Name: direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes
Uploaded: 2019-07-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes at JoVE.com

Nous remercions le professeur Elly M. Tanaka pour son soutien continu et à long terme. Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Natural Science Foundation of China (NSFC) (317716), des subventions de recherche de départ de l'Université normale de Chine du Sud (S82111 et 8S0109), et une subvention de la China Postdoctoral Science Foundation (2018M633067).

Toutes les expériences sur les animaux doivent être menées conformément aux réglementations locales et nationales sur l'expérimentation animale et avec l'approbation de la commission d'examen institutionnelle compétente.
1. Préparation du mix RNP CAS9-gRNA
<ol><li>Concevoir et synthétiser les gARN. REMARQUE: Se référer à d'autres publications pour la conception et la synthèse des gARN, y compris un exclusivement concernant les axolotls15,<su...

<ol>
	<li>O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+the+ependyma+during+axolotl+spinal+cord+regeneration:+Changes+in+intermediate+filament+and+fibronectin+expression.">Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression.</a> Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+Central+Nervous+System+During+Salamander+Tail+Regeneration+from+the+Implanted+Neurospheres.">Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres.</a> Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).</li><li>Nordlander, R. H., Singer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ependyma+in+regeneration+of+the+spinal+cord+in+the+urodele+amphibian+tail.">The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail.</a> Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-+and+time-directed+electroporation+of+CAS9+protein&#8211;gRNA+complexes+in+vivo+yields+efficient+multigene+knock-out+for+studying+gene+function+in+regeneration.">Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein&#8211;gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration.</a> npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+genomic+deletion+of+Sox2+in+the+axolotl+shows+a+requirement+in+spinal+cord+neural+stem+cell+amplification+during+tail+regeneration.">CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome.">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 373548, (2019).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sal-Site:+Integrating+new+and+existing+ambystomatid+salamander+research+and+informational+resources.">Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources.</a> BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Stewart, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+RNA-seq+Analysis+in+the+Unsequenced+Axolotl:+The+Oncogene+Burst+Highlights+Early+Gene+Expression+in.">Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in.</a> the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+optimization+of+CRISPR&#8211;Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Application and optimization of CRISPR&#8211;Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li><li>Holder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+growth+of+the+motor+system+in+the+axolotl.">Continuous growth of the motor system in the axolotl.</a> Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).</li><li>Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salamander+spinal+cord+regeneration:+The+ultimate+positive+control+in+vertebrate+spinal+cord+regeneration.">Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration.</a> Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).</li><li>Albors, A. R., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Electroporation+of+the+Spinal+Cord+in+Larval+Axolotl.">High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).</li><li>Albors, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Planar+cell+polarity-mediated+induction+of+neural+stem+cell+expansion+during+axolotl+spinal+cord+regeneration.">et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration.</a> eLife. 4, 1-29 (2015).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Graham, D. B., Root, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resources+for+the+design+of+CRISPR+gene+editing+experiments.">Resources for the design of CRISPR gene editing experiments.</a> Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li></ol>

Le protocole décrit permet le temps et l'espace restreint gène knock-out dans les CNS dans la moelle épinière axolotl. Le protocole actuel permet un ciblage spécifique des CNS à un moment et à un endroit définis avec une forte pénétration. Il évite les effets indésirables potentiels provenant de l'élimination des gènes dans les CNS dans d'autres régions telles que le cerveau qui se produisent lors de l'utilisation du système Cre-LoxP. Il évite également les effets sur le développement provenant d'un kn...

