação de eventos de recombinação homóloga em células-tronco embrionárias de camundongo usando Southern Blotting e reação em cadeia da polimerase

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Caracterizando a histona modificação pós-traducional alterações nos modelos de Neurodegenerative Proteinopathy de levedura

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequenciamento de mRNA de sangue total usando sequenciamento de nanoporos

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Sequenciamento de RNA de célula única e análise de ilhotas pancreáticas humanas

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...