Name: direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes
Uploaded: 2019-07-09T14:00:00
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हम उसे निरंतर और दीर्घकालिक समर्थन के लिए प्रो एली एम तनाका धन्यवाद. यह काम चीन के एक राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफसी) अनुदान (317716), अनुसंधान दक्षिण चीन सामान्य विश्वविद्यालय (S82111 और 8S0109) से अनुदान शुरू, और एक चीन Postdoctoral विज्ञान फाउंडेशन अनुदान (2018M633067) द्वारा समर्थित किया गया था.

सभी पशु प्रयोगों पशु प्रयोग पर स्थानीय और राष्ट्रीय नियमों के अनुसार और प्रासंगिक संस्थागत समीक्षा बोर्ड के अनुमोदन के साथ किया जाना चाहिए.
1. CAS9-GRNA RNP मिश्रण की तैयारी
<ol><li>डिजाइन और संश्लेषित gR...

<ol>
	<li>O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+the+ependyma+during+axolotl+spinal+cord+regeneration:+Changes+in+intermediate+filament+and+fibronectin+expression.">Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression.</a> Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+Central+Nervous+System+During+Salamander+Tail+Regeneration+from+the+Implanted+Neurospheres.">Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres.</a> Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).</li><li>Nordlander, R. H., Singer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ependyma+in+regeneration+of+the+spinal+cord+in+the+urodele+amphibian+tail.">The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail.</a> Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-+and+time-directed+electroporation+of+CAS9+protein&#8211;gRNA+complexes+in+vivo+yields+efficient+multigene+knock-out+for+studying+gene+function+in+regeneration.">Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein&#8211;gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration.</a> npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+genomic+deletion+of+Sox2+in+the+axolotl+shows+a+requirement+in+spinal+cord+neural+stem+cell+amplification+during+tail+regeneration.">CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome.">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 373548, (2019).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sal-Site:+Integrating+new+and+existing+ambystomatid+salamander+research+and+informational+resources.">Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources.</a> BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Stewart, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+RNA-seq+Analysis+in+the+Unsequenced+Axolotl:+The+Oncogene+Burst+Highlights+Early+Gene+Expression+in.">Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in.</a> the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+optimization+of+CRISPR&#8211;Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Application and optimization of CRISPR&#8211;Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li><li>Holder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+growth+of+the+motor+system+in+the+axolotl.">Continuous growth of the motor system in the axolotl.</a> Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).</li><li>Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salamander+spinal+cord+regeneration:+The+ultimate+positive+control+in+vertebrate+spinal+cord+regeneration.">Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration.</a> Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).</li><li>Albors, A. R., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Electroporation+of+the+Spinal+Cord+in+Larval+Axolotl.">High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).</li><li>Albors, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Planar+cell+polarity-mediated+induction+of+neural+stem+cell+expansion+during+axolotl+spinal+cord+regeneration.">et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration.</a> eLife. 4, 1-29 (2015).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Graham, D. B., Root, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resources+for+the+design+of+CRISPR+gene+editing+experiments.">Resources for the design of CRISPR gene editing experiments.</a> Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li></ol>

वर्णित प्रोटोकॉल समय और अंतरिक्ष प्रतिबंधित जीन नॉक आउट axolotl रीढ़ की हड्डी में एनएससी में बाहर की अनुमति देता है. वर्तमान प्रोटोकॉल उच्च penetrance के साथ एक निर्धारित समय और स्थान पर एनएससी के विशिष्ट लक्ष्य?...