La moelle épinière de la plupart des vertébrés est incapable de se régénérer à la suite d'une blessure, ce qui entraîne une invalidité permanente. Plusieurs salamandres, comme l'axolotl, sont des exceptions notables. L'axolotl peut régénérer complètement une moelle épinière structurellement identique et restaurer complètement la fonction de la moelle épinière. Une grande partie de la capacité régénératrice de la moelle épinière axolotl est due aux cellules éparméymales. Ces cellules tapissent le canal central, et contrairement à celles des mammifères, les cellules épargymales de l'axolotl restent en tant que cellules souches neurales (NSC) développement post-embryonnaire. Après une lésion de la moelle épinière (p. ex., à partir d'une amputation de la queue), ces CNS prolifèrent pour repousser le tube éparmeymalet et se différencier pour remplacer les neurones perdus1,2,3. Découvrir comment les CNS de la moelle épinière axolotl restent pluripotents et s'activent après une blessure peut fournir des informations précieuses sur l'élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients humains.
En raison des progrès de la technique DE knock-out du gène CRISPR-Cas9, l'exécution des knock-outs pour déchiffrer la fonction du gène est devenue plus facile et a été montrée pour avoir une large applicabilité dans diverses espèces, y compris les axolotls4,5, 6 Annonces , 7 Annonces , 8. La publication récente du génome complet de l'axolotl et du transcriptome permet maintenant de cibler tout locus génomique et de mieux évaluer les effets hors cible9,10,11,12 , 13 (en) , 14. Des protocoles optimisés ont été développés pour les knock-out et knock-in en axolotls à l'aide du système CRISPR-Cas915. La livraison de la machinerie CRISPR-Cas9 sous forme de ribonucleoprotéine protéine-gRNA CAS9 (RNP) s'est avérée plus efficace que l'utilisation de Plasmides Cas9 et gRNA-encodage4. Ceci est probablement dû au RNP étant plus petit dans la taille que les vecteurs de plasmide, sa capacité à créer des ruptures d'ADN immédiatement, et protégeant de l'ARNc de la dégradation d'ARN. En outre, l'utilisation de rIN contourne la transcription et la traduction; ainsi, il évite des questions telles que la force de promoteur et l'utilisation optimale de codon quand les éléments de plasmide sont dérivés d'une espèce différente.
Les études sur la perte de fonction sont l'une des approches générales pour étudier les fonctions potentielles des gènes d'intérêt. Afin d'étudier la fonction génique pendant la régénération, un knock-out devrait idéalement être effectué juste avant une blessure pour éviter les effets sur le développement. En outre, le knock-out devrait être limité à la fois aux CNS et à la région de régénération. Un knock-out du gène cible dans tous les CNS (y compris ceux dans le cerveau, ce qui est le cas dans les systèmes Cre-LoxP), peut produire des effets non liés à la régénération qui peuvent confondre l'interprétation des résultats. Heureusement, la structure de la moelle épinière axolotl offre une occasion unique pour le temps et l'espace restreint knock-out dans les CNS. La plupart des NSC de la moelle épinière sont en contact avec le canal central et constituent la grande majorité des cellules en contact avec le canal central16,17. Par conséquent, une injection du complexe CAS9-gRNA dans le canal central, suivie de l'électroporation, permet l'administration aux CNS de la moelle épinière dans une région désirée à un moment précis4,18,19. Ce protocole démontre comment cela est effectué, menant à l'élimination très pénétrante dans les NSC ciblés de moelle épinière. L'analyse suivante est exécutée pour étudier les effets sur la régénération et le comportement de NSC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1355px;" width="1354">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Agarose</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">A9539</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;Benzocaine</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">E1501-100G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 0.03 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 500 ml of 10&#215; TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter&#8217;s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. &#65279;The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 10 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Borosilicate glass capillaries &#65279;1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D.</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">BF120-94-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;102382</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">CAS9 buffer, 10x</td>
			<td style="width:455px;">Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at &#8722;20 &#176;C for up to 24 months</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;CAS9-NLS protein&#160;&#160;</td>
			<td style="width:455px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:241px;">CP03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Cell culture dishes, 10cm</td>
			<td style="width:455px;">Falcon</td>
			<td style="width:241px;">351029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11254-20</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Electroporator</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">NEPA21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;"></td>
			<td style="width:455px;">BEX</td>
			<td style="width:241px;">Pulse Generator CUY21EDIT II</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Fast Green FCF Solution, 5x</td>
			<td style="width:455px;">Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1&#215; PBS.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Flaming/Brown Micropipette Puller&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:492px;">&#65279;Holtfreter&#8217;s solution 400% (wt/vol)&#160;</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 11.125 g of MgSO4&#183;7H2O, 5.36 g of CaCl2&#183;2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">KCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;104936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;105886</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Microloader pipette tips</td>
			<td style="width:455px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:241px;">5242956003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Narishige</td>
			<td style="width:241px;">MN-153&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">NaCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;106404</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Pneumatic PicoPump</td>
			<td style="width:455px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:241px;">SYS-PV830</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Ring Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11103-09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:455px;">Olympus</td>
			<td style="width:241px;">SZX10&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Tris base</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;T6066</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="112">
			<td height="112" style="height:112px;width:492px;">Tris-buffered saline, 10x</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;CUY650P10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
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direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes

L'axolotl a la capacité unique de régénérer complètement sa moelle épinière. Ceci est en grande partie dû aux cellules éparméymales restant en tant que cellules souches neurales (NSCs) tout au long de la vie, qui prolifèrent pour réformer le tube éparmeymal et différencier en neurones perdus après des dommages de moelle épinière. Déchiffrer comment ces CNS conservent la pluripotence après le développement et prolifèrent sur les lésions de la moelle épinière pour réformer la structure exacte avant les blessures peut fournir un aperçu précieux sur la façon dont les moelles épinières mammifères peuvent se régénérer ainsi que les options de traitement potentielles. L'exécution de knock-outs génétiques dans des sous-ensembles spécifiques de NSC dans un délai limité permettra d'étudier les mécanismes moléculaires derrière ces processus régénérateurs, sans être confondus par le développement des effets perturbateurs. Décrit ici est une méthode pour effectuer le gène knock-out dans les NSC de moelle épinière d'axolotl utilisant le système CRISPR-Cas9. En injectant le complexe CAS9-gRNA dans le canal central de la moelle épinière suivi d'électroporation, les gènes cibles sont éliminés dans les CNS dans des régions spécifiques de la moelle épinière à un moment souhaité, ce qui permet des études moléculaires des CNS de la moelle épinière pendant régénération.

L'injection et l'électroporation du complexe CAS9-gRNA contre Sox2 dans le canal central de la moelle épinière axolotl ont conduit à une perte massive d'immunoréactivité SOX2 dans la majorité des NSC de la moelle épinière, avec gRNA contre Tyrosinase (Tyr) comme un contrôle (Figure 2 A) B3-tubulin (stained with TUJ1) is a marker for neurons and was not expressed in NSCs, and SOX2- TUJ1- cells surrounding the central canal were considered to be cells harbor...

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Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Présenté ici est un protocole pour effectuer le temps et l'espace-limité gène knock-out dans les moelles épinières axolotl en injectant CAS9-gRNA complexe dans le canal central de la moelle épinière suivie d'électroporation.

