Name: characterizing mutational load and clonal composition of human blood
Uploaded: 2019-07-11T15:00:00
Duration: 7 min 58 s
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Este estudio fue apoyado por una subvención VIDI de la Organización Neerlandesa de Investigación Científica (NWO) (n.o 016.Vidi.171.023) a R. v. B.

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	<li>Osorio, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+Reveal+Lineage+Relationships+and+Age-Related+Mutagenesis+in+Human+Hematopoiesis.">Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis.</a> Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Hematopoiesis+and+Blood-Cancer+Risk+Inferred+from+Blood+DNA+Sequence.">Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Clonal+Hematopoiesis+Associated+with+Adverse+Outcomes.">Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).</li><li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+haematopoiesis+harbouring+AML-associated+mutations+is+ubiquitous+in+healthy+adults.">Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> Nature Communications. 7, 1-7 (2016).</li><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+Signatures+of+Mutational+Processes+Operative+in+Human+Cancer.">Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer.</a> Cell Reports. 3, 246-259 (2013).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500, 415-421 (2013).</li><li>Alexandrov, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Repertoire+of+Mutational+Signatures+in+Human+Cancer.">The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. 513, 422-425 (2014).</li><li>Blokzijl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mutation+accumulation+in+human+adult+stem+cells+during+life.">Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life.</a> Nature. 538, 260-264 (2016).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+Current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: Current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+identification+of+single-nucleotide+variants+in+whole-genome-amplified+single+cells.">Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells.</a> Nature Methods. 14, 491-493 (2017).</li><li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150, (2012).</li><li>Jager, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mutation+accumulation+in+single+human+adult+stem+cells+by+whole-genome+sequencing+of+organoid+cultures.">Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures.</a> Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).</li><li>Boeva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control-FREEC:+A+tool+for+assessing+copy+number+and+allelic+content+using+next-generation+sequencing+data.">Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data.</a> Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).</li><li>Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MutationalPatterns:+Comprehensive+genome-wide+analysis+of+mutational+processes.">MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes.</a> Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).</li><li>Thorvaldsd&#243;ttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Genomics+Viewer+(IGV):+High-performance+genomics+data+visualization+and+exploration.">Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+human+hematopoietic+stem+cells+capable+of+long-term+multilineage+engraftment.">Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.</a> Science. , (2011).</li><li>Lee-Six, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+of+normal+human+blood+inferred+from+somatic+mutations.">Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations.</a> Nature. 561, 473-478 (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. , (2014).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí se presenta un método para detectar mutaciones que se acumularon durante la vida en HSCCP individuales y para construir un árbol de linaje de desarrollo temprano utilizando estos datos de mutación.
Se deben cumplir varios requisitos críticos para realizar correctamente estos ensayos. En primer lugar, debe garantizarse la viabilidad de la muestra. El manejo rápido de la muestra es clave para garantizar la eficiencia del procedimiento. En segundo lugar, la pérdida de potencia del factor de crecimiento afectará negativamente la expansión clonal de los HSCCP. Para asegurar una alta potencia del factor de crecimiento, es importante evitar los ciclos de congelación y descongelación y preparar alícuotas de un solo uso. En tercer lugar, después de realizar EL WGS, la llamada de mutaciones y el filtrado, es crucial validar la clonalidad de la cultura clonal. Para confirmar la clonalidad del cultivo, el VAF de las mutaciones debe agruparse alrededor de 0,5 en una muestra karyotípicamente normal (Figura3). En las células con una carga mutacional baja, como los HSPC de sangre de cordón umbilical, es más difícil determinar la clonalidad debido a los bajos números de mutación.
Nuestro enfoque se basa en la expansión in vitro de células individuales para permitir WGS. Por lo tanto, nuestro enfoque está restringido a las celdas que tienen el potencial replicativo para expandirse clonalmente, como los HSCCP. En nuestras manos, alrededor del 5%-30% de todas las células de una sola vez son capaces de expandirse adecuadamente. La reducción de las tasas de crecimiento puede potencialmente resultar en un sesgo de selección. Como se discutió anteriormente, los métodos que utilizan WGA pueden superar este sesgo de selección, ya que esta técnica no se basa en la expansión de las celdas. Sin embargo, WGA tiene sus propias deficiencias, y la amplificación clonal sigue siendo el único método para determinar con precisión el número de mutaciones en todo el genoma sin abandonos alélicos e igual cobertura a lo largo del genoma, especialmente en muestras con bajo verdadero somático números de mutación.
Los datos generados con este enfoque se pueden utilizar para determinar las filogenias del sistema hematopoyético, ya que las mutaciones detectadas en células individuales se pueden utilizar para diseccionar linajes celulares, como se muestra en la Figura6. Normalmente, una o dos mutaciones pueden definir cada rama en un donante sano1. Desde la ramificación de los linajes al principio después de la concepción, las mutaciones que definenestas primeras ramas también estarán presentes con un VAF bajo en la muestra normal coincidente que se utilizó para filtrar las variantes germinales 1,18,19. En este caso, se prefiere el uso de células no hematopoyéticas, como los MSC, ya que se espera que se separen muy temprano durante el desarrollo del sistema hematopoyético. Como las células T son de origen hematopoyético, el uso de estas células como una muestra normal coincidente para filtrar las variantes de la línea germinal podría, por lo tanto, confundir la construcción de la ramificación más temprana del árbol de linaje del desarrollo. La presencia subclonal de mutaciones específicas de rama en ciertas poblaciones sanguíneas maduras, que se pueden medir mediante una secuenciación profunda dirigida, indicará que la progenie de esa rama puede dar lugar a ese tipo de célula saquemadura. Además, nuestro enfoque permite evaluar las consecuencias mutacionales de la exposición mutagénica in vivo y, en última instancia, cómo esto puede contribuir al desarrollo de la leucemia.

