Name: direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes
Uploaded: 2019-07-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes at JoVE.com

Wij danken Prof. Elly M. Tanaka voor haar voortdurende en lange termijn ondersteuning. Dit werk werd gesteund door een National Natural Science Foundation van China (NSFC) Grant (317716), onderzoek startsubsidies van de South China Normal University (S82111 en 8S0109), en een China postdoctorale Science Foundation Grant (2018M633067).

Alle dierproeven moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de plaatselijke en nationale voorschriften inzake dierproeven en met goedkeuring van de relevante institutionele beoordelings Raad.
1. het bereiden van de CAS9-gRNA RNP mix
<ol><li>Ontwerp en synthetiseren gRNAs. Opmerking: Raadpleeg andere publicaties voor het ontwerpen en synthetiseren van grna's, waaronder een exclusief met betrekking tot Axolotls15,20,...

<ol>
	<li>O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+the+ependyma+during+axolotl+spinal+cord+regeneration:+Changes+in+intermediate+filament+and+fibronectin+expression.">Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression.</a> Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+Central+Nervous+System+During+Salamander+Tail+Regeneration+from+the+Implanted+Neurospheres.">Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres.</a> Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).</li><li>Nordlander, R. H., Singer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ependyma+in+regeneration+of+the+spinal+cord+in+the+urodele+amphibian+tail.">The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail.</a> Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-+and+time-directed+electroporation+of+CAS9+protein&#8211;gRNA+complexes+in+vivo+yields+efficient+multigene+knock-out+for+studying+gene+function+in+regeneration.">Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein&#8211;gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration.</a> npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+genomic+deletion+of+Sox2+in+the+axolotl+shows+a+requirement+in+spinal+cord+neural+stem+cell+amplification+during+tail+regeneration.">CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome.">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 373548, (2019).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sal-Site:+Integrating+new+and+existing+ambystomatid+salamander+research+and+informational+resources.">Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources.</a> BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Stewart, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+RNA-seq+Analysis+in+the+Unsequenced+Axolotl:+The+Oncogene+Burst+Highlights+Early+Gene+Expression+in.">Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in.</a> the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+optimization+of+CRISPR&#8211;Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Application and optimization of CRISPR&#8211;Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li><li>Holder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+growth+of+the+motor+system+in+the+axolotl.">Continuous growth of the motor system in the axolotl.</a> Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).</li><li>Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salamander+spinal+cord+regeneration:+The+ultimate+positive+control+in+vertebrate+spinal+cord+regeneration.">Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration.</a> Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).</li><li>Albors, A. R., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Electroporation+of+the+Spinal+Cord+in+Larval+Axolotl.">High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).</li><li>Albors, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Planar+cell+polarity-mediated+induction+of+neural+stem+cell+expansion+during+axolotl+spinal+cord+regeneration.">et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration.</a> eLife. 4, 1-29 (2015).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Graham, D. B., Root, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resources+for+the+design+of+CRISPR+gene+editing+experiments.">Resources for the design of CRISPR gene editing experiments.</a> Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li></ol>

Het beschreven protocol maakt het mogelijk om in de NSCs in het ruggenmerg van Axolotl tijd en ruimte te beperken. Het huidige protocol maakt specifieke targeting van NSCs mogelijk op een bepaald tijdstip en locatie met hoge penetrantie. Het voorkomt potentiële ongewenste effecten die afkomstig zijn van genknock-out in NSCs in andere regio's, zoals de hersenen die optreden bij het gebruik van het CRE-LoxP-systeem. Het voorkomt ook ontwikkelingseffecten die afkomstig zijn van een aanhoudende knock-out, waardoor de studie...

