Name: characterizing mutational load and clonal composition of human blood
Uploaded: 2019-07-11T15:00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантом VIDI Нидерландской организации научных исследований (NWO) (No 016.Vidi.171.023) на проект R. v. B.

<ol>
	<li>Osorio, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+Reveal+Lineage+Relationships+and+Age-Related+Mutagenesis+in+Human+Hematopoiesis.">Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis.</a> Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Hematopoiesis+and+Blood-Cancer+Risk+Inferred+from+Blood+DNA+Sequence.">Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Clonal+Hematopoiesis+Associated+with+Adverse+Outcomes.">Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).</li><li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+haematopoiesis+harbouring+AML-associated+mutations+is+ubiquitous+in+healthy+adults.">Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> Nature Communications. 7, 1-7 (2016).</li><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+Signatures+of+Mutational+Processes+Operative+in+Human+Cancer.">Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer.</a> Cell Reports. 3, 246-259 (2013).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500, 415-421 (2013).</li><li>Alexandrov, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Repertoire+of+Mutational+Signatures+in+Human+Cancer.">The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. 513, 422-425 (2014).</li><li>Blokzijl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mutation+accumulation+in+human+adult+stem+cells+during+life.">Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life.</a> Nature. 538, 260-264 (2016).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+Current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: Current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+identification+of+single-nucleotide+variants+in+whole-genome-amplified+single+cells.">Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells.</a> Nature Methods. 14, 491-493 (2017).</li><li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150, (2012).</li><li>Jager, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mutation+accumulation+in+single+human+adult+stem+cells+by+whole-genome+sequencing+of+organoid+cultures.">Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures.</a> Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).</li><li>Boeva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control-FREEC:+A+tool+for+assessing+copy+number+and+allelic+content+using+next-generation+sequencing+data.">Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data.</a> Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).</li><li>Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MutationalPatterns:+Comprehensive+genome-wide+analysis+of+mutational+processes.">MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes.</a> Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).</li><li>Thorvaldsd&#243;ttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Genomics+Viewer+(IGV):+High-performance+genomics+data+visualization+and+exploration.">Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+human+hematopoietic+stem+cells+capable+of+long-term+multilineage+engraftment.">Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.</a> Science. , (2011).</li><li>Lee-Six, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+of+normal+human+blood+inferred+from+somatic+mutations.">Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations.</a> Nature. 561, 473-478 (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. , (2014).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Представлен о своей работы метод выявления мутаций, накопленных при жизни в отдельных ГСПК, и построении раннего дерева линии развития с использованием этих данных мутаций.
Для успешного выполнения этих анализов необходимо выполнить ряд критических требований. Во-первых, необходимо обеспечить жизнеспособность выборки. Быстрая обработка образца является ключом к обеспечению эффективности процедуры. Во-вторых, потеря фактора роста потенции негативно скажется на клональном расширении HSPCs. Для обеспечения высокой потенции фактора роста важно избегать циклов замораживания оттепели и готовить одноразовые аликоты. В-третьих, после выполнения WGS, вызова мутации и фильтрации, очень важно проверить клональность клональной культуры. Чтобы подтвердить клональность культуры, VAF мутаций должен кластера около 0,5 в кариотипично нормальный образец (Рисунок 3). В клетках с низкой мутационной нагрузкой, таких как Пуповинная кровь HSPCs, труднее определить клональность из-за низких числа мутаций.
Наш подход опирается на расширение в пробирке одиночных клеток, чтобы обеспечить WGS. Таким образом, наш подход ограничен ячейками, которые имеют репликационный потенциал клонально расширяться, такие как HSPCs. В наших руках около 5%-30% всех односортных ячеек способны адекватно расширяться. Снижение темпов роста потенциально может привести к смещению выбора. Как обсуждалось ранее, методы с использованием WGA может преодолеть этот выбор смещения, как этот метод не опирается на расширение клеток. Тем не менее, WGA имеет свои недостатки, и клональное усиление остается единственным методом точно гостевых мутаций во всем геноме без аллельных отсева и равного охвата вдоль генома, особенно в образцах с низким истинным соматическим мутации чисел.
Данные, генерируемые с помощью этого подхода, могут быть использованы для определения филогений гематопоетической системы, так как мутации, обнаруженные в одиночных клетках, могут быть использованы для вскрытия клеточных линий, как показано на рисунке 6. Как правило, одна или две мутации могут определить каждую ветвь в здоровом доноре1. Так как линии ветви рано после зачатия, мутации, определяющие эти первые ветви также будет присутствовать с низким VAF в соответствующем нормальном образце, который был использован для фильтрации зародышевой варианты1,18,19. В этом случае, использование негематопоэтиных клеток, таких как MSCs, являются предпочтительными, поскольку они, как ожидается, отделить очень рано во время разработки от гематопойетической системы. Поскольку Т-клетки имеют гематопоиетическое происхождение, использование этих клеток в качестве нормального образца для фильтрации вариантов зародышевых линий может таким образом запутать конструкцию самого раннего ветвления дерева девятки. Подклональное присутствие отраслевых мутаций в некоторых зрелых популяциях крови, которые могут быть измерены путем целенаправленного глубокого секвенирования, будет означать, что потомство этой ветви может привести к тому, что зрелый тип клеток. Кроме того, наш подход позволяет оценить мутационные последствия мутагенного воздействия in vivo и, в конечном счете, как это может способствовать развитию лейкемии.