La exposición de células hematopoyéticas del tallo y del progenitor (HSCCP) a fuentes mutagénicas endógenas o extrínsicas contribuye a la acumulación gradual de mutaciones en el ADN durante una vida útil1. La acumulación gradual de mutaciones en los HSCCP1 puede dar lugar a hematopoyesis clonal relacionada con la edad (ARCH)2,3, que es una condición no sintomática impulsada por HSCCP portadores de mutaciones de leucemia-conductor. Inicialmente, se pensó que las personas con ARCH tienen un mayor riesgo de leucemia2,3. Sin embargo, estudios recientes han demostrado una incidencia de95% de ARCH en personas mayores 4, haciendo la asociación con neoplasias malignas menos clara y planteando la cuestión de por qué algunos individuos con ARCH finalmente desarrollan o no neoplasias malignas. No obstante, las mutaciones somáticas en los SSPCCP pueden suponer graves riesgos para la salud, ya que los trastornos mielodisplásicos y la leucemia se caracterizan por la presencia de mutaciones específicas del conductor del cáncer.
Para identificar los procesos mutacionales y estudiar la clonalidad de la sangre, es necesario caracterizar la acumulación de mutaciones en los HSCCP individuales. Los procesos mutacionales dejan patrones característicos en el genoma, las llamadas firmas mutacionales, que pueden ser identificadas y cuantificadas en colecciones de mutacionesdetodo el genoma 5. Por ejemplo, la exposición a la luz UV, los agentes alquiladores y losdefectos en las vías de reparación del ADN se han asociado con una firma mutacional diferente 6,7. Además, debido a la naturaleza estocástica de las acumulaciones de mutaciones, la mayoría (si no todas) de las mutaciones adquiridas son únicas entre las células. Si las mutaciones se comparten entre varias células del mismo individuo, indica que estas células comparten un ancestro común8. Por lo tanto, mediante la evaluación de mutaciones compartidas, las relaciones de linaje se pueden determinar entre las células y un árbol de linaje del desarrollo se puede construir rama por rama. Sin embargo, catalogar mutaciones somáticas raras en células fisiológicamente normales es técnicamente difícil debido a la naturaleza policlonal de los tejidos sanos.
Aquí se presenta un método para identificar y determinar con precisión mutaciones somáticas en los genomas de los HSCCP individuales. Esto implica el aislamiento y la expansión clonal de los HSCCP in vitro. Estos cultivos clonales reflejan la composición genética de la célula original (es decir, las mutaciones en la célula original serán compartidas por todas las demás células del cultivo). Este enfoque nos permite obtener suficiente ADN para la secuenciación del genoma completo (WGS). Hemos demostrado previamente que las mutaciones acumuladas in vitro durante el cultivo clonal serán compartidas por un subconjunto de células. Esto permite el filtrado de todas las mutaciones in vitro, ya que éstasestarán presentes en una fracción más pequeña de las lecturas en comparación con las mutaciones adquiridas in vivo 9. Los métodos anteriores han obtenido suficiente ADN de una sola célula para WGS utilizando amplificación del genoma completo (WGA)10. Sin embargo, la principal desventaja de WGA es su amplificación relativamente propensa a errores y desequilibrada del genoma, que puede resultar en deserciones de alelo11. No obstante, dado que este enfoque se basa en la expansión in vitro de células individuales, se limita a las células sanguíneas con suficiente potencial replicante, lo que no es el caso de los métodos dependientes de WGA. Los esfuerzos anteriores que secuencian cultivos clonales han confiado en el uso de capas de alimentación para garantizar la amplificación clonal de HSCCP individuales12. Sin embargo, el ADN de las capas del alimentador puede potencialmente contaminar el ADN de los cultivos clonales, confundiendo la posterior llamada y filtrado de la mutación. El método presentado aquí se basa únicamente en un medio especificado para ampliar clonalmente los HSCCP únicos y, por lo tanto, evita la emisión de contaminación del ADN. Hasta ahora, hemos aplicado con éxito este método en la médula ósea humana, la sangre del cordón umbilical, la médula ósea congelada de forma visibilidad y la sangre periférica.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.20 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Syringe, Luer lock</td>
			<td>BD</td>
			<td>613-3925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301603</td>
			<td>Clone 3.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302005</td>
			<td>Clone 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 BV650</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300467</td>
			<td>Clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 BV421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343609</td>
			<td>561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38 PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303505</td>
			<td>Clone HIT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA PerCP/Cy5.5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304121</td>
			<td>Clone HI100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f PE/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313621</td>
			<td>Clone GoH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328113</td>
			<td>Clone 5E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 5 mL tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR plate, 384w, 130 &#181;L, F-bottom, TC, cover</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61965059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Flt3-Ligand, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-479</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78040.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (2.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78050.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TPO, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-095-752</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (12.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer 2.4</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12440061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>348701</td>
			<td>Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>#07861</td>
			<td>Used for Density gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in at Institute&#39;s facility. Commerically available PBS can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Antibiotic formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>56304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH800S Cell Sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM, 500mL</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mutational load and clonal composition of human blood