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Ce protocole permet un temps rapide et très pénétrant et des knock-outs génétiques limités dans l’espace dans les cellules souches neurales de la moelle épinière axolotl pour l’étude des mécanismes moléculaires de la régénération de la moelle épinière. Cette technique permet l’étude de la fonction génétique dans les cellules souches neurales, sa régénération médicale sans être confondue par des effets développementaux ou des effets d’autres types de cellules. Les cellules souches neurales axolotl contribuent en grande partie à leur capacité à régénérer leur moelle épinière.Comprendre les mécanismes de régénération pourrait mener à des idées pour développer des traitements pour les lésions de la moelle épinière humaine. Cette méthode donne un aperçu de la façon dont les cellules souches neurales axolotls montent une réponse régénératrice aux lésions de la moelle épinière. Le positionnement correct du capillaire d’injection dans la colonne centrale de moelle épinière peut être difficile et la pratique sur des animaux d’essai aide avec la maîtrise de la technique.L’affichage de l’administration peut montrer comment effectuer l’injection et à quoi ressemble une injection réussie. Pour préparer le mélange de protéines ribonucléaires à ARN guide Cas9, mélangez cinq microgrammes de protéines de séquence de localisation nucléaire Cas9, quatre microgrammes d’ARN guide et 0,9 microlitre de tampon Cas9 10X. Ensuite, apportez le volume total à 10 microlitres avec de l’eau sans nucléase et stockez le mélange de protéines ribonucléaires à ARN guide Cas9 à moins 80 degrés Celsius s’il n’est pas utilisé immédiatement.Pour la préparation des plaques d’électroporation agarose, préparer 200 millilitres de 2% d’agarose dans le PBS de Dulbecco et dissoudre le mélange au micro-ondes. Après un léger refroidissement, verser l’agarose liquide dans des boîtes de Pétri de 10 centimètres à une profondeur d’environ 10 millimètres et permettre aux assiettes de se solidifier à température ambiante. Lorsque l’agarose est ferme au toucher, utilisez un scalpel chirurgical pour couper une fente dans l’agarose de chaque plat pour tenir la queue droite, un puits pour s’adapter au corps de l’animal, et deux puits supplémentaires pour tenir les électrodes.Placez ensuite les plaques sur la glace et remplissez-les sur la jante avec du DPBS glacé. Pour configurer l’électroporateur, réglez l’impulsion poreuse sur une impulsion bipolaire à 70 volts d’une durée de cinq millisecondes, d’un intervalle de 50 millisecondes et d’aucune pourriture de tension. Réglez l’impulsion de transfert à quatre impulsions bipolaires de 40 volts d’une durée de 50 millisecondes, d’un intervalle de 999 millisecondes et d’une pourriture de tension de 10 %.Connectez ensuite les électrodes à l’électroporateur et ajustez les pinces de sorte qu’elles soient séparées de sept millimètres avant de submerger les électrodes dans un bécher de PBS. Pour préparer des capillaires de micro-injection en verre, effectuez un test de rampe sur un puller de micropipette selon les instructions du fabricant pour déterminer la valeur thermique. Tirez ensuite les capillaires d’injection avec des extrémités coniques avec les paramètres indiqués.Après avoir tiré, utilisez un microscope stéréo et des forceps fins pour briser le capillaire à un angle de sorte qu’il a une pointe inclinée à une position où la pointe est assez mince pour cibler le canal central de la colonne vertébrale axolotl tout en restant assez fort pour percer la peau. Avant de charger la pointe, ajouter la solution FCF vert rapide au mélange de protéines ribonucléaires à un rapport d’un à 30 et utiliser une pointe de pipette de chargement de gel pour charger environ cinq microlitres du mélange d’injection dans le capillaire. Montez ensuite le capillaire sur la pompe pneumatique avec la pointe inclinée orientée vers le bas.Pour configurer la pompe pneumatique, réglez la prise à 0,5 livres par pouce carré, l’éjection à deux livres par pouce carré tenir, et la durée à gated. Pour tester les réglages capillaires et de la pompe, trempez le capillaire dans une goutte d’eau et appuyez sur la pédale pour l’injecter. Le mélange d’injection devrait sortir dans un flux lent mais régulier.Pour injecter le mélange de protéines ribonucléaires, retournez les axolotls à injecter à l’envers dans l’eau pour confirmer la sédation et utilisez des forceps d’anneau pour transférer un animal sur un lit de silicone avec le côté gauche de l’animal orienté vers le haut et la queue pointant vers la droite. Placez le site d’injection au milieu du champ de vision du microscope stéréo et ajustez le micromanipulateur de sorte que le capillaire pénètre dans l’animal à un angle de 60 degrés du côté droit du champ de vision. Après avoir identifié la moelle épinière et le canal central, déplacez lentement le capillaire vers le canal central de la moelle épinière jusqu’à ce qu’il perce doucement la peau et le muscle.Lorsque