Воздействие гематопоитических стволовых и клеток-прародителей (HSPCs) на эндогенные или экзинсиальные мутагенные источники способствуют постепенному накоплению мутаций в ДНК в течение жизни1. Постепенное накопление мутаций в HSPCs1 может привести к возрастным клональным гематопоесисом (ARCH)2,3, который является несимптоматическим состоянием, обусловленным HSPCs, несущим мутации лейкемии-драйвера. Первоначально считалось, что люди с ARCH имеют повышенный риск развития лейкемии2,3. Тем не менее, недавние исследования показали, заболеваемость 95% ARCH у пожилых людей4, что делает связь с злокачественными новообразованиями менее ясно и поднимая вопрос о том, почему некоторые люди с ARCH в конечном итоге делать или не развивать злокачественные новообразования. Тем не менее, соматические мутации в HSPCs может представлять серьезную опасность для здоровья, как миелодиспластические расстройства и лейкемия характеризуются наличием конкретных мутаций драйвера рака.
Для выявления мутационных процессов и изучения клональности крови необходимо охарактеризовать накопление мутаций в отдельных ГСпС. Мутационные процессы оставляют в геноме характерные закономерности, так называемые мутационные сигнатуры, которые можно выявить и количественно определить в общегеномных коллекциях мутаций5. Например, воздействие УФ-излучения, алкилирующих агентов и дефектов в пути восстановленияДНК были связаны с различными мутационными подписями 6,7. Кроме того, из-за стохастической природы мутационных накоплений, большинство (если не все) приобретенных мутаций являются уникальными между клетками. Если мутации распределяются между несколькими клетками одного и того же человека, это указывает на то, что эти клетки имеют общего предка8. Таким образом, путем оценки общих мутаций, отношения линии могут быть определены между клетками и развития линии дерева могут быть построены ветви по ветке. Однако каталогизация редких соматических мутаций в физиологически нормальных клетках технически сложна из-за поликлонального характера здоровых тканей.
Здесь представлен метод точного выявления и определения соматических мутаций в геномах отдельных ГСпС. Это включает в себя изоляцию и клональное расширение HSPCs in vitro. Эти клональные культуры отражают генетический состав исходной клетки (т.е. мутации в исходной клетке будут разделены всеми другими клетками культуры). Такой подход позволяет нам получить достаточно ДНК для секвенирования всего генома (WGS). Ранее мы показали, что мутации, накопленные в пробирке во время клональной культуры, будут разделены подмножеством клеток. Это позволяет фильтровать все мутации in vitro, так как они будут присутствовать в меньшей части считывания по сравнению с in vivo приобретенных мутаций9. Предыдущие методы получили достаточно ДНК из одной клетки для WGS с использованием всего генома усиления (WGA)10. Однако главным недостатком WGA является его относительно подверженное ошибкам и несбалансированное усиление генома, что может привести к отсевам аллелей11. Тем не менее, поскольку этот подход опирается на расширение в пробирке одиночных клеток, он ограничивается клетками крови с достаточным репликационным потенциалом, что не относится к методам, зависящим от WGA. Ранее усилия секвенирования клональных культур полагались на использование фидерных слоев для обеспечения клонального усиления одного HSPCs12. Тем не менее, ДНК из слоев подачи потенциально может загрязнять ДНК клональных культур, смешивая последующие вызовы мутации и фильтрации. Представленный здесь метод опирается исключительно на указанную среду для клональнического расширения одного HSPCs, и поэтому позволяет избежать проблемы загрязнения ДНК. До сих пор мы успешно применяли этот метод на костном мозге человека, пуповинной крови, жизнеспособно замороженном костном мозге и периферической крови.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.20 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Syringe, Luer lock</td>
			<td>BD</td>
			<td>613-3925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301603</td>
			<td>Clone 3.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302005</td>
			<td>Clone 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 BV650</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300467</td>
			<td>Clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 BV421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343609</td>
			<td>561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38 PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303505</td>
			<td>Clone HIT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA PerCP/Cy5.5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304121</td>
			<td>Clone HI100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f PE/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313621</td>
			<td>Clone GoH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328113</td>
			<td>Clone 5E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 5 mL tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR plate, 384w, 130 &#181;L, F-bottom, TC, cover</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61965059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Flt3-Ligand, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-479</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78040.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (2.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78050.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TPO, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-095-752</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (12.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer 2.4</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12440061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>348701</td>
			<td>Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>#07861</td>
			<td>Used for Density gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in at Institute&#39;s facility. Commerically available PBS can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Antibiotic formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>56304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH800S Cell Sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM, 500mL</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mutational load and clonal composition of human blood

