Name: characterizing mutational load and clonal composition of human blood
Uploaded: 2019-07-11T15:00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood at JoVE.com

Bu çalışmada Hollanda bilimsel araştırmalar Örgütü (NWO) (No. 016. vidi. 171.023) için R. v. B 'ye ait bir VIDI hibe tarafından destekleniyordu.

<ol>
	<li>Osorio, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+Reveal+Lineage+Relationships+and+Age-Related+Mutagenesis+in+Human+Hematopoiesis.">Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis.</a> Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Hematopoiesis+and+Blood-Cancer+Risk+Inferred+from+Blood+DNA+Sequence.">Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).</li><li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Clonal+Hematopoiesis+Associated+with+Adverse+Outcomes.">Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).</li><li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+haematopoiesis+harbouring+AML-associated+mutations+is+ubiquitous+in+healthy+adults.">Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> Nature Communications. 7, 1-7 (2016).</li><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+Signatures+of+Mutational+Processes+Operative+in+Human+Cancer.">Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer.</a> Cell Reports. 3, 246-259 (2013).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500, 415-421 (2013).</li><li>Alexandrov, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Repertoire+of+Mutational+Signatures+in+Human+Cancer.">The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. 513, 422-425 (2014).</li><li>Blokzijl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mutation+accumulation+in+human+adult+stem+cells+during+life.">Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life.</a> Nature. 538, 260-264 (2016).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+Current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: Current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+identification+of+single-nucleotide+variants+in+whole-genome-amplified+single+cells.">Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells.</a> Nature Methods. 14, 491-493 (2017).</li><li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150, (2012).</li><li>Jager, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mutation+accumulation+in+single+human+adult+stem+cells+by+whole-genome+sequencing+of+organoid+cultures.">Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures.</a> Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).</li><li>Boeva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control-FREEC:+A+tool+for+assessing+copy+number+and+allelic+content+using+next-generation+sequencing+data.">Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data.</a> Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).</li><li>Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MutationalPatterns:+Comprehensive+genome-wide+analysis+of+mutational+processes.">MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes.</a> Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).</li><li>Thorvaldsd&#243;ttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Genomics+Viewer+(IGV):+High-performance+genomics+data+visualization+and+exploration.">Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+human+hematopoietic+stem+cells+capable+of+long-term+multilineage+engraftment.">Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.</a> Science. , (2011).</li><li>Lee-Six, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+of+normal+human+blood+inferred+from+somatic+mutations.">Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations.</a> Nature. 561, 473-478 (2018).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes.">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. , (2014).</li></ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Burada sunulan, bireysel hkms 'de yaşam sırasında birikmiş mutasyonları tespit etmek ve bu mutasyon verilerini kullanarak erken gelişimsel soy ağacı oluşturmak için bir yöntemdir.
Bu işlemleri başarıyla gerçekleştirmek için birkaç kritik gereksinim karşılanması gerekir. İlk olarak, numunenin canlılığı sağlanmalıdır. Numunenin hızlı işlenmesi, prosedürün verimliliğini sağlamak için anahtardır. İkinci olarak, büyüme faktörü gücü kaybı HSPCs 'in klonal genişlemesini olumsuz yönde etkileyecektir. Yüksek büyüme faktörü potens sağlamak için, donma-çözülme döngüleri önlemek ve tek kullanımlık aliquots hazırlamak önemlidir. Üçüncü, WGS yaptıktan sonra, mutasyon arama ve filtreleme, klonal kültürün klonallık doğrulamak için çok önemlidir. Kültürün klonallık onaylamak için, mutasyonların VAF etrafında küme olmalıdır 0,5 karyotypically normal bir örnek (Şekil 3). Kordon kanı HSPCs gibi düşük mutasyonel yükü olan hücrelerde, düşük mutasyon numaraları nedeniyle klonallık belirlemek daha zordur.
Yaklaşımımız WGS için izin vermek için tek hücrelerin in vitro genişlemesine dayanır. Bu nedenle, yaklaşımımız, HSPCs gibi genişletmek için çoğallandırıcı potansiyele sahip hücrelere sınırlıdır. Bizim elimizde, tüm tek sıralı hücrelerin yaklaşık% 5-30% yeterince genişletmek edebiliyoruz. Azaltılmış büyüme oranları olası bir seçim önyargı neden olabilir. Daha önce de anlatıldığı gibi, bu teknik hücrelerin genişlemesine güvenmiyorsa, WGA kullanan Yöntemler bu seçim önyargı üstesinden gelebilir. Ancak, WGA kendi eksiklikleri vardır, ve klonal amplifikasyon doğru tüm genom içinde allelik bırakma ve genom boyunca eşit kapsama olmadan mutasyonların sayısını belirlemek için tek yöntem kalır, özellikle düşük gerçek somatik örnekleri mutasyon numaraları.
Bu yaklaşım kullanılarak oluşturulan veriler, tek hücrelerde algılanan mutasyonlar, Şekil 6' da tasvir edilen hücre sırlarını incelemek için kullanılabiliyor olduğu için, hematopoetik sistemin phylogenlerini belirlemek için kullanılabilir. Tipik olarak, bir veya iki mutasyon sağlıklı bir bağışçı1her şube tanımlayabilir. Bu yana, ilk dalları tanımlayan mutasyonlar, germline türevleri1,18,19filtreleme için kullanılan eşleşen normal örnekteki düşük VAF ile de mevcut olacaktır. Bu durumda, onlar hematopoetik sistemden gelişimi sırasında çok erken ayırmak için bekleniyor olarak MSCs gibi olmayan-hematopoetik hücrelerin kullanımı, tercih edilir. T-hücreler hematopoetik Orijin olduğu için, bu hücrelerin, germline türevleri filtrelemek için eşleşen normal bir örnek olarak kullanımı, bu nedenle gelişimsel soy ağacının en erken dallanma yapımında konabilir. Belirli olgun kan nüfusa şube özgü mutasyonların subclonal varlığı, hangi hedeflenen derin sıralamayı ile ölçülebilir, bu şube gençliğinde bu olgun hücre türüne yol verebilir gösterecektir. Buna ek olarak, yaklaşımımız, mutajisik pozlama içinde vivo ve sonuçta bunun lösemi gelişimine nasıl katkıda bulunabileceği mutasyonel sonuçları değerlendirmek için izin verir.

Hematopoetik kök ve progenitör hücrelerinin (hspcs) endojen veya ekstrensek mutajenik kaynaklara maruz kalması,1ömrü boyunca DNA 'daki mutasyonların kademeli olarak birikmesine katkıda bulunur. Hspcs1 ' deki kademeli mutasyon birikimi, lösemi-sürücü mutasyonları taşıyan hspcs tarafından tahrik edilen semptomatik olmayan bir durum olan yaşla ilgili klonal hematopoezinin (Arch)2,3' te sonuçlanabilmektedir. Başlangıçta, kemer ile bireylerin lösemi için artan bir risk olduğunu düşünülmektedir2,3. Ancak, son çalışmalar eski bireyler4arch% 95 bir insidansı göstermiştir, malignite daha az net ile dernek yapma ve neden Arch ile bazı bireyler sonunda ya da malignite geliştirmek değil neden soru yükselterek. Yine de, HSPCs 'deki somatik mutasyonlar ciddi sağlık riskleri teşkil edebilir, Miyelodisplastik bozukluklar ve lösemi belirli kanser sürücüsü mutasyonlarının varlığı ile karakterize edilir.
Mutasyonel süreçleri tanımlamak ve kan klonallık incelemek için, bireysel HSPCs mutasyon birikimi karakterize edilmesi gerekir. Mutasyonel süreçler genom, sözde mutasyon imzalarında karakteristik desenler bırakmak, hangi tespit edilebilir ve mutasyonlar genom genelinde koleksiyonları nicelik5. Örneğin, UV ışığa maruz kalma, alkilleyici ajanlar, ve DNA onarım yolları kusurları her biri farklı bir mutasyonel imza ile ilişkilidir,6,7. Buna ek olarak, mutasyon birikiminin Stokastik doğası nedeniyle, elde edilen mutasyonların çoğu (değilse) hücreler arasında benzersizdir. Mutasyonlar aynı bireyin birden çok hücre arasında paylaşılır, bu hücrelerin ortak bir üst8paylaştığı gösterir. Bu nedenle, paylaşılan mutasyonları değerlendirerek, Lineage ilişkileri hücreler arasında tespit edilebilir ve bir gelişimsel soy ağacı şube tarafından inşa edilebilir. Ancak, fizyolojik olarak normal hücrelerdeki nadir somatik mutasyonları kataloglama, sağlıklı dokularda poliklonal doğası nedeniyle Teknik olarak zordur.
Burada sunulan bir yöntem doğru tanımlamak ve bireysel HSPCs genomları somatik mutasyonlar belirlemek için. Bu, HSPCs in vitro yalıtım ve klonal genişleme içerir. Bu klonal kültürler orijinal hücrenin genetik makyajını yansıtmaktadır (yani orijinal hücredeki mutasyonlar kültürdeki diğer tüm hücreler tarafından paylaşılacaktır). Bu yaklaşım, tüm genom sıralamaları (WGS) için yeterli DNA elde etmemizi sağlar. Daha önce klonal kültürü sırasında in vitro olarak birikmiş mutasyonların hücrelerin bir alt kümesi tarafından paylaşılacak olduğunu gösterdik. Bu, tüm in vitro mutasyonların filtrelenmesini sağlar, çünkü in vivo elde edilen mutasyonlar9' a kıyasla daha küçük bir parça okunacak. Önceki yöntemler tüm genom amplifikasyon (WGA)10kullanarak WGS için tek bir hücreden yeterli DNA elde etmiştir. Ancak, WGA ana dezavantajı genom nispeten hata eğilimli ve dengesiz amplifikasyon olduğunu, hangi allel bırakma neden olabilir11. Bununla birlikte, bu yaklaşım tek hücrelerin in vitro genişlemesine dayanır gibi, WGA bağımlı yöntemler için değil, yeterli çoğalan potansiyel ile kan hücreleri ile sınırlıdır. Klonal kültürlerin sıralanması önceki çabaları tek hspcs12klonal amplifikasyon sağlamak için besleyici katmanları kullanarak güvenerek. Ancak, besleyici katmanlardan DNA potansiyel olarak klonal kültürlerin DNA 'sını kirleterek, sonraki mutasyon çağırma ve filtreleme işlemini karıştırabilir. Burada sunulan yöntem sadece CL, tek HSPCs genişletmek için belirtilen orta dayanır ve bu nedenle DNA kontaminasyonu sorununu önler. Bugüne kadar, bu yöntem insan kemik iliği, kordon kanı, viably dondurulmuş kemik iliği ve periferik kan üzerinde başarıyla uyguladıysanız.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.20 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Syringe, Luer lock</td>
			<td>BD</td>
			<td>613-3925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301603</td>
			<td>Clone 3.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302005</td>
			<td>Clone 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 BV650</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300467</td>
			<td>Clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 BV421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343609</td>
			<td>561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38 PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303505</td>
			<td>Clone HIT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA PerCP/Cy5.5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304121</td>
			<td>Clone HI100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f PE/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313621</td>
			<td>Clone GoH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328113</td>
			<td>Clone 5E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 5 mL tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR plate, 384w, 130 &#181;L, F-bottom, TC, cover</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61965059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Flt3-Ligand, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-479</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78040.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (2.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78050.1</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (25 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TPO, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-095-752</td>
			<td>Reconsititute in single-use aliquots (12.5 &#956;L) at 100 &#956;g/mL in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer 2.4</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12440061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>348701</td>
			<td>Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>#07861</td>
			<td>Used for Density gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in at Institute&#39;s facility. Commerically available PBS can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Antibiotic formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>56304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH800S Cell Sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM, 500mL</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mutational load and clonal composition of human blood

Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (hspcs), lösemi gibi yaşlarla ilişkili hastalıklara katkı sağlayan bir ömür süresince DNA mutasyonları giderek birikir. Mutasyon birikimi karakterize yaşlılık ilişkili hastalıkların etiyolojisi anlayışını artırabilir. Burada sunulan bireysel hspcs içinde somatik mutasyonlar Katalog için bir yöntemdir, tüm genom sıralamaları dayanmaktadır (WGS) klonal primer hücre kültürlerinin. Orijinal hücrede bulunan mutasyonlar, klonal kültürdeki tüm hücreler tarafından paylaşılır, ancak hücre sıralamadan sonra in vitro olarak elde edilen mutasyonlar hücrelerin bir alt kümesinde bulunur. Bu nedenle, bu yöntem, yaşam sırasında biriken bireysel HSPCs genomları mevcut somatik mutasyonların doğru tespiti için izin verir. Somatik mutasyonların bu katalogları, hematopoetik dokuda aktif olan mutasyonel süreçlere ve bu süreçlerin lötekjenlere nasıl katkıda bulunmasına ilişkin değerli öngörüler sağlayabilir. Buna ek olarak, aynı bireyin birden çok HSPCs arasında paylaşılan somatik mutasyonları değerlendirerek, klonal soy ilişkileri ve kan nüfuslarının nüfus dinamikleri tespit edilebilir. Bu yaklaşım tek hücrelerin in vitro genişlemesine dayandığı için, yöntem yeterli çoğalan potansiyele sahip hematopoetik hücrelerle sınırlıdır.

Deneysel prosedür Deneysel iş akışı Şekil 1' de tasvir edilir. Giriş malzemesi tipine göre farklı adımlarla takip edilmelidir. Şekil 2 ' de bir kordon kan hücresi Sıralamalı bir akış cytometrik çıkış tasvir edilir. İlk olarak, tüm Monositik hücreler bu nüfusun etrafında gevşek bir kapı çizerek seçilir. Ardından, tekli doğrusal FSC-h/FSC-a oranı olan hücreler için seçerek izole edilir, daha düşük bir FSC-h/FSC-a oranı olarak ceketleri veya hücre kümeleri içerir. Lekelenmiş denetim örneği Lineage-, CD34+, CD38-, CD45RA-için hücre sıralama kapıları tanımlamak için kullanılır. Ayrıca, CD90 ve CD49f progenitör hücreleri veya kendini yenileyen kök hücreleri17 (Şekil 2) arasında ayırt etmek için kullanılabilir. Dizin sıralama, bireysel hücrelerin Re-Tracing sağlar ve sıralanmış hücreler kahverengi noktalar olarak tasvir edilir. Hücre kültürü sırasında, bireysel klonlar farklı bir hızda genişletebilir, bazı klonlar içinde genişleyen ile 3 hafta, diğer klonlar sadece tamamen kültür beşinci haftası kadar genişletilir iken. Bkz. Şekil 3A, B temsili koloni gelişimi için. Bir temsili resim kaplama sonra 11 gün içinde neredeyse confluent MSC toplu kültürü gösterilir (Şekil 3c).
Sıralama ve mutasyon analizinden sonra kalite kontrolü Gösterilen kopya numarası değişiklikleri (Şekil 4) kontrol etmek için Control-freec14 tarafından oluşturulan kopyalama sayısı analizinin bir örnek çıktıdır. Karyoktifik bilgiler, SNVFI çalışması sırasında hangi kromozomların dışlandığını gösterebilir (adım 7,6). Snvfı tarafından oluşturulan VAF Arsa (Şekil 5) örnekteki varyant allel frekansları bir histogram olduğunu. 0,5 de yoğunluk arsa bir zirve örnek klonal olduğunu gösterir. Mutasyonların arkasındaki biyolojik nedenlerden daha fazla bilgi almak için, bunlar R paketi MutationalPatterns15kullanılarak analiz edilebilir. Burada tasvir bir 96-trinucleotid Arsa üreten tipik bir analiz (Şekil 6). Farklı mutasyon türlerinin ölçülmesini ek olarak, bu araç ile imza çıkarma da gerçekleştirilebilir.
Gelişimsel bir soy ağacı oluşturmak Klonlar arasında paylaşılan mutasyonlar veya bir klon içinde mevcut (ve düşük VAF) germline kontrol ıGV kullanılarak doğrulanır. Mutasyonlar, numune içinde mevcut olduğunda ve germline (şekil 7a) yüksek VAF düzeylerinde değil, gerçek olarak kabul edilir. Kötü eşleştirilen bölgelerde (şekil 7b) meydana gelen IGV 'de bulunmadığı zaman mutasyonlar yanlış olarak kabul edilir. Diğer durumlarda, SNVFı tarafından algılanan olaylar cevapsız germline mutasyonlar (Şekil 7C). Seçilen klonlar için bu mutasyonlar için hedeflenen yeniden sıralamayı kullanarak mutasyonların bağımsız yeniden sıralamaları oldukça önerilir.  Klonlar arasında paylaşılan somatik mutasyonların algılanması sonrasında, ikili matris oluşturulur (adım 10,8). Bir heatmap, paylaşılan mutasyonlar A-M içeren ve içermeyen hücreler içeren inşa edilir. Bu heatmap üzerinde gelişimsel soy ağacı belirtilir (Şekil 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig1.jpg"> Şekil 1: giriş malzemesine dayalı deneysel prosedürü tasvir eden akış şeması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig2.jpg"> Şekil 2: hücre sıralama stratejisi. İlk olarak, küçük mononükleer hücrelerde gating gerçekleştirilir. İkinci olarak, tek hücreler doğrusal kesir seçimi ile Gated. Lineage negatif hücreler Gated. Tüm CD34+ CD38- CD45- hücreler tek hücreli-sıralanır. Kahverengi hücrelerin kesir, sıralanan hücreler seçeneği "Dizin sıralama" tarafından vurgulanan olan, unutulmamalıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig3.jpg"> Şekil 3: temsilci hücre kültürü sonuçları. Temsilci HSPC klonlar bir 384 iyi plaka at (a) 2 hafta kaplama sonra ve (B) 4 hafta kaplama sonra. (C) msc kültürü 2 hafta sonra orta değiştirme. Ölçek çubuğu = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig4.jpg"> Şekil 4: karyotipler. (A) clonal HSPC kültürü ve (B) msc toplu örnek. Karyotürleri okuma-derinlik analizi ile belirlendi. Her iki grafik de karyotypically normal bir örnek gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig4large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig5.jpg"> Şekil 5: varyant allel frekansları histogram. Snvfı (VAF > 0.3) son filtreleme adımına önce bir klon varyantların varyant allel frekansları histogram. VAF 'da bir zirve = 0,5 örnek clonal olduğunu gösterir. Düşük VAF ile subclonal mutasyonlar SNVFı (VAF > 0.3) son filtreleme adımı sırasında hariç tutulur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig5large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig6.jpg"> Şekil 6: HSPC örneğinde somatik mutasyonların temsili mutasyonel spektrum analizi. Tasvir, her trinükleotid değişikine (orta üssün mutasyona uğramış olduğu) Toplam spektrumuna göreceli katkı oluşturmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig6large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig7.jpg"> Şekil 7: ıGV16kullanarak mutasyonların manuel olarak incelenmesi. (A) mutations klonlama ve toplu örnek içinde mevcut olduğunda doğru olarak kabul edilir. (B) mutations kötü eşleştirilen bir bölgede mevcut olduğunda yanlış pozitis olarak kabul edilir. (C) mutasyonlar, germline denetiminde mevcut olduğunda yanlış pozitif olarak kabul edilir. Dikey çizgi, adlandırılan mutasyonun konumunu gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig7large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig8.jpg"> Şekil 8: gelişimsel soy ağacının inşası. Tasvir bir dendrogram gelişimsel kökleri geliştirme sırasında bölme gösteren olduğunu. Dendrogram altında heatmap farklı klonlar içinde mutasyonların varlığını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig8large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood at JoVE.com

Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood

Insan kanı mutasyonel yük ve Clonal bileşimi karakterize

Hücrelerdeki somatik mutasyon desenleri önceki mutajenik pozlamayı yansıtır ve gelişimsel soy ilişkilerini ortaya çıkarabilir. Burada sunulan bir metodoloji Katalog ve bireysel hematopoetik kök ve Progenitör hücrelerde somatik mutasyonları analiz etmektir.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) gradually accumulate DNA mutations during a lifespan, which can contribute to age-associated diseases such ...

Bu yöntemle tek bir hematopoetik kök hücredeki mutasyon sayısını doğru bir şekilde belirleyebiliriz. Bu mutasyonlar mutasyon süreçlerini çözmek ve hematopoetik soyları incelemek için kullanılabilir. Yöntemimiz, hematopoetik kök hücreleri in vitro klonlayarak tüm genom amplifikasyon tekniklerinin kullanılmasını önler ve bu da daha düşük hata oranları ve downstream analizinin yararları ile sonuçlanır.Hematopoetik kök hücrelerin genomlarında bulunan mutasyonel desenler, maruz kaldıklarını gösteren mutajenik ve DNA onarım süreçlerini ortaya çıkarabilir. Metin protokolünde açıklandığı gibi örnek malzeme ve boyama hazırlanması ile bu prosedüre başlayın, sonra hematopoetik kök ve ata hücresi veya HSPC kültür ortamı 25 mililitre hazırlamak. Her kuyuda 75 mikrolitre HSPC kültür ortamı ile bir hücre kültürü 384 iyi plaka doldurun.Dış kuyularda ortamın buharlaşmasını önlemek için, dış kuyuları 75 mikrolitre steril su veya PBS ile doldurun ve bu kuyuları hücre sıralamaiçin kullanmayın. Uygun sinyal HSPC'lerinin doğru sıralanması bu protokoldeki en kritik adımdır. HSPC sıralama için kapıları, lekeli örnekten 10.000 hücredeki lekesiz bir kontrole göre ayarlayın.Doğrusal ileri dağılım yüksekliği ve ileri dağılım alanı fraksiyonu etrafında bir geçit çizerek tek hücreleri geçit. Soy fraksiyonu için bir geçit çizmek için lekesiz kontrol fraksiyonu kullanın. CD34 pozitif hücreler için geçitler çizin ve CD38 negatif, CD45RA negatif hücreler için belirli bir kapı ayarlayarak bu alt kümeyi daha da karakterize edin.384 kuyulu plakayı faks makinesine yükleyin ve tek hücreleri sıralayın. Faks makinesine uygulanabilirse, sıralanmış hücrelerin izlenmesini etkinleştirmek için dizin sıralama verilerini tutma seçeneğini belirleyin. Kültür tek tek sıralanmış HSC'ler için, şeffaf polietilen sargı kapağı ile 384-iyi kültür plakası sarın.384 kuyulu plakayı %5 karbondioksitiçeren nemlendirilmiş 37 derecelik bir kuvöze aktarın ve görünür klonlar ortaya çıkana kadar üç ila dört hafta kuvözde tutun. Dört haftalık kültürden sonra, hangi kuyuların %30 veya daha yüksek bir kesişme alanı olduğunu belirleyin. Her koni için, 1,5 mililitrelik mikrotüpleri %1'lik Bir mililitre BSA ve PBS ile doldurun ve tüpü ilgili kuyuya göre etiketlayın.Pipet ucuna yapışan hücre sayısını en aza indirmek için %1 BSA ve PBS içeren bir pipet ucunu önceden ısla. 75 mikrolitre olarak belirlenen 200 mikrolitrelik pipet ile kuyunun dibini kazırken orta yı en az beş kez yukarı ve aşağı şiddetle pipetler. Hücre süspansiyonu, kuyuya karşılık gelen etiketli mikrotüpte toplayın.Maksimum hücre alımını sağlamak için 75 mikrolitreye kadar taze %1 BSA ve PBS ile kuyuda pipetingi tekrarlayın. Klonsal olarak kültürlü hücreler kuyunun dibine yapışabilir. Tüm hücrelerin toplanıp toplanmadığından emin olmak için standart, ters ışık mikroskobu kullanarak kuyuları inceleyin.%30'dan fazla biraraya gelen tüm kuyular hasat edilmişse, 384 kuyuluk plakayı kuvöze geri yerleştirin. Klonal kültürler beş haftaya kadar çoğalabilir. Hücre süspansiyonundan 5 dakika 350 kez aşağı doğru çevirin.Küçük bir pelet görünür olmalıdır. Dikkatle supernatant yaklaşık beş mikrolitre hariç tüm kaldırın. Hücre peletleri eksi 20 derecede dondurulabilir ve DNA izolasyonundan önce birkaç ay saklanabilir.Siyonun ilk dallarında bulunan mutasyonlar da toplu örneklemde alt klonal olarak bulunacaktır. Daha sonraki dallanma soyu sadece HSPC'ler arasında paylaşılan mutasyonlarla tanımlanır. Klonların bir alt kümesinde bulunan ve toplu olarak subklonaly mevcut mutasyonları tanımlamak için, klonlar arasında paylaşılan somatik mutasyonlar için ilk filtre.Unix tabanlı bir terminalde filtersomatic'i edin. ne dosya pats ayarlamak ve diğer parametreleri ayarlamak. Filtresomatik çalıştırın.pi komut dosyası. LowVAF topluyu kullanarak subkonnaly olarak bulunan mutasyonlar için filtre uygulayın. bir Unix tabanlı terminalde r komut dosyası.Bu paylaşılan ve benzersiz tek nükleotit türevleri için ayrı vcf dosyaları oluşturacaktır. Toplu örneklemde bulunmayan klonlar arasında paylaşılan tüm mutasyonları, tüm mutasyon konumlarını örtüşerek belirleyin. IgV kısaltılmış Integrative Genomic Viewer kullanarak manuel inceleme ile yanlış pozitif hariç.Mutasyon tüm klonlarda germline mevcut olduğunda veya kötü eşlenen bölgelerde mevcut olduğunda mutasyonlar yanlış olarak kabul edilir. Gerçek mutasyonlar iki klon arasında paylaşılabilir veya subclonaly toplu olarak mevcut olabilir. Tüm paylaşılan loci'yi hedefli veya sanger sıralamasını kullanarak bağımsız olarak yeniden sırala.Paylaşılan mutasyonları kullanarak, mutasyonun mevcut olmadığını ve mutasyonun varlığını gösteren bir mutasyona karşı ikili bir mutasyon tablosu oluşturun. Mutasyon ikili tablosunu, R tabanlı işlevleri kullanan hücreler arasındaki soy ilişkilerini gösteren bir dendrogramla birlikte ısı haritası olarak çıktı. Isı haritası her hücre için mutasyon durumunu gösteriyor.Kopya numarası değişikliklerini denetlemek için kontrol üç c tarafından oluşturulan kopya numarası analizinin örnek çıktısı olarak gösterilir. Tek nükleotit varyant filtreleme tarafından oluşturulan varyant alel fraksiyonu çizimi, örnekteki varyant alel frekanslarının histogramıdır. Yoğunluk çizimindeki 0,5'lik bir tepe, örneğin klonal olduğunu gösterir.Burada 96 trinükleotit çizimi üreten tipik bir mutasyonal desen analizi gösterilmiştir. Farklı mutasyon türlerinin sayısallaştırılmasına ek olarak bu araçla imza çıkarma da yapılabilir. Klonlar arasında paylaşılan veya germline kontrolünde ki bir klonda bulunan mutasyonlar IGV kullanılarak doğrulanır.Mutasyonlar, örnekte mevcut olduğunda doğru olarak kabul edilir ve germline yüksek varyant alel frekans düzeylerinde değildir. Mutasyonlar IGV mevcut değil, hangi kötü eşlenen bölgelerde olabilir yanlış olarak kabul edilir. Diğer durumlarda, tek nükleotit varyant filtreleme ile tespit edilen olaylar germline varyantları cevapsız.Seçilen klonlarda bu mutasyonlar için mutasyonların hedeflenen sıralama ile bağımsız olarak sıralanması şiddetle tavsiye edilir. Klonlar arasında paylaşılan somatik mutasyonların tespitinden sonra, ikili bir matris oluşturulur, a ile m.the gelişimsel soy ağacı gösterilir paylaşılan mutasyonlar ile ve olmadan hücreleri içeren bir ısı haritası oluşturulur. Burada sunulan meta için bir sonraki adım olarak, hemopoetik kök hücrelerde aktif olan mutasyonel süreçler mutasyonel imza analizi kullanılarak belirlenebilir.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Taze izole edilmiş insan Villöz sitotrofoblastlar ilgili siRNA transfeksiyonu ve EMSA analizi

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Edu Boyama tarafından Drosophila Yetişkin Yumurtalıkların Mitokondriyal DNA replikasyonu Yerinde Etiketlenmesi içinde

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Havuza alınan shRNA MeCP2 reaktivasyonu üzerinde etkin olmayan X kromozomu için ekran

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Genom çapında transkript çürüme oranları Proliferasyona ve durgun insan fibroblast belirleme

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Yalıtım, karakterizasyonu ve insan diş kökü kök hücrelerin genetik değişiklik mikroRNA tabanlı

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Fare embriyonik kök hücre kullanarak Southern blot ve polimeraz zincir reaksiyonu Homolog rekombinasyon olaylar tanımlaması

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Histon translasyonel modifikasyon değişiklikler Maya nörodejeneratif Proteinopathy modellerinde karakterize

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Nanopore sıralamayı kullanarak tüm kan mRNA sıralaması

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Insan pankreatik Izletinin tek hücreli RNA sıralaması ve Analizi

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...