le capillaire est en position, appuyez et maintenez la pédale pour injecter le mélange dans le canal central. Si le capillaire a été correctement placé, le mélange de protéines ribonucléaires se propagera le long du canal central comme une ligne bleue dans les deux directions. Il peut être difficile de positionner le capillaire correctement.Si le mélange ne se propage pas correctement, ajustez la position capillaire en petits pas tout en gardant le pavé pressé. Continuer à maintenir la pédale jusqu’à ce que le mélange atteigne la vésicule terminale à l’extrémité de la moelle épinière et les ventricules dans le cerveau. Il peut être nécessaire d’ajuster la pression d’éjection pendant l’injection.Immédiatement après l’injection, utilisez des forceps d’anneau pour transférer l’animal sur la plaque d’électroporation agarose préparée sur la glace et placez la queue à l’intérieur de la fente afin qu’elle soit prise en sandwich par l’agarose. Placez les électrodes dans les puits des deux côtés de la queue, en prenant soin que l’animal entier et les électrodes sont recouverts de PBS glacé et appuyez sur l’interrupteur du pied pour commencer l’électroporation. Puis remettre l’animal à l’eau avec surveillance jusqu’à ce que le rétablissement complet et injecter et électroporer les animaux suivants de la même manière.Pour évaluer l’efficacité du knock-out au niveau des protéines, obtenir une section transversale de la queue et effectuer une analyse immunohistochimique selon les protocoles standard. Sinon, extraire la moelle épinière électroporée et lyser l’échantillon pour obtenir l’ADN. Effectuez ensuite le génotypage PCR suivi du séquençage Sanger ou du séquençage de prochaine génération pour évaluer le pourcentage de loci génétiques édités.L’injection et l’électroporation des complexes d’ARN guide cas9 contre Sox2 dans le canal central de la moelle épinière axolotl conduit à une perte massive de l’immunoréactivité Sox2 dans la majorité des cellules souches neurales de la moelle épinière ont comparé l’injection et l’électroporation des complexes d’ARN guide Cas9 contre la tyrosinase comme un contrôle. La quantification des cellules sox2-positives dans les échantillons de section de tissu de moelle épinière indique un nombre sensiblement réduit de cellules Sox2-exprimant dans cas9 Sox2 guident des animaux knock-out d’électroporation d’ARN, indiquant que cette méthode mène à un gène efficace et fortement pénétrant knock-out dans les cellules souches neurales de moelle épinière. Après l’injection simultanée et l’électroporation de deux complexes d’ARN guide Cas9 contre Sox2 et GFP en axolotls transgéniques avec l’expression omniprésente de GFP, un pourcentage élevé de cellules souches neurales à double knock-out est observé, indiquant que le protocole peut être utilisé pour assommer de manière flexible plusieurs gènes.Il est utile de pratiquer le ciblage du canal central avec un capillaire et de mettre sur la formule avec les étapes de dépannage pour quand l’injection ne fonctionne pas comme prévu. Cette technique permet aux chercheurs d’étudier les fonctions des gènes dans les cellules souches neurales qui sont spécifiques à la régénération. Prenez soin lors de la manipulation du capillaire et assurez-vous de ne pas poignarder vos propres doigts.

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Génération indépendante et dépendante de la sélection de CRISPR / Cas9-Meded Knockouts dans les cellules de mammifères

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Recherche

Génétique

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Une méthode Standard pour examiner la mutagénicité sur place en fonction de la Mutation ponctuelle de réparation catalysée par CRISPR/Cas9 et SsODN dans les cellules humaines

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection de protéine CRISPR/Cas9 dans des embryons de barbue de rivière, Ictalurus punctatus, pour Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Un protocole pour la Production de vecteurs LENTIVIRAUX intégrase déficient pour CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout dans les cellules en Division

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Perturbation de gène hautement efficace des cellules progénitrices hématopoïétiques murins et humains par CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Protéine endogène de marquage dans l’homme induites par les cellules souches pluripotentes à l’aide de CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Préparation et Modification de gène de Primate non-humaine souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

À l’aide de Sniper-Cas9 pour minimiser les effets hors cible de CRISPR-Cas9 sans la perte d’activité sur la cible Via évolution dirigée

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Génération de modifications génomiques définies à l'aide de CRISPR-CAS9 dans les cellules souches pluripotentes humaines

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...