Гематопоиэтические стволовые и клетки-предродители (HSPCs) постепенно накапливают мутации ДНК в течение всей жизни, что может способствовать возрастным заболеваниям, таким как лейкемия. Характеризуетсяе накоплением мутаций может улучшить понимание этиологии возрастных заболеваний. Здесь представлен метод каталогизации соматических мутаций в отдельных HSPCs, который основан на секвенировании всего генома (WGS) клональных первичных клеточных культур. Мутации, присутствующие в исходной клетке, разделяются всеми клетками клональной культуры, в то время как мутации, приобретенные в пробирке после сортировки клеток, присутствуют в подмножестве клеток. Поэтому этот метод позволяет точно выявлять соматические мутации, присутствующие в геномах отдельных ГСпК, которые накапливаются в течение жизни. Эти каталоги соматических мутаций могут дать ценную информацию о мутационных процессах, активных в гематоподитической ткани, и о том, как эти процессы способствуют лейкемогенезу. Кроме того, путем оценки соматических мутаций, которые разделяются между несколькими HSPCs одного и того же человека, клональные родословные отношения и динамика популяции популяций крови могут быть определены. Поскольку этот подход опирается на расширение в пробирке одиночных клеток, метод ограничивается гематоподетические клетки с достаточным ремитивным потенциалом.