Las células hematopoyéticas del tallo y del progenitor (HSpC) acumulan gradualmente mutaciones de ADN durante su vida útil, lo que puede contribuir a enfermedades asociadas a la edad como la leucemia. Caracterizar la acumulación de mutaciones puede mejorar la comprensión de la etiología de las enfermedades asociadas a la edad. Aquí se presenta un método para catalogar mutaciones somáticas en HSCCP individuales, que se basa en la secuenciación del genoma completo (WGS) de los cultivos celulares primarios clonales. Las mutaciones que están presentes en la célula original son compartidas por todas las células en el cultivo clonal, mientras que las mutaciones adquiridas in vitro después de la clasificación celular están presentes en un subconjunto de células. Por lo tanto, este método permite la detección precisa de mutaciones somáticas presentes en los genomas de los HSCCP individuales, que se acumulan durante la vida. Estos catálogos de mutaciones somáticas pueden proporcionar información valiosa sobre los procesos mutacionales activos en el tejido hematopoyético y cómo estos procesos contribuyen a la leucomogénesis. Además, mediante la evaluación de mutaciones somáticas que se comparten entre múltiples HSCCP del mismo individuo, se pueden determinar las relaciones de linaje clonal y la dinámica poblacional de las poblaciones sanguíneas. Como este enfoque se basa en la expansión in vitro de células individuales, el método se limita a las células hematopoyéticas con suficiente potencial replicativo.