Het ruggenmerg van de meeste gewervelde dieren kan niet regenereren na letsel, wat leidt tot blijvende invaliditeit. Verschillende salamanders, zoals de axolotl, zijn opmerkelijke uitzonderingen. De axolotl kan een structureel identiek ruggenmerg volledig regenereren en de ruggenmerg functie volledig herstellen. Een groot deel van het regeneratieve vermogen van het ruggenmerg van Axolotl is te wijten aan Ependymale cellen. Deze cellen lijn het centrale kanaal, en in tegenstelling tot die in zoogdieren, Axolotl Ependymale cellen blijven als neurale stamcellen (NSCs) post-embryonale ontwikkeling. Na het ruggenmergletsel (bijv. van een staart amputatie), vermenigvuldigen deze nscs zich om de Ependymale buis te herkweken en te differentiëren om verloren neuronen1,2,3te vervangen. Het ondekken van hoe Axolotl-ruggenmerg NSCs pluripotente blijven en geactiveerd worden na letsel kan waardevolle informatie verschaffen over het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën voor menselijke patiënten.
Als gevolg van de vooruitgang in de crispr Cas9 genknock-out techniek, is het uitvoeren van knock-outs om de genfunctie te ontcijferen gemakkelijker geworden en is aangetoond dat het een brede toepasbaarheid heeft in verschillende soorten, waaronder Axolotls4,5, 6 , 7 , 8. de recente release van het volledige Axolotl genoom en transcriptome maakt het nu mogelijk elke genomische Locus te richten en voor een betere beoordeling van de doeleffecten 9,10,11,12 , 13 , 14. geoptimaliseerde protocollen zijn ontwikkeld voor knock-out en knock-in in Axolotls met behulp van het Crispr Cas9 systeem15. De levering van crispr Cas9 machines in de vorm van Cas9 proteïne-grna RiboNucleoProteïne (RNP) is efficiënter gebleken dan het gebruik van cas9 en grna-encoding plasmiden4. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat de RNP kleiner is in grootte dan plasmide vectoren, haar vermogen om onmiddellijk DNA-onderbrekingen te maken en de gRNA te beschermen tegen RNA-degradatie. Bovendien, met behulp van RNPs omzeilt transcriptie en vertaling; Zo vermijdt het problemen zoals de kracht van de promotor en het optimale codon gebruik wanneer plasmide elementen zijn afgeleid van een andere soort.
Verlies-van-functie studies zijn een van de algemene benaderingen voor het onderzoeken van potentiële functies van genen van belang. Om de genfunctie tijdens de regeneratie te bestuderen, moet een knock-out idealiter net voor een blessure worden uitgevoerd om effecten op de ontwikkeling te voorkomen. Bovendien moet de knock-out worden beperkt tot zowel de NSCs en de regio van regeneratie. Een knock-out van het doel-gen in alle NSCs (met inbegrip van die in de hersenen, wat het geval is in CRE-LoxP-systemen), kan effecten veroorzaken die geen verband houden met regeneratie die de interpretatie van de resultaten kan vinden. Gelukkig biedt de structuur van de axolotl ruggenmerg een unieke kans voor tijd-en ruimtebeperkt knock-out in NSCs. Het merendeel van de ruggenmerg nscs zijn in contact met het centrale kanaal en vormen de overgrote meerderheid van de cellen in contact met het centrale kanaal16,17. Daarom kan een injectie van het CAS9-grna-complex in het centrale kanaal, gevolgd door elektroporation, de levering aan ruggenmerg nscs in een gewenste regio op een specifiek tijdstip4,18,19. Dit protocol laat zien hoe dit wordt uitgevoerd, wat leidt tot zeer penetrerende knock-out in de beoogde ruggenmerg NSCs. vervolgens wordt de analyse uitgevoerd om de effecten op regeneratie en NSC-gedrag te bestuderen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1355px;" width="1354">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Agarose</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">A9539</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;Benzocaine</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">E1501-100G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 0.03 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 500 ml of 10&#215; TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter&#8217;s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. &#65279;The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 10 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Borosilicate glass capillaries &#65279;1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D.</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">BF120-94-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;102382</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">CAS9 buffer, 10x</td>
			<td style="width:455px;">Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at &#8722;20 &#176;C for up to 24 months</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;CAS9-NLS protein&#160;&#160;</td>
			<td style="width:455px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:241px;">CP03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Cell culture dishes, 10cm</td>
			<td style="width:455px;">Falcon</td>
			<td style="width:241px;">351029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11254-20</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Electroporator</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">NEPA21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;"></td>
			<td style="width:455px;">BEX</td>
			<td style="width:241px;">Pulse Generator CUY21EDIT II</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Fast Green FCF Solution, 5x</td>
			<td style="width:455px;">Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1&#215; PBS.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Flaming/Brown Micropipette Puller&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:492px;">&#65279;Holtfreter&#8217;s solution 400% (wt/vol)&#160;</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 11.125 g of MgSO4&#183;7H2O, 5.36 g of CaCl2&#183;2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">KCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;104936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;105886</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Microloader pipette tips</td>
			<td style="width:455px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:241px;">5242956003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Narishige</td>
			<td style="width:241px;">MN-153&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">NaCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;106404</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Pneumatic PicoPump</td>
			<td style="width:455px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:241px;">SYS-PV830</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Ring Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11103-09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:455px;">Olympus</td>
			<td style="width:241px;">SZX10&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Tris base</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;T6066</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="112">
			<td height="112" style="height:112px;width:492px;">Tris-buffered saline, 10x</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;CUY650P10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes

De axolotl heeft de unieke mogelijkheid om zijn ruggenmerg volledig te regenereren. Dit is grotendeels te wijten aan de Ependymale cellen overgebleven als neurale stamcellen (NSCs) gedurende het hele leven, die zich vermenigvuldigen om de Ependymale buis te hervormen en te differentiëren in verloren neuronen na ruggenmergletsel. Ontcijferen hoe deze NSCs de pluripotentie post-ontwikkeling behouden en zich vermenigvuldigen met ruggenmergletsel om de exacte voor schade structuur te hervormen, kan waardevol inzicht geven in hoe de ruggengraat van zoogdieren kan regenereren, evenals mogelijke behandelingsopties. Het uitvoeren van genknock-outs in specifieke subgroepen van NSCs binnen een beperkte tijdsperiode zal het mogelijk maken om de moleculaire mechanismen achter deze regeneratieve processen te bestuderen, zonder te worden verward door ontwikkelings verstoringen. Hier beschreven is een methode om genknock-out in Axolotl ruggenmerg NSCs uit te voeren met behulp van het CRISPR Cas9 systeem. Door het CAS9-gRNA-complex in het Ruggenmergkanaal te injecteren, gevolgd door elektroporation, worden doel genen in NSCs in specifieke gebieden van het ruggenmerg op een gewenst tijdstip uitgeschakeld, waardoor moleculaire studies van ruggenmerg NSCs tijdens Regeneratie.

Injectie en elektroporation van CAS9-gRNA-complex tegen Sox2 in het middenkanaal van het Axolotl-ruggenmerg leidde tot een enorm verlies van Sox2 immunoreactiviteit in een meerderheid van de ruggenmerg nscs, met Grna tegen tyrosinase (Tyr) als een controle (Figuur 2 A). B3-tubulin (gekleurd met TUJ1) is een marker voor neuronen en werd niet uitgedrukt in nscs, en SOX2-TUJ1-cellen rond het centrale kanaal werden beschouwd als cellen die Harkotteren SOX2 verw...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes at JoVE.com

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Directe gen knock-out van Axolotl ruggenmerg neurale stamcellen via Elektroporation van CAS9 proteïne-gRNA complexen

Hier is een protocol voor het uitvoeren van tijd-en ruimtebeperkt gen knock-out in Axolotl ruggengraat koorden door het injecteren van CAS9-gRNA complex in het ruggenmerg centrale kanaal gevolgd door elektroporation.