Экспериментальная процедура Экспериментальный рабочий процесс изображен на рисунке 1. В зависимости от типа входиного материала необходимо следовать различным шагам. На рисунке 2 показан цитометрический выход пуповинной клетки. Во-первых, все моноцитные клетки выбираются путем свободного рисования ворот вокруг этой популяции. Затем синглеты выделяются, выбирая для ячеек с линейным соотношением FSC-H/FSC-A, так как более низкое соотношение FSC-H/FSC-A включает дублеты или ячейки. Незапятнанный контрольный образец используется для определения ворот сортировки ячеек для линии- ,CD34,CD38-, CD45RA-. Кроме того, CD90 и CD49f могут быть использованы для различения клеток-прародителей или самообновляющихся стволовых клеток17 (рисунок 2). Сортировка индекса позволяет переотслеживать отдельные ячейки, а отсортированные ячейки изображаются как коричневые точки. Во время клеточной культуры, отдельные клоны могут расширяться в другом темпе, с некоторыми клонами расширения в течение 3 недель, в то время как другие клоны только полностью расширены до пятой недели культуры. См Рисунок 3A, B для представительной колонии нарастания. Репрезентативная картина показана почти сливочного MSC объемной культуры на 11 дней после покрытия(Рисунок 3C).
Проверка качества после секвенирования и анализа мутаций Показан пример вывода анализа числа копий, генерируемого Control-FreeC14 для проверки изменений числа копий(рисунок 4). Кариотипическая информация может указывать, какие хромосомы исключить во время выполнения SNVFI (шаг 7.6). Сюжет VAF, созданный SNVFI(Рисунок 5) представляет собой гистограмму частот аллелей в образце. Пик плотности участка в 0,5 указывает на то, что образец является клональным. Чтобы получить более глубокое представление о основных биологических причин, лежащих в основе мутаций, они могут быть проанализированы с помощью пакета R MutationalPatterns15. Изображенный здесь типичный анализ производства 96-тринуклеотидного участка(рисунок 6). В дополнение к количественной оценке различных типов мутаций, извлечение подписи также может быть выполнено с помощью этого инструмента.
Построение девирационного линейного дерева Мутации, общие между клонами или присутствующие в клоне (и при низком VAF) в контроле зародыша проверяются с помощью IGV. Мутации считаются верными при представлении в образце, а не на высоком уровне VAF в зародышевой линии(рисунок 7A). Мутации считаются ложными, когда не присутствуют в IGV, что может произойти в плохо отображенные регионы(рисунок 7B). В других случаях, события, обнаруженные SNVFI пропущенных мутаций зародышевой линии(рисунок 7C). Для этих мутаций в отдельных клонах настоятельно рекомендуется независимое повторное секвенирование мутаций путем целенаправленного повторного секвенирования.  После обнаружения общих соматических мутаций между клонами генерируется двоичная матрица (шаг 10.8). Построена тепловая карта, содержащая клетки с общими мутациями A-M и без нее. Над этой тепловой картой указывается дерево линии развития(рисунок8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig1.jpg"> Рисунок 1: Flowchart, изображающий экспериментальную процедуру, основанную на вхотливном материале. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig2.jpg"> Рисунок 2: Стратегия сортировки ячеек. Во-первых, gating выполняется на небольших моноядерных клетках. Во-вторых, одиночные ячейки закрыты выбором линейной фракции. Линия отрицательных ячеек закрыты. Все КЛЕТКи CD34и CD38- являются одноклеточными. Следует отметить фракцию ячеек в коричневом цвете, которые являются отсортированными ячейками, выделенными вариантом "индексная сортировка". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig3.jpg"> Рисунок 3: Результаты культуры ячейки представителя. Представитель HSPC клонов в 384 хорошо пластины на (A) 2 недели после покрытия и (B) 4 недели после покрытия. (C) MSC культуры после 2 недель средней замены. Шкала бар 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig4.jpg"> Рисунок 4: Кариотипы. (A) Клональная культура HSPC и (B) MSC объемный образец. Кариотипы определялись глубоким анализом чтения. Оба графика указывают на кариотипично нормальный образец. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig5.jpg"> Рисунок 5: Гистограмма частот аллелей варианта. Гистограмма варианта аллели частоты вариантов в клон амплоге до последнего шага фильтрации SNVFI (VAF Пик на VAF 0,5 указывает на то, что образец является клональным. Субклональные мутации с низким VAF исключаются во время последнего этапа фильтрации SNVFI (VAF;0.3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig6.jpg"> Рисунок 6: Репрезентативный анализ мутационного спектра соматических мутаций в образце HSPC. Изображен относительный вклад каждого изменения тринуклеотида (из которых средняя база мутирует) в общий спектр. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig7.jpg"> Рисунок 7: Ручной осмотр мутаций с использованием IGV16. (A) Мутации считаются верными, когда присутствует в клоне, а не в массовом образце. (B) Мутации рассматриваются как ложные срабатывания при представлении в плохо отображенный регион. (C) Мутации считаются ложными срабатываниями при представлении в контроле зародышей. Вертикальная линия указывает на положение так называемой мутации. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig7large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig8.jpg"> Рисунок 8: Строительство девирационного дерева линии. Изображена дендрограмма, указывающая на развитие линий, отделяющихся во время разработки. Тепловая карта под дендрограммой указывает на наличие мутаций в разных клонах. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig8large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood at JoVE.com

Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood

Характеристика мутационной нагрузки и клональная композиция человеческой крови

Соматические мутационные модели в клетках отражают предыдущее мутагенное воздействие и могут выявить родословные развития. Здесь представлена методология каталогизации и анализа соматических мутаций в отдельных гематоподетических стволовых и клетках-прародителях.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) gradually accumulate DNA mutations during a lifespan, which can contribute to age-associated diseases such ...

