Name: direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes
Uploaded: 2019-07-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes at JoVE.com

Vi takker Prof. Elly M. Tanaka for hendes vedvarende og langsigtede støtte. Dette arbejde blev støttet af en National Natural Science Foundation of China (NSFC) Grant (317716), forskning starter tilskud fra South China Normal University (S82111 og 8S0109), og en China postdoc Science Foundation Grant (2018M633067).

Alle dyreforsøg skal gennemføres i overensstemmelse med lokale og nationale bestemmelser om dyreforsøg og med godkendelse fra det relevante institutions revisionsudvalg.
1. klargøring af CAS9-gRNA RNP mix
<ol><li>Design og syntetisere gRNAs. Bemærk: Se andre publikationer for at designe og syntetisere grnas, herunder en udelukkende vedrørende kendt15,20,21,22</s...

<ol>
	<li>O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+the+ependyma+during+axolotl+spinal+cord+regeneration:+Changes+in+intermediate+filament+and+fibronectin+expression.">Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression.</a> Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+Central+Nervous+System+During+Salamander+Tail+Regeneration+from+the+Implanted+Neurospheres.">Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres.</a> Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).</li><li>Nordlander, R. H., Singer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ependyma+in+regeneration+of+the+spinal+cord+in+the+urodele+amphibian+tail.">The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail.</a> Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-+and+time-directed+electroporation+of+CAS9+protein&#8211;gRNA+complexes+in+vivo+yields+efficient+multigene+knock-out+for+studying+gene+function+in+regeneration.">Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein&#8211;gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration.</a> npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+genomic+deletion+of+Sox2+in+the+axolotl+shows+a+requirement+in+spinal+cord+neural+stem+cell+amplification+during+tail+regeneration.">CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome.">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 373548, (2019).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sal-Site:+Integrating+new+and+existing+ambystomatid+salamander+research+and+informational+resources.">Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources.</a> BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Stewart, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+RNA-seq+Analysis+in+the+Unsequenced+Axolotl:+The+Oncogene+Burst+Highlights+Early+Gene+Expression+in.">Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in.</a> the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+optimization+of+CRISPR&#8211;Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Application and optimization of CRISPR&#8211;Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li><li>Holder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+growth+of+the+motor+system+in+the+axolotl.">Continuous growth of the motor system in the axolotl.</a> Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).</li><li>Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salamander+spinal+cord+regeneration:+The+ultimate+positive+control+in+vertebrate+spinal+cord+regeneration.">Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration.</a> Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).</li><li>Albors, A. R., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Electroporation+of+the+Spinal+Cord+in+Larval+Axolotl.">High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).</li><li>Albors, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Planar+cell+polarity-mediated+induction+of+neural+stem+cell+expansion+during+axolotl+spinal+cord+regeneration.">et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration.</a> eLife. 4, 1-29 (2015).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Graham, D. B., Root, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resources+for+the+design+of+CRISPR+gene+editing+experiments.">Resources for the design of CRISPR gene editing experiments.</a> Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li></ol>

Den beskrevne protokol giver tid og plads begrænset gen knock-out i NSCs i Axolotler rygmarven. Den nuværende protokol tillader specifik målretning af NSCs på et defineret tidspunkt og sted med høj penetrans. Det undgår potentielle uønskede virkninger fra gen knock-out i NSCs i andre regioner såsom hjernen, der opstår, når du bruger CRE-LoxP-systemet. Det undgår også udviklingsmæssige virkninger, der stammer fra en vedvarende knock-out, så studiet af genfunktion fokuseret på regenerering. Desuden kan denne...