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Dit protocol maakt snelle en zeer doordringende tijd en ruimte-beperkte gen knock-outs in axolotl ruggenmerg neurale stamcellen voor studie van de moleculaire mechanismen van ruggenmerg regeneratie. Deze techniek maakt het mogelijk de studie van de genfunctie in neurale stamcellen, de medische regeneratie zonder te worden verward door ontwikkelingseffecten of effecten van andere celtypen. Axolotl neurale stamcellen dragen grotendeels bij aan hun vermogen om hun ruggenmerg te regenereren.Inzicht in regeneratiemechanismen kan leiden tot inzichten voor het ontwikkelen van behandelingen voor menselijke dwarslaesie. Deze methode geeft inzicht in hoe axolotl neurale stamcellen een regeneratieve reactie op dwarslaesie monteren. Het correct positioneren van de injectie capillair in het ruggenmerg centrale kolom kan uitdagend zijn en oefenen op proefdieren helpt bij het beheersen van de techniek.Het bekijken van de toediening kan laten zien hoe de injectie uit te voeren en wat een succesvolle injectie eruit ziet. Om het Cas9-rna ribonuclear-eiwitmengsel voor te bereiden, meng je vijf microgram cas9-kernlokalisatie-sequentie-eiwit, vier microgram gidsRNA en 0,9 microliter van 10X Cas9-buffer. Breng vervolgens het totale volume naar 10 microliter met nuclease-vrij water en bewaar het Cas9-gidsRNA ribonuclear eiwitmengsel bij min 80 graden Celsius als het niet onmiddellijk wordt gebruikt.Voor agarose elektroporatie plaat voorbereiding, bereid 200 milliliter van 2%agarose in Dulbecco's PBS en los het mengsel op in een magnetron. Na lichte koeling, giet de vloeistof agarose in 10-centimeter petrischaal tot een diepte van ongeveer 10 millimeter en laat de platen te stollen bij kamertemperatuur. Wanneer de agarose is stevig aan te raken, gebruik maken van een chirurgische scalpel om een spleet snijden in de agarose van elk gerecht voor het houden van de staart recht, een put aan het lichaam van het dier passen, en twee extra putten om de elektroden te houden.Plaats vervolgens de platen op ijs en vul ze aan de rand met ijskoude DPBS. Om de elektroporator te configureren, stelt u de poringpuls in op één bipolaire puls op 70 volt met een duur van vijf milliseconden, een interval van 50 milliseconden en geen spanningsverval. Stel de overdrachtspuls in op vier bipolaire pulsen van 40 volt met een duur van 50 milliseconden, een interval van 999 milliseconden en een spanningsbedring van 10%.Sluit vervolgens de elektroden aan op de elektroporator en pas de pincet zo aan dat ze zeven millimeter uit elkaar liggen voordat ze de elektroden onderdompelen in een bekerglas van PBS. Om glazen micro-injectie haarvaten voor te bereiden, voert u een hellingstest uit op een micropipettrekker volgens de instructies van de fabrikant om de warmtewaarde te bepalen. Trek vervolgens injectievaten met taps toelopende uiteinden met de aangegeven parameters.Gebruik na het trekken een stereomicroscoop en fijne tangen om de capillaire onder een hoek te breken, zodat het een schuine punt heeft op een positie waar de punt dun genoeg is om het centrale kanaal van de axolotl wervelkolom te richten terwijl het sterk genoeg blijft om de huid te doorboren. Voeg voor het laden van de tip een snelle groene FCF-oplossing toe aan het ribonucleaire eiwitmengsel met een verhouding van één tot 30 en gebruik een gel-loading pipetpunt om ongeveer vijf microliters van het injectiemengsel in het capillaire te laden. Monteer vervolgens de capillaire op de pneumatische pomp met de schuine punt naar beneden gericht.Om de pneumatische pomp te configureren, stel de greep op 0,5 pond per vierkante inch, de uitwerping op twee pond per vierkante inch te houden, en de duur te gated. Om de capillaire en pompinstellingen te testen, dompelt u de capillaire in een druppel water en drukt u op het voetpedaal om te injecteren. De injectie mix moet komen in een langzame maar gestage stroom.Om het ribonucleaire eiwitmengsel te injecteren, draait u de axolotls ondersteboven in het water om sedatie te bevestigen en gebruik ringkrachten om één dier over te brengen op een bed van siliconen met de linkerkant van het dier naar boven gericht en de staart naar rechts. Plaats de injectieplaats in het midden van het gezichtsveld van de stereomicroscoop en pas de micromanipulator aan zodat de capillaire het dier in een hoek van 60 graden binnenkomt vanaf de rechterkant van het gezichtsveld. Na het identificeren van het ruggenmerg en het centrale kanaal, beweeg je de capillaire langzaam naar het centrale kanaal van het ruggenmerg totdat het de huid en spieren zachtjes doorboort.Wanneer de capillaire in positie is, houdt u het voetpedaal ingedrukt en houdt u het in het centrale kanaal ingedrukt. Als de capillaire goed is geplaatst, zal het ribonucleaire eiwitmengsel zich als blauwe lijn in beide richtingen over het centrale kanaal verspreiden. Het kan een uitdaging zijn om de capillaire correct te positioneren.Als het mengsel zich niet goed verspreidt, past u de capillaire positie in kleine stapjes aan terwijl het voetpad wordt ingedrukt. Blijf het voetpedaal inge vasthouden totdat het mengsel de terminale blaasjes aan het einde van het ruggenmerg en de ventrikels in de hersenen bereikt. Het kan nodig zijn om de uitwerpdruk tijdens de injectie aan te passen.Gebruik onmiddellijk na de injectie ringkrachten om het dier op de voorbereide agarose elektroporatieplaat op ijs over te brengen en plaats de staart in de spleet, zodat het door de agarose wordt ingeklemd. Plaats de elektroden in de putten aan beide zijden van de staart, zorg ervoor dat het hele dier en elektroden worden bedekt door ijskoude PBS en druk op de voet schakelaar om de elektroporatie te starten. Breng het dier vervolgens terug naar het water met controle tot volledig herstel en injecteer en elektroporate de volgende dieren op dezelfde manier.Om de efficiëntie van de knock-out op eiwitniveau te evalueren, een dwarsdoorsnede van de staart te verkrijgen en immunohistochemische analyse uit te voeren volgens standaardprotocollen. U ook het geëlektreerde ruggenmerg extraheren en het monster lyse om het DNA te verkrijgen. Voer vervolgens genotyping PCR gevolgd door Sanger sequencing of next-generation sequencing om het percentage van bewerkte genetische loci te beoordelen.De injectie en elektroporatie van Cas9 gids RNA complexen tegen Sox2 in de axolotl ruggenmerg centraal kanaal leidt tot een enorm verlies van Sox2 immunoreactiviteit in de meerderheid van het ruggenmerg neurale stamcellen vergeleken de injectie en elektroporatie van Cas9 gids RNA complexen tegen tyrosinase als een controle. Kwantificering van Sox2-positieve cellen in ruggenmergweefsel sectie monsters blijkt een aanzienlijk verminderd aantal Sox2-expressing cellen in Cas9 Sox2 gids RNA elektroporatie knock-out dieren, wat aangeeft dat deze methode leidt tot een efficiënte en zeer doordringende gen knock-out in het hoofd neurale stamcellen. Na gelijktijdige injectie en elektroporatie van twee Cas9-geleideRNA-complexen tegen Sox2 en GFP in transgene axolotls met alomtegenwoordige GFP-expressie, wordt een hoog percentage dubbele knock-out neurale stamcellen waargenomen, wat aangeeft dat het protocol kan worden gebruikt om meerdere genen flexibel uit te schakelen.Het is handig om te oefenen met het richten van het centrale kanaal met een capillaire en om op de formule met de probleemoplossing stappen voor wanneer de injectie niet werkt zoals verwacht. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om de functies van genen in neurale stamcellen die specifiek zijn voor regeneratie te bestuderen. Let op bij het manipuleren van de capillaire en zorg ervoor dat je je eigen vingers niet steekt.

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection van CRISPR/Cas9 eiwit in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embryo's voor Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Een Protocol voor de productie van Integrase-deficiënte lentivirale vectoren voor CRISPR/Cas9-gemedieerde Gene knock-out in cellen verdelen

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene eiwit Tagging in mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Voorbereiding en genetische modificatie van Nonhuman primaat hematopoietische stamcellen en voorlopercellen

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Met behulp van Sniper-Cas9 te minimaliseren Off-target effecten van CRISPR-Cas9 zonder verlies van On-target activiteit Via gerichte evolutie

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

SCHERPEr/Cas9 Ribonucleoproteã-gemedieerde nauwkeurige Gene bewerking door buis Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generatie van gedefinieerde genomische modificaties met CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...