Procedimiento experimental El flujo de trabajo experimental se muestra en la Figura1. En función del tipo de material de entrada, se deben seguir diferentes pasos. En la Figura 2 se representa una salida citométrica de flujo de una ordenación de células sanguíneas de cordón umbilical. En primer lugar, todas las celdas monocíticas se seleccionan dibujando libremente una puerta alrededor de esta población. Luego, los singlets se aíslan seleccionando para celdas con una relación lineal FSC-H/FSC-A, ya que una relación FSC-H/FSC-A más baja incluye dobletes o grupos celulares. La muestra de control no manchado se utiliza para definir puertas de clasificación de celdas para linaje-, CD34+, CD38-, CD45RA-. Además, CD90 y CD49f se pueden utilizar para distinguir entre células progenitoras o células madre autorenovadoras17 (Figura2). La ordenación de índices permite el reseguimiento de celdas individuales y las celdas ordenadas se representan como puntos marrones. Durante el cultivo celular, los clones individuales pueden expandirse a un ritmo diferente, con algunos clones expandiéndose en 3 semanas, mientras que otros clones solo se expanden completamente hasta la quinta semana de cultivo. Vea la Figura 3A,B para el crecimiento representativo de la colonia. Se muestra una imagen representativa de un cultivo a granel MSC casi confluente a los 11 días después del revestimiento (Figura3C).
Comprobación de la calidad después de la secuenciación y el análisis de mutaciones Se muestra una salida de ejemplo del análisis del número de copia generado por Control-FreeC14 para comprobar las alteraciones del número de copia (Figura4). La información cariotípica puede indicar qué cromosomas excluir durante una carrera SNVFI (paso 7.6). La gráfica VAF creada por SNVFI (Figura 5) es un histograma de frecuencias de alelos variantes en la muestra. Un pico en la gráfica de densidad en 0,5 indica que la muestra es clonal. Para obtener más información sobre las causas biológicas subyacentes detrás de las mutaciones, estas se pueden analizar utilizando el paquete R MutationalPatterns15. Aquí se muestra un análisis típico que produce unagráfica de 96-trinucleótido (Figura 6). Además de la cuantificación de diferentes tipos de mutaciones, la extracción de firmas también se puede realizar con esta herramienta.
Construcción de un árbol de linaje de desarrollo Las mutaciones compartidas entre clones o presentes en un clon (y en VAF bajo) en el control de la línea germinal se validan mediante IGV. Las mutaciones se consideran verdaderas cuando están presentes en la muestra y no en niveles altos de VAF en la línea germinal (Figura7A). Las mutaciones se consideran falsas cuando no están presentes en IGV, lo que puede ocurrir en regiones mal mapeadas (Figura7B). En otros casos, los eventos detectados por SNVFI son mutaciones germinales perdidas (Figura7C). La resecuenciación independiente de mutaciones mediante la resecuenciación dirigida es muy recomendable para estas mutaciones en clones seleccionados.  Después de la detección de mutaciones somáticas compartidas entre clones, se genera una matriz binaria (paso 10.8). Se construye un mapa de calor que contiene células con y sin las mutaciones compartidas A-M. Por encima de este mapa de calor se indica el árbol de linaje del desarrollo (Figura8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig1.jpg"> Figura 1: Diagrama de flujo que representa el procedimiento experimental basado en el material de entrada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig2.jpg"> Figura 2: Estrategia de clasificación de celdas. En primer lugar, el gating se realiza en pequeñas células mononucleares. En segundo lugar, las celdas individuales se anegan por selección de la fracción lineal. Las celdas negativas de linaje están cerradas. Todas las células CD34+ CD38- CD45- están ordenadas en una sola celda. Se debe observar la fracción de las células en marrón, que son las celdas ordenadas resaltadas por la opción "clasificación de índice". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig3.jpg"> Figura 3: Resultados representativos del cultivo celular. Clones representativos de HSPC en una placa de pozo 384 a (A) 2 semanas después del chapado y (B) 4 semanas después del enchapado. (C) Cultivo MSC después de 2 semanas de reemplazo medio. Barra de escala a 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig4.jpg"> Figura 4: Cariotipos. (A) Cultivo Clonal HSPC y (B) muestra a granel MSC. Los cariotipos se determinaron mediante un análisis de lectura a profundidad. Ambos gráficos indican una muestra karyotípicamente normal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig5.jpg"> Figura 5: Histograma de frecuencias de alelos variantes. Histograma de frecuencias de alelos variantes de las variantes en un clon antes del último paso de filtrado de SNVFI (VAF >0.3). Un pico en VAF a 0,5 indica que la muestra es clonal. Las mutaciones subclonales con VAF bajo se excluyen durante el último paso de filtrado de SNVFI (VAF >0.3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig6.jpg"> Figura 6: Análisis representativo del espectro mutacional de mutaciones somáticas en una muestra de HSPC. Se representa la contribución relativa de cada cambio de trinucleótido (del cual la base media está mutada) al espectro total. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig7.jpg"> Figura 7: Inspección manual de mutaciones mediante IGV16. (A) Las mutaciones se consideran verdaderas cuando están presentes en el clon y no en la muestra masiva. (B) Las mutaciones se consideran falsos positivos cuando están presentes en una región mal mapeada. (C) Las mutaciones se consideran falsos positivos cuando están presentes en un control germinal. La línea vertical indica la posición de una mutación llamada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig8.jpg"> Figura 8: Construcción de un árbol de linaje de desarrollo. Representado es un dendrograma que indica que los linajes de desarrollo se separan durante el desarrollo. El mapa de calor bajo el dendrograma indica la presencia de mutaciones en diferentes clones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood

Caracterización de la carga mutacional y la composición clonal de la sangre humana

Los patrones de mutación somática en las células reflejan la exposición mutagénica anterior y pueden revelar relaciones de linaje del desarrollo. Aquí se presenta una metodología para catalogar y analizar mutaciones somáticas en células madre hematopoyéticas individuales y células progenitoras.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) gradually accumulate DNA mutations during a lifespan, which can contribute to age-associated diseases such ...

Con este método, podemos determinar con precisión el número de mutaciones en una sola célula madre hematopoyética. Estas mutaciones se pueden utilizar para descifrar procesos mutacionales y diseccionar linajes hematopoyéticos. Nuestro método evita el uso de técnicas de amplificación del genoma completo mediante la clonación de las células madre hematopoyéticas in vitro, lo que resulta en menores tasas de error y beneficia el análisis posterior.Los patrones mutacionales presentes en los genomas de las células madre hematopoyéticas pueden revelar los procesos mutagénicos y de reparación del ADN a los que fueron expuestos. Comience este procedimiento con la preparación de material de muestra y la tinción como se describe en el protocolo de texto, luego prepare 25 mililitros de tallo hematopoyético y célula progenitora, o medio de cultivo HSPC. Llenar un cultivo celular 384 bien-placa con 75 microlitros de medio de cultivo HSPC en cada pozo.Para evitar la evaporación del medio en los pozos exteriores, llene los pozos exteriores con 75 microlitros de agua estéril o PBS, y no utilice estos pozos para la clasificación celular. La clasificación correcta de HSPC de señal viable es el paso más crítico en este protocolo. Establezca puertas para la clasificación HSPC basadas en un control no manchado en 10.000 celdas de la muestra manchada.Puerta de celdas individuales dibujando una puerta alrededor de la altura de dispersión hacia delante lineal frente a la fracción de área de dispersión hacia adelante. Utilice la fracción de control no mantenida para dibujar una puerta para la fracción de linaje. Dibuje puertas para celdas positivas CD34 y caracterice aún más este subconjunto estableciendo una puerta específica para las células negativas CD38 negativas, CD45RA.Cargue la placa de 384 pozos en la máquina de fax y clasifre las celdas individuales. Si es aplicable al equipo de fax, active la opción para mantener los datos de ordenación de índices para habilitar el retroceso de las celdas ordenadas. Para cultivar HSC clasificados por separado, envuelva la placa de cultivo de 384 pozos con tapa en envoltura de polietileno transparente.Transfiera la placa de 384 pozos a una incubadora humidificada de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono y manténgala en la incubadora durante tres a cuatro semanas hasta que aparezcan clones visibles. Después de cuatro semanas de cultivo, determinar qué pozos tienen una confluencia de 30%o superior. Para cada cono, rellene previamente microtubos de 1,5 mililitros con un mililitro de 1%BSA y PBS y e etiquete el tubo según el pozo correspondiente.Pre-mojar una punta de pipeta con 1%BSA y PBS para minimizar el número de células que se pegan a la punta de la pipeta. Pipetee vigorosamente el medio hacia arriba y hacia abajo al menos cinco veces mientras raspa la parte inferior del pozo con la pipeta de 200 microlitros en 75 microlitros. Recoger la suspensión celular en el microtubo etiquetado que corresponde al pozo.Repita la tubería en el pozo con hasta 75 microlitros de 1%BSA y PBS frescos para asegurar la máxima absorción de células. Las células cultivadas clonalmente pueden adherirse al fondo del pozo. Inspeccione los pozos utilizando un microscopio de luz invertido estándar para asegurarse de que se han recogido todas las células.Si se han cosechado todos los pozos con una confluencia superior al 30%, vuelva a colocar la placa de 384 pozos en la incubadora. Las culturas clonales pueden proliferar hasta por cinco semanas. Gire hacia abajo la suspensión celular durante cinco minutos a 350 veces g.Un pequeño pellet debe ser visible. Retire con cuidado todos los microlitros del sobrenadante, excepto unos cinco. Los pellets celulares pueden congelarse a menos 20 grados centígrados y almacenarse durante varios meses antes del aislamiento del ADN.Las mutaciones presentes en las primeras ramas del lineagery también estarán presentes sub clonalmente en la muestra a granel. Los linajes de bifurcación posteriores se definen por mutaciones compartidas únicamente entre HSPC. Para identificar mutaciones que están presentes en un subconjunto de los clones y subclonaly presentes en el volumen, primer filtro para mutaciones somáticas compartidas entre clones.En un terminal basado en Unix, edite el filtersomatic. ne para establecer los pats y ajustar los demás parámetros. Ejecute el filtersomatic.pi script. Filtrar para las mutaciones que están subclonaly presentes en el volumen utilizando el bajo bajovaF a granel. r script en un terminal basado en Unix.Esto generará archivos vcf separados para variantes de nucleótidos únicas y compartidas. Determinar todas las mutaciones compartidas entre clones que no están presentes en la muestra a granel, superponiendo todas las posiciones de mutación. Excluya falsos positivos mediante inspección manual mediante Visor Genómico Integrativo, abreviado IGV.Las mutaciones se consideran falsas cuando no están presentes cuando la mutación está presente en la línea germinal en todos los clones o cuando están presentes en regiones mal mapeadas. Las mutaciones verdaderas pueden compartirse entre dos clones o estar subclonificados a granel. Resecuenciar todos los loci compartidos de forma independiente mediante la secuenciación dirigida o sanger.Utilice las mutaciones compartidas para construir una tabla binaria de mutaciones frente a clones secuenciados, con cero que indique que la mutación no está presente y una que indica la presencia de la mutación. Salida de la tabla binaria de mutación como un mapa de calor junto con un dendrograma que indica las relaciones de linaje entre las células mediante funciones basadas en R. El mapa de calor indica el estado de mutación de cada célula.Se muestra como una salida de ejemplo del análisis de número de copia generado por el control tres c para comprobar si hay alteraciones del número de copia. La gráfica de fracción de alelo variante creada por un solo filtrado de variantes de nucleótidos, es un histograma de frecuencias de alelo variante en la muestra. Un pico en la gráfica de densidad en 0,5 indica que la muestra es clonal.Aquí se representa un análisis típico de patrones mutacionales que produce una gráfica de 96 trinucleótidos. Además de la cuantificación de diferentes tipos de mutaciones, la extracción de firmas también se puede realizar con esta herramienta. Las mutaciones compartidas entre clones o presentes en un clon en el control de la línea germinal se validan mediante IGV.Las mutaciones se consideran verdaderas cuando están presentes en la muestra y no a niveles altos de frecuencia de alelos variantes en la línea germinal. Las mutaciones se consideran falsas cuando no están presentes en el IGV, lo que puede ocurrir en regiones mal mapeadas. En otros casos, los eventos detectados por el filtrado de variantes de nucleótidos individuales se pierden variantes germinales.La resecuenciación independiente de mutaciones mediante la resecuenciación dirigida es muy recomendable para estas mutaciones en clones seleccionados. Después de la detección de mutaciones somáticas compartidas entre clones, se genera una matriz binaria, se construye un mapa de calor que contiene células con y sin las mutaciones compartidas A a M.Se indica el árbol de linaje de desarrollo. Como siguiente paso para el meta presentado aquí, los procesos mutacionales activos en células madre hemopoyéticas se pueden determinar mediante el análisis de firma mutacional.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Los análisis de siRNA transfección y EMSA en recién aisladas vellosos citotrofoblastos Humanos

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Investigación

Genética

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ marcaje de ADN mitocondrial de replicación en Drosophila ovarios adultos por Edu tinción

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

ShRNAs combinados pantalla para reactivación de MeCP2 en el cromosoma de X inactivo

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Determinar tasas de decaimiento de transcripción del genoma en quietos y proliferación de fibroblastos humanos

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Aislamiento, caracterización y MicroRNA basado en la modificación genética de las células madre del folículo Dental humano

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identificación de eventos de recombinación homóloga en células madre embrionarias del ratón mediante Southern blot y reacción en cadena de polimerasa

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Caracterización de la histona modificación post-translacional alteraciones en modelos neurodegenerativos Proteinopathy de levadura

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Secuenciación de ARNm de sangre entera utilizando secuenciación de nanoporos

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Secuenciación y análisis de islotes pancreáticos humanos de una sola célula

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...