अधिकांश कशेरुकियों की रीढ़ की हड्डी चोट के बाद पुनर्जीवित करने में असमर्थ है, जिससे स्थायी विकलांगता हो जाती है। इस तरह के एक्सोलोटल के रूप में कई salamanders, उल्लेखनीय अपवाद हैं. axolotl पूरी तरह से एक संरचनात्मक समान रीढ़ की हड्डी को पुनर्जीवित कर सकते हैं और पूरी तरह से रीढ़ की हड्डी समारोह बहाल. एक्स्ओटॉल रीढ़ की हड्डी की पुनर्योजी क्षमता का अधिकांश हिस्सा एपेंडिमल कोशिकाओं के कारण होता है। इन कोशिकाओं को केंद्रीय नहर लाइन, और स्तनधारियों में उन लोगों के विपरीत, axolotl ependymal कोशिकाओं तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के रूप में रहते हैं (एनएससी) भ्रूणीय विकास के बाद. रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद (जैसे, एक पूंछ विच्छेदन से), इन NSCs ependymal ट्यूब regrow और खो न्यूरॉन्स1,2,3की जगह करने के लिए अंतर करने के लिए proliferate. उजागर कैसे axolotl रीढ़ की हड्डी NSCs pluripotent रहते हैं और चोट के बाद सक्रिय हो मानव रोगियों के लिए नई चिकित्सीय रणनीति विकसित करने के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं.
CRISPR-Cas9 जीन नॉक आउट तकनीक में प्रगति के कारण, जीन समारोह को समझने के लिए नॉक-आउट करना आसान हो गयाहै और एक्सोलोटल्स 4,5सहित विभिन्न प्रजातियों में व्यापक प्रयोज्यता के लिए दिखाया गयाहै, 6 , 7 , 8. पूर्ण एक्सोलोटल जीनोम और ट्रांसक्रिप्टोम की हाल ही में रिलीज होने से अब किसी भी जीनोमिक टिड्डी को लक्षित किया जा सकता है और बेहतर आकलन करने के लिए ऑफ-लक्ष्य प्रभाव9,10,11,12 , 13 , 14. अनुकूलित प्रोटोकॉल CRISPR-Cas9 प्रणाली15का उपयोग कर axolotls में नॉक आउट और नॉक-इन के लिए विकसित किया गया है। CAS9 प्रोटीन-GRNA ribonucleoप्रोटीन (RNP) के रूप में CRISPR-Cas9 मशीनरी की डिलीवरी Cas9 और gRNA-एन्कोडिंग प्लाज्मिड4का उपयोग करने की तुलना में अधिक कुशल होना दिखाया गया है। यह पीएलज़्मिड वैक्टर की तुलना में आकार में छोटे होने के कारण आरएनपी की संभावना है, डीएनए ब्रेक बनाने की क्षमता तुरंत, और आरएनए गिरावट से डीएनए की रक्षा। इसके अलावा, RNPs का उपयोग प्रतिलेखन और अनुवाद bypasses; इस प्रकार, यह प्रमोटर शक्ति और इष्टतम codon उपयोग के रूप में मुद्दों से बचा जाता है जब प्लाज्मिड तत्वों एक अलग प्रजाति से प्राप्त कर रहे हैं.
हानि के समारोह अध्ययन ब्याज के जीन के संभावित कार्यों की जांच करने के लिए सामान्य दृष्टिकोण में से एक हैं. पुनर्जनन के दौरान जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए, विकास पर प्रभाव से बचने के लिए एक चोट से पहले आदर्श रूप से एक नॉक-आउट किया जाना चाहिए। इसके अलावा, नॉक आउट को एनएससी और पुनर्जनन के क्षेत्र दोनों तक सीमित किया जाना चाहिए। सभी NSCs में लक्ष्य जीन का एक नॉक-आउट (मस्तिष्क में उन सहित, जो क्रे-LoxP सिस्टम में मामला है), प्रभाव पुनर्जनन है कि परिणामों की व्याख्या confound कर सकते हैं से संबंधित नहीं उत्पादन कर सकते हैं. सौभाग्य से, axolotl रीढ़ की हड्डी की संरचना समय के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है- और एनएससी में अंतरिक्ष प्रतिबंधित नॉक आउट. अधिकांश मेरुदण्डीय एन सी सी केन्द्रीय नहर के संपर्क में हैं और अधिकांश कोशिकाओं को केंद्रीय नहर16,17के संपर्क में रखते हैं . इसलिए, केंद्रीय नहर में CAS9-GRNA परिसर का एक इंजेक्शन, इलेक्ट्रोपोट्रेशन के बाद, एक विशिष्ट समय4,18,19में एक वांछित क्षेत्र में रीढ़ की हड्डी एनएससी को प्रसव की अनुमति देता है. यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि यह कैसे किया जाता है, जिससे लक्षित रीढ़ की हड्डी एनएससी में अत्यधिक प्रवेश करने वाला नॉक-आउट होता है। इसके बाद के विश्लेषण को पुनर्जनन और एनएससी व्यवहार पर प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1355px;" width="1354">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Agarose</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">A9539</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;Benzocaine</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">E1501-100G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 0.03 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 500 ml of 10&#215; TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter&#8217;s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. &#65279;The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 10 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Borosilicate glass capillaries &#65279;1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D.</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">BF120-94-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;102382</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">CAS9 buffer, 10x</td>
			<td style="width:455px;">Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at &#8722;20 &#176;C for up to 24 months</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;CAS9-NLS protein&#160;&#160;</td>
			<td style="width:455px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:241px;">CP03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Cell culture dishes, 10cm</td>
			<td style="width:455px;">Falcon</td>
			<td style="width:241px;">351029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11254-20</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Electroporator</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">NEPA21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;"></td>
			<td style="width:455px;">BEX</td>
			<td style="width:241px;">Pulse Generator CUY21EDIT II</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Fast Green FCF Solution, 5x</td>
			<td style="width:455px;">Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1&#215; PBS.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Flaming/Brown Micropipette Puller&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:492px;">&#65279;Holtfreter&#8217;s solution 400% (wt/vol)&#160;</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 11.125 g of MgSO4&#183;7H2O, 5.36 g of CaCl2&#183;2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">KCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;104936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;105886</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Microloader pipette tips</td>
			<td style="width:455px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:241px;">5242956003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Narishige</td>
			<td style="width:241px;">MN-153&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">NaCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;106404</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Pneumatic PicoPump</td>
			<td style="width:455px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:241px;">SYS-PV830</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Ring Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11103-09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:455px;">Olympus</td>
			<td style="width:241px;">SZX10&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Tris base</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;T6066</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="112">
			<td height="112" style="height:112px;width:492px;">Tris-buffered saline, 10x</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;CUY650P10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
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</table>

direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes

एक्सोटोल में अपनी रीढ़ की हड्डी को पूरी तरह से पुनर्जीवित करने की अद्वितीय क्षमता है। यह काफी हद तक जीवन भर तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) के रूप में शेष ependymal कोशिकाओं के कारण है, जो ependymal ट्यूब में सुधार और रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद खो न्यूरॉन्स में अंतर करने के लिए proliferate. Deciphering कैसे इन NSCs pluripotency के बाद विकास को बनाए रखने और रीढ़ की हड्डी की चोट पर proliferate सटीक पूर्व चोट संरचना में सुधार कैसे स्तनधारी रीढ़ की हड्डी के रूप में अच्छी तरह से संभावित उपचार के विकल्प पुनर्जीवित कर सकते हैं में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. एक प्रतिबंधित समय अवधि के भीतर एनएससी के विशिष्ट सबसेट में जीन नॉक-आउट प्रदर्शन विकास परेशान प्रभाव से उलझन में होने के बिना, इन पुनर्योजी प्रक्रियाओं के पीछे आणविक तंत्र के अध्ययन की अनुमति देगा। यहाँ वर्णित CRISPR-Cas9 प्रणाली का उपयोग कर axolotl रीढ़ की हड्डी NSCs में जीन नॉक आउट प्रदर्शन करने के लिए एक विधि है। इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद रीढ़ की हड्डी केंद्रीय नहर में CAS9-GRNA परिसर इंजेक्शन द्वारा, लक्ष्य जीन एक वांछित समय बिंदु पर रीढ़ की हड्डी के विशिष्ट क्षेत्रों के भीतर एनएससी में बाहर खटखटाया जाता है, रीढ़ की हड्डी NSCs के आणविक अध्ययन के लिए अनुमति के दौरान पुनर्जनन.

Axolotl रीढ़ की हड्डी केंद्रीय नहर में Sox2 के खिलाफ CAS9-GRNA परिसर के इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोट्रेशन रीढ़ की हड्डी NSCs के बहुमत में SOX2 इम्यूनोरेक्शन का एक भारी नुकसान के लिए नेतृत्व किया, Tyrosinase के खिलाफ gRNA के साथ (Tyr) ए...

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Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

कैस9 प्रोटीन-GRNA परिसरों के इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से एक्सोटोटल स्पाइनल कॉर्ड न्यूरल स्टेम सेल का डायरेक्ट जीन नॉक-आउट

यहाँ प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल है समय और अंतरिक्ष प्रतिबंधित जीन दस्तक प्रदर्शन करने के लिए axolotl रीढ़ की हड्डी में CAS9-GRNA परिसर रीढ़ की हड्डी केंद्रीय नहर में इंजेक्शन द्वारा जिसके बाद electroporation.