С помощью этого метода мы можем точно определить количество мутаций в одной гематопоэтической стволовой клетке. Эти мутации могут быть использованы для расшифровки мутационных процессов и вскрытия гематопоэтических линий. Наш метод позволяет избежать использования методов усиления всего генома путем клонирования гематопоэтических стволовых клеток in vitro, что приводит к снижению уровня ошибок и преимуществам анализа ниже по течению.Мутационные модели, присутствующие в геномах гематопоэтических стволовых клеток, могут выявить мутагенные и процессы восстановления ДНК, которым они подверглись. Начните эту процедуру с подготовки образца материала и окрашивания, как описано в текстовом протоколе, а затем подготовить 25 миллилитров гематопоэтического ствола и клетки-прародителя, или HSPC культуры среды. Заполните клеточной культуры 384 хорошо пластины с 75 микролитров HSPC культуры среды в каждой хорошо.Чтобы предотвратить испарение среды во внешних скважинах, заполните внешние скважины 75 микролитров стерильной воды или PBS, и не используйте эти скважины для сортировки клеток. Правильная сортировка жизнеспособных сигналов ГЦП является наиболее важным шагом в этом протоколе. Установите ворота для сортировки HSPC на основе неоплеканного контроля в 10 000 ячеек из окрашенного образца.Ворота одиночных ячеек, рисуя ворота вокруг линейного вперед рассеяния высоты по сравнению с вперед рассеяния области фракции. Используйте незапачканную контрольную фракцию, чтобы нарисовать ворота для фракции линии. Нарисуйте ворота для положительных ячеек CD34 и дополнительно охлив это подмножество, установив конкретные ворота для отрицательных, CD45RA отрицательных ячеек CD38.Загрузите пластину 384-колодец на факс и сортив одиночные ячейки. Если это применимо к факсу, переключите на возможность сохранить данные сортировки индекса, чтобы позволить отследить отсортированные ячейки. Чтобы культура отдельно отсортированы HSCs, оберните 384-ну культуры пластины с крышкой в прозрачной полиэтиленовой пленкой.Перенесите пластину из 384 градусов в увлажненные 37 градусов по Цельсию с 5%-ным углекислым газом и держите ее в инкубаторе в течение трех-четырех недель, пока не появятся видимые клоны. После четырех недель культивирования определите, какие скважины имеют слияние 30% или выше. Для каждого конуса, предварительно заполнить 1,5 миллилитров микротрубки с одним миллилитр 1%BSA и PBS и этикетки трубки в соответствии с соответствующей хорошо.Предварительно мокрый наконечник пипетки с 1%BSA и PBS, чтобы свести к минимуму количество клеток, прилипащих к кончику пипетки. Энергично пипетки среднего вверх и вниз, по крайней мере пять раз, выскаблив дно хорошо с 200 микролитров пипетки установлен на 75 микролитров. Соберите подвеску ячейки в помеченной микротрубки, которая соответствует колодецу.Повторите трубы в колодец с до 75 микролитров свежих 1%BSA и PBS для обеспечения максимального поглощения клеток. Клонально культурные клетки могут прилипать к нижней части колодеца. Осмотрите скважины с помощью стандартного, перевернутого светового микроскопа, чтобы убедиться, что все клетки были собраны.Если были собраны все скважины с более чем 30%-ным слиянием, поместите пластину из 384 скважин обратно в инкубатор. Клональные культуры могут размножаться до пяти недель. Спин вниз клеточной подвески в течение пяти минут при 350 раз г.Небольшая гранула должна быть видна. Аккуратно удалите все, кроме пяти микролитров супернатанта. Клеточные гранулы могут быть заморожены при температуре минус 20 градусов по Цельсию и храниться в течение нескольких месяцев до изоляции ДНК.Мутации, присутствующие в первых ветвях линии, также будут суб клонально присутствовать в основной выборке. Более поздние линии ветвлений определяются мутациями, общими только между ГЦП. Для выявления мутаций, присутствующих в подмножестве клонов и подклено присутствующих в массе, первый фильтр для соматических мутаций, разделяемых между клонами.В терминале на основе Unix отредактировать фильтрсоматику. ne файл для настройки погладить и настроить другие параметры. Запустите фильтрсоматичный.пи сценарий. Фильтр для мутаций, которые подклеонали присутствуют в основной массе с помощью определить низковаф навалом. r скрипт в терминале на основе Unix.Это позволит создавать отдельные файлы vcf для общих и уникальных вариантов одного нуклеотида. Определите все мутации, разделяемые между клонами, которые не присутствуют в основной выборке, перекрывая все позиции мутации. Исключите ложные срабатывания путем ручного осмотра с помощью интегративного геномного зрителя, сокращенного IGV.Мутации считаются ложными, когда их нет, когда мутация присутствует в зародышевой линии во всех клонах или при присутствуют в плохо отображенных регионах. Истинные мутации могут быть разделены между двумя клонами или быть subclonaly присутствует в основной массе. Resequence все общие локусы независимо с помощью целевых или sanger последовательности.Используйте общие мутации, чтобы построить двоичную таблицу мутаций по сравнению с секвенированием клонов, с нулем, указывающим на то, что мутации нет, и одно, указывающее на наличие мутации. Вывод мутации двоичной таблице в качестве тепловой карты вместе с дендрограммой, указывающей линии отношений между клетками, использующими R-функции. Тепловая карта указывает на состояние мутации для каждой клетки.Показан в качестве примера вывода анализа числа копий, генерируемых управлением 3 c для проверки изменений номера копии. Вариант аллельного фракционого участка, созданный одноядеротидной фильтрацией варианта, является гистограммой частоты аллелей вариантов в образце. Пик плотности участка в 0,5 указывает на то, что образец клонирован.Изображенный здесь типичный анализ мутационных моделей, производящий 96 тринуклеотидных сюжетов. В дополнение к количественной оценке различных типов мутаций, удаление подписи также может быть выполнено с помощью этого инструмента. Мутации, разделяемые среди клонов или присутствующие в клоне в контроле зародышевой линии, проверяются с помощью IGV.Мутации считаются верными при присутствуют в образце, а не при высоких уровнях частоты аллелей в зародышевой линии. Мутации считаются ложными, когда они не присутствуют в IGV, что может произойти в плохо отображенных регионах. В других случаях события, обнаруженные при фильтрации одного нуклеотидного варианта, являются пропущенными вариантами зародышевой линии.Для этих мутаций в отдельных клонах настоятельно рекомендуется независимое повторное оплодотворение путем целевого повторного секвестрирования. После обнаружения общих соматических мутаций между клонами генерируется двоичная матрица, строится тепловая карта, содержащая клетки с общими мутациями А и без них через дерево линии развития M.The. В качестве следующего шага для мета представлены здесь, мутационные процессы, активные в гемопоэтических стволовых клеток могут быть определены с помощью анализа мутной подписи.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

миРНК Трансфекция и EMSA Анализы на свежеизолированных ворсинок Cytotrophoblasts человека

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

В Ситу маркировки репликации митохондриальной ДНК в Drosophila взрослых яичников с помощью EDU Окрашивание

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Обобщённые индуцируемый экран для повторной активации MeCP2 на неактивных Х-хромосома

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Определение генома всей стенограммы распада ставок в пролиферирующих и покоя фибробластов

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Высокоэффективные гена срыв мышиных и человека гемопоэтических предшественников клеток ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Изоляция, характеристика и микроРНК основе генетической модификации человека Стоматологическая фолликула стволовых клеток

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Определение события гомологичная рекомбинация в мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием южный Blotting и цепной реакции полимеразы

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Характеризуя гистона столб-поступательные изменения изменения в моделях Neurodegenerative Proteinopathy дрожжей

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Секвенирование мРНК из цельной крови с использованием секвенирования Наноруды

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Одноклеточная РНК секвенирование и анализ островков поджелудочной железы человека

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...