Rygmarven fra de fleste hvirveldyr er ikke i stand til at regenerere efter skade, hvilket fører til permanent invaliditet. Flere salamanders, såsom Axolotl, er bemærkelsesværdige undtagelser. Axolotler kan helt regenerere en strukturelt identisk rygmarv og helt genoprette rygmarv funktion. Meget af den regenerativ evne af Axolotler rygmarven skyldes ependymale celler. Disse celler linje den centrale kanal, og i modsætning til dem i pattedyr, Axolotler ependymale celler forbliver som neurale stamceller (NSCs) post-embryonale udvikling. Efter rygmarvsskade (f. eks. fra en hale amputation), disse nscs formere sig at regrow ependymal røret og differentiere for at erstatte tabte neuroner1,2,3. Afdækning af, hvordan Axolotler rygmarven NSCs forbliver pluripotente og aktiveres efter skade kan give værdifulde oplysninger om udvikling af nye terapeutiske strategier for humane patienter.
På grund af fremskridt i crispr-Cas9-genet knock-out-teknikken er det blevet lettere at udføre Knock-outs for at dechifrere genfunktionen, og det har vist sig at have bred anvendelighed i forskellige arter, herunder kendt4,5, 6 , 7 , 8. den nylige frigivelse af det fulde Axolotler genom og transkriptomet gør det nu muligt at målrette en eventuel genomlocus og for bedre at kunne vurdere de off-Target effekter9,10,11,12 , 13 , 14. optimerede protokoller er udviklet til knock-out og Knock-in i kendt ved hjælp af crispr-Cas9 system15. Levering af crispr-Cas9 maskiner i form af Cas9 protein-grna ribonucleoprotein (RNP) har vist sig at være mere effektiv end at bruge Cas9 og grna-kodning plasmider4. Dette skyldes sandsynligvis, at RNP er mindre i størrelse end plasmid vektorer, dens evne til at skabe DNA bryder straks, og beskyttelse af gRNA fra RNA nedbrydning. Desuden ved hjælp af RNPs omgår transskription og oversættelse; således, det undgår spørgsmål som promotor styrke og optimal codon skik, når plasmid elementer er afledt af en anden art.
Tab af funktionsundersøgelser er en af de generelle tilgange til at undersøge potentielle funktioner af gener af interesse. For at studere gen funktion under regenerering, en knock-out bør ideelt set udføres lige før en skade for at undgå virkninger på udviklingen. Desuden bør knock-out være begrænset til både NSCs og region for regenerering. En knock-out af målgenet i alle NSCs (herunder dem i hjernen, som er tilfældet i CRE-LoxP-systemer), kan producere effekter ikke relateret til regenerering, der kan tolerere fortolkningen af resultater. Heldigvis giver strukturen af Axolotler rygmarven en unik mulighed for tid-og plads begrænset knock-out i NSCs. De fleste af rygmarven nscs er i kontakt med den centrale kanal og udgør langt størstedelen af cellerne i kontakt med den centrale kanal16,17. Derfor, en injektion af CAS9-grna kompleks i den centrale kanal, efterfulgt af elektro poration, giver mulighed for levering til rygmarvs nscs i en ønsket region på et bestemt tidspunkt4,18,19. Denne protokol viser, hvordan dette udføres, hvilket fører til stærkt penetrateret knock-out i de målrettede rygmarvs NSCs. efterfølgende analyse udføres derefter for at studere virkningerne på regenerering og NSC adfærd.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1355px;" width="1354">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Agarose</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">A9539</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;Benzocaine</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">E1501-100G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 0.03 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 500 ml of 10&#215; TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter&#8217;s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. &#65279;The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 10 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Borosilicate glass capillaries &#65279;1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D.</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">BF120-94-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;102382</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">CAS9 buffer, 10x</td>
			<td style="width:455px;">Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at &#8722;20 &#176;C for up to 24 months</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;CAS9-NLS protein&#160;&#160;</td>
			<td style="width:455px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:241px;">CP03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Cell culture dishes, 10cm</td>
			<td style="width:455px;">Falcon</td>
			<td style="width:241px;">351029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11254-20</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Electroporator</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">NEPA21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;"></td>
			<td style="width:455px;">BEX</td>
			<td style="width:241px;">Pulse Generator CUY21EDIT II</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Fast Green FCF Solution, 5x</td>
			<td style="width:455px;">Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1&#215; PBS.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Flaming/Brown Micropipette Puller&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:492px;">&#65279;Holtfreter&#8217;s solution 400% (wt/vol)&#160;</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 11.125 g of MgSO4&#183;7H2O, 5.36 g of CaCl2&#183;2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">KCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;104936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;105886</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Microloader pipette tips</td>
			<td style="width:455px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:241px;">5242956003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Narishige</td>
			<td style="width:241px;">MN-153&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">NaCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;106404</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Pneumatic PicoPump</td>
			<td style="width:455px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:241px;">SYS-PV830</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Ring Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11103-09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:455px;">Olympus</td>
			<td style="width:241px;">SZX10&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Tris base</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;T6066</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="112">
			<td height="112" style="height:112px;width:492px;">Tris-buffered saline, 10x</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;CUY650P10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes

Axolotler har den unikke evne til at regenerere rygmarven fuldt ud. Dette skyldes i høj grad de ependymale celler forbliver som neurale stamceller (NSCs) gennem hele livet, som formere sig til at reformere ependymal røret og differentiere i tabte neuroner efter rygmarvsskade. Dechifrere hvordan disse NSCs bevarer pluristyrke efter udvikling og formere sig på rygmarvsskade at reformere den nøjagtige præ-skade struktur kan give værdifuld indsigt i, hvordan pattedyrs rygmarv kan regenerere samt potentielle behandlingsmuligheder. Udførelse af gen-Knock-outs i specifikke undergrupper af nscs inden for en begrænset tidsperiode vil gøre det muligt at studere de molekylære mekanismer bag disse regenerativ processer uden at blive forvirret af udviklingsmæssige forstyrrelser. Beskrevet her er en metode til at udføre gen knock-out i Axolotler rygmarven NSCs ved hjælp af CRISPR-Cas9 systemet. Ved at injicere CAS9-gRNA-komplekset ind i rygmarven central kanalen efterfulgt af elektroporation, er målgener slået ud i NSCs inden for specifikke områder af rygmarven på et ønsket tidspunkt, hvilket giver mulighed for molekylære undersøgelser af rygmarvs NSCs under Regenerering.

Injektion og elektroporation af CAS9-gRNA kompleks mod Sox2 i Axolotler rygmarven central Canal førte til et massivt tab af Sox2 immunoreaktivitet i et flertal af rygmarven nscs, med grna mod tyrosinase (tyr) som en kontrol (figur 2 A). B3-Tubulin (plettet med TUJ1) er en markør for neuroner og blev ikke udtrykt i nscs, og SOX2-TUJ1-celler omkring Central kanalen blev anset for at være celler husly SOX2 sletninger. Kvantificering viste Sox2 knoc...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes at JoVE.com

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Direkte gen knock-out af Axolotl rygmarv neurale stamceller via elektroporation af CAS9 protein-gRNA komplekser

Præsenteret her er en protokol til at udføre tid-og rum-begrænset gen knock-out i Axolotler rygmarvs ledninger ved at injicere CAS9-gRNA kompleks i rygmarven central kanalen efterfulgt af elektro poration.

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Denne protokol giver mulighed for hurtig og meget gennemtrængende tid og rum-begrænset gen knock-outs i axolotl rygmarven neurale stamceller til undersøgelse af de molekylære mekanismer i rygmarvsregenerering. Denne teknik gør det muligt at studere genfunktion i neurale stamceller, dens medicinske regenerering uden at blive forvirret af udviklingseffekter eller effekter fra andre celletyper. Axolotl neurale stamceller bidrager i høj grad til deres evne til at regenerere deres rygmarv.Forståelse regenerering mekanismer kan føre til indsigt for at udvikle behandlinger for menneskelige rygmarvsskader. Denne metode giver indsigt i, hvordan axolotl neurale stamceller montere en regenerativ reaktion på rygmarvsskader. Korrekt positionering af injektion kapillær i rygmarven centrale kolonne kan være udfordrende og øve på forsøgsdyr hjælper med at mestre teknikken.Visning af administrationen kan vise, hvordan du udfører injektionen, og hvad en vellykket injektion ser ud. For at forberede Cas9 guide RNA ribonuclear protein blandingen, bland fem mikrogram Cas9 nuklear lokalisering sekvens protein, fire mikrogram guide RNA, og 0,9 mikroliter af 10X Cas9 buffer. Derefter bringes det samlede volumen til 10 mikroliter med nukleasefrit vand, og cas9-guide RNA ribonuclear proteinblandingen opbevares ved minus 80 grader Celsius, hvis den ikke anvendes med det samme.Til fremstilling af agaroseelektroporationspladen tilberedes der 200 milliliter 2 % agarose i Dulbeccos PBS, og blandingen opløses i en mikrobølgeovn. Efter let afkøling hældes væsken agarose i 10-centimeter petriskåle til en dybde på omkring 10 millimeter og lad pladerne størkne ved stuetemperatur. Når agarose er fast at røre ved, bruge en kirurgisk skalpel til at skære en slids i agarose af hver skål for at holde halen lige, en brønd til at passe kroppen af dyret, og to ekstra brønde til at holde elektroderne.Derefter placeres pladerne på is og fyld dem til kanten med iskold DPBS. For at konfigurere elektroporatoren skal du indstille poringpulsen til en bipolar puls til 70 volt med en varighed på fem millisekunder, et interval på 50 millisekunder og ingen spændingshenfald. Indstil overførselspulden til fire bipolare impulser på 40 volt med en varighed på 50 millisekunder, et interval på 999 millisekunder og et 10% spændingsforfald.Derefter tilsluttes elektroderne til elektroporatoren og juster pinceterne, så de er syv millimeter fra hinanden, før elektroderne nedsænkes i et bæger af PBS. For at forberede mikroindsprøjtningskapillaer til glas udføres en rampetest på en mikropipettetrækker i henhold til producentens anvisninger for at bestemme varmeværdien. Træk derefter injektion kapillærer med tilspidsede ender med de angivne parametre.Efter at have trukket, skal du bruge et stereomikroskop og fine kraftbetræk til at bryde kapillær i en vinkel, så den har en skrå spids i en position, hvor spidsen er tynd nok til at målrette den centrale kanal af axolotl rygsøjlen, mens de resterende stærke nok til at gennembore huden. Før du lægger spidsen, tilsættes hurtig grøn FCF opløsning til ribonuclear protein blandingen på en til 30 forhold og bruge en gel-loading pipette spids til at indlæse omkring fem mikroliters af injektion mix i kapillær. Monter kapillæren på den pneumatiske pumpe med den skrå spids nedad.For at konfigurere den pneumatiske pumpe, indstille hold til 0,5 pounds per kvadrattomme, udslyngning til to pounds per kvadrattomme hold, og varigheden til gated. For at teste kapillær- og pumpeindstillingerne skal kapillæren dyppes i en dråbe vand og trykkes på fodpedalen for at injicere. Injektionsblandingen skal komme ud i en langsom, men stabil strøm.For at injicere ribonuclear protein blandingen, flip axolotls, der skal injiceres på hovedet i vandet for at bekræfte sedation og bruge ring kraftæceser til at overføre et dyr på en seng af silikone med venstre side af dyret vender opad og halen peger mod højre. Anbring injektionsstedet midt i stereomikroskopets synsfelt, og juster mikromanipulatoren, så kapillæren kommer ind i dyret i en vinkel på 60 grader fra højre side af synsfeltet. Efter at have identificeret rygmarven og den centrale kanal, langsomt flytte kapillær mod den centrale kanal af rygmarven, indtil det forsigtigt gennemborer hud og muskler.Når kapillæren er på plads, skal du trykke på og holde fodpedalen nede for at injicere blandingen i den centrale kanal. Hvis kapillæren er korrekt placeret, vil ribonuklear proteinblandingen sprede sig langs den centrale kanal som en blå linje i begge retninger. Det kan være en udfordring at placere kapillæren korrekt.Hvis blandingen ikke spredes korrekt, skal kapillærpositionen justeres i små trin, mens fodpladen bevares. Fortsæt med at holde fodpedalen nede, indtil blandingen når terminalen vesicle for enden af rygmarven og hjertekamrene i hjernen. Det kan være nødvendigt at justere udslyngningstrykket under injektionen.Umiddelbart efter injektionen skal du bruge ringforrædere til at overføre dyret til den forberedte agaroseelektroporationsplade på is og placere halen inde i slidsen, så den klemt af agarose. Anlæg elektroderne i brøndene på begge sider af halen, og pas på, at hele dyret og elektroderne er dækket af iskold PBS, og tryk på fodkontakten for at starte elektroporationen. Derefter returneres dyret til vandet med overvågning, indtil det er fuldt udspjændes, og indsprøjte og elektroporate de efterfølgende dyr på samme måde.For at vurdere effektiviteten af knock-out på proteinniveau, opnå et tværsnit af halen og udføre immunhistokemiske analyser i henhold til standardprotokoller. Alternativt kan du udtrække den elektroporerede rygmarv og lyse prøven for at opnå DNA'et. Derefter udføre genotypebestemmelse PCR efterfulgt af Sanger sekventering eller næste generation sekventering at vurdere procentdelen af redigeret genetiske loci.Injektion og elektroporation af Cas9 guide RNA komplekser mod Sox2 i axolotl rygmarvcentralkanalen fører til et massivt tab af Sox2 immunoraktivitet i størstedelen af rygmarven neurale stamceller sammenligne injektion og elektroporation af Cas9 guide RNA komplekser mod tyrosinase som en kontrol. Kvantificering af Sox2-positive celler i rygmarvsvævssektionsprøver afslører et betydeligt reduceret antal Sox2-ekspresserende celler i Cas9 Sox2-guide RNA-elektroporations knock-out dyr, hvilket indikerer, at denne metode fører til en effektiv og meget gennemtrængende gen knock-out i spinal cord neurale stamceller. Efter samtidig injektion og elektroporation af to Cas9 guide RNA komplekser mod Sox2 og GFP i transgene axolotls med allestedsnærværende GFP udtryk, en høj procentdel af dobbelt knock-out neurale stamceller er observeret, hvilket indikerer, at protokollen kan bruges til fleksibelt knock out flere gener.Det er nyttigt at øve sig i at målrette mod den centrale kanal med en kapillær og at tage formlen på med fejlfindingstrinnene til, hvornår injektionen ikke fungerer som forventet. Denne teknik giver forskerne mulighed for at studere funktionerne af gener i neurale stamceller, der er specifikke for regenerering. Vær forsigtig, når du manipulerer kapillær og sørg for ikke at stikke dine egne fingre.

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Udvælgelsesafhængig og uafhængig generering af CRISPR / Cas9-medierede Gene Knockouts i Pattedyrceller

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En standardmetode til at undersøge ejendommen mutagenicitet som en funktion af punkt Mutation reparation katalyseret af CRISPR/Cas9 og SsODN i humane celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Mikroinjektion af CRISPR/Cas9 Protein i kanal havkat, Ictalurus punctatus, embryoner til Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

En protokol til produktion af Integrase-mangelfuld Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-medieret gen Knockout i dividere celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Højeffektive gen afbrydelse af Murine og menneskelige hæmatopoietisk stamceller ved CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein Tagging i menneskelige induceret pluripotente stamceller ved hjælp af CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Forberedelse og gen modifikation af ikkemenneske primat hæmatopoietisk stamceller og stamceller

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Ved hjælp af Sniper-Cas9 til at minimere Off target effekter af CRISPR-Cas9 uden tab af målaktiviteten Via styret Evolution

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-medieret præcis Genredigering ved Rørelektroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generation af definerede genomiske modifikationer med CRISPR-CAS9 i humane pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...