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

यह प्रोटोकॉल रीढ़ की हड्डी के उत्थान के आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए एक्सोलोटल रीढ़ की हड्डी तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं में तेजी से और अत्यधिक मर्मज्ञ समय और अंतरिक्ष-प्रतिबंधित जीन नॉक आउट की अनुमति देता है। यह तकनीक तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं में जीन समारोह के अध्ययन की अनुमति देता है, इसके चिकित्सा उत्थान के बिना विकासात्मक प्रभाव या अन्य सेल प्रकार से प्रभाव से चकित किया जा रहा है । एक्सोलोटल तंत्रिका स्टेम कोशिकाएं काफी हद तक अपनी रीढ़ की हड्डी को पुनर्जीवित करने की क्षमता में योगदान देती हैं।पुनर्जनन तंत्र को समझना मानव रीढ़ की हड्डी की चोट के लिए उपचार के विकास के लिए अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व कर सकता है । यह विधि कैसे axolotl तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं रीढ़ की हड्डी की चोट के लिए एक पुनर्योजी प्रतिक्रिया माउंट में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है । सही ढंग से रीढ़ की हड्डी केंद्रीय स्तंभ में इंजेक्शन केशिका स्थिति चुनौतीपूर्ण हो सकता है और परीक्षण जानवरों पर अभ्यास तकनीक माहिर के साथ मदद करता है ।प्रशासन को देखने से पता चल सकता है कि इंजेक्शन कैसे किया जाए और एक सफल इंजेक्शन कैसा दिखता है। Cas9 गाइड आरएनए रिबोन्यूक्लियर प्रोटीन मिश्रण तैयार करने के लिए, Cas9 परमाणु स्थानीयकरण अनुक्रम प्रोटीन के पांच माइक्रोग्राम, गाइड आरएनए के चार माइक्रोग्राम, और 10X Cas9 बफर के ०.९ माइक्रोलीटर मिश्रण । फिर नाभिक मुक्त पानी के साथ 10 माइक्रोलीटर के लिए कुल मात्रा लाने के लिए और Cas9 गाइड आरएनए राइबोन्यूक्लियर प्रोटीन मिश्रण को शून्य से ८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें यदि तुरंत इस्तेमाल नहीं किया जाता है ।एग्रिजॉग्रेशन इलेक्ट्रोपॉरेशन प्लेट तैयार करने के लिए, दुल्बेको के पीबीएस में 2% एग्रिज के 200 मिलीलीटर तैयार करें और मिश्रण को माइक्रोवेव में भंग करें। मामूली ठंडा होने के बाद, तरल एग्राम को 10 सेंटीमीटर पेट्री व्यंजनों में लगभग 10 मिलीमीटर की गहराई तक डालें और प्लेटों को कमरे के तापमान पर जमना करने की अनुमति दें। जब एगर उठे स्पर्श के लिए दृढ़ होते हैं, तो पूंछ को सीधे पकड़ने के लिए प्रत्येक पकवान के एग्ल में एक भट्ठा काटने के लिए एक सर्जिकल स्केलपेल का उपयोग करें, जानवर के शरीर को फिट करने के लिए एक अच्छी तरह से, और इलेक्ट्रोड को पकड़ने के लिए दो अतिरिक्त कुएं।फिर प्लेटों को बर्फ पर रखें और उन्हें बर्फ से ठंडे डीपीबीएस के साथ रिम में भरें। इलेक्ट्रोपोरेटर को कॉन्फ़िगर करने के लिए, पांच मिलीसेकंड की अवधि, 50 मिलीसेकंड के अंतराल और कोई वोल्टेज क्षय के साथ 70 वोल्ट पर एक द्विध्रुवी नाड़ी के लिए पोरिंग पल्स सेट करें। 50 मिलीसेकंड की अवधि, 999 मिलीसेकंड के अंतराल और 10% वोल्टेज क्षय के साथ 40 वोल्ट की चार द्विध्रुवी दालों में स्थानांतरण नाड़ी सेट करें।फिर इलेक्ट्रोपोरेटर से इलेक्ट्रोड कनेक्ट करें और चिमटी को समायोजित करें ताकि वे पीबीएस के एक बीकर में इलेक्ट्रोड को जलमग्न करने से पहले सात मिलीमीटर अलग हों। ग्लास माइक्रो-इंजेक्शन केशिकाओं को तैयार करने के लिए, गर्मी मूल्य निर्धारित करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार माइक्रोपिपेट पुलर पर रैंप परीक्षण करें। फिर संकेतित मापदंडों के साथ पतला सिरों के साथ इंजेक्शन केशिकाएं खींचें।खींचने के बाद, एक कोण पर केशिका को तोड़ने के लिए एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप और ठीक संदंश का उपयोग करें ताकि इसमें एक स्थिति में एक तिरछा टिप हो, जहां त्वचा को छेदने के लिए काफी मजबूत शेष रहते हुए टिप काफी पतली होती है। टिप लोड करने से पहले, एक से 30 अनुपात में राइबोन्यूक्लियर प्रोटीन मिश्रण में तेजी से हरे एफसीएफ समाधान जोड़ें और इंजेक्शन मिश्रण के लगभग पांच माइक्रोलीटर को केशिका में लोड करने के लिए जेल-लोडिंग पिपेट टिप का उपयोग करें। फिर तिरछा टिप नीचे की ओर सामना करना पड़ के साथ वायवीय पंप पर केशिका माउंट।वायवीय पंप को कॉन्फ़िगर करने के लिए, प्रति वर्ग इंच 0.5 पाउंड, रिजेक्शन को दो पाउंड प्रति वर्ग इंच होल्ड और गेटेड करने की अवधि निर्धारित करें। केशिका और पंप सेटिंग्स का परीक्षण करने के लिए, केशिका को पानी की एक बूंद में डुबोएं और इंजेक्शन लगाने के लिए पैर पेडल दबाएं। इंजेक्शन मिश्रण एक धीमी लेकिन स्थिर धारा में बाहर आना चाहिए।राइबोन्यूक्लियर प्रोटीन मिश्रण को इंजेक्ट करने के लिए, एक्सोलोटल को पानी में उल्टा इंजेक्ट करने के लिए फ्लिप करें ताकि बेहोशी की पुष्टि की जा सके और एक जानवर को सिलिकॉन के बिस्तर पर स्थानांतरित करने के लिए रिंग संदंश का उपयोग किया जा सके और जानवर के बाईं ओर का सामना करना पड़ रहा है और पूंछ दाईं ओर इशारा कर रही है। स्टीरियो माइक्रोस्कोप के दृश्य के क्षेत्र के बीच में इंजेक्शन साइट की स्थिति और माइक्रोमैनीपुलेटर को समायोजित करें ताकि केशिका देखने के क्षेत्र के दाईं ओर से 60 डिग्री कोण पर जानवर में प्रवेश करेगी। रीढ़ की हड्डी और केंद्रीय नहर की पहचान करने के बाद, धीरे-धीरे रीढ़ की हड्डी की केंद्रीय नहर की ओर केशिका को स्थानांतरित करें जब तक कि यह त्वचा और मांसपेशियों को धीरे-धीरे छेद न करे।जब केशिका स्थिति में हो, तो मिश्रण को केंद्रीय नहर में इंजेक्ट करने के लिए पैर के पेडल को दबाएं और दबाएं। यदि केशिका को ठीक से रखा गया है, तो राइबोन्यूक्लियर प्रोटीन मिश्रण केंद्रीय नहर के साथ दोनों दिशाओं में नीली रेखा के रूप में फैल जाएगा। केशिका को सही ढंग से स्थान देना चुनौतीपूर्ण हो सकता है।यदि मिश्रण सही ढंग से नहीं फैलता है, तो फुटपैड दबाते समय छोटे चरणों में केशिका की स्थिति को समायोजित करें। पैर पेडल को तब तक पकड़ते रहें जब तक मिश्रण रीढ़ की हड्डी के अंत में टर्मिनल वेसिकल और मस्तिष्क में वेंट्रिकल तक न पहुंच जाए। इंजेक्शन के दौरान इंजेक्शन दबाव को समायोजित करना आवश्यक हो सकता है।इंजेक्शन के तुरंत बाद, बर्फ पर तैयार एगर उठे इलेक्ट्रोपॉरेशन प्लेट पर जानवर को स्थानांतरित करने के लिए रिंग संदंश का उपयोग करें और पूंछ को भट्ठा के अंदर रखें ताकि यह एगर उठे द्वारा सैंडविच हो। पूंछ के दोनों ओर कुओं में इलेक्ट्रोड रखें, इस बात का ख्याल रखते हुए कि पूरे जानवर और इलेक्ट्रोड बर्फ-ठंडे पीबीएस द्वारा कवर किए जाते हैं और इलेक्ट्रोपॉरेशन शुरू करने के लिए पैर स्विच दबाते हैं। फिर पूर्ण वसूली तक निगरानी के साथ जानवर को पानी में वापस करें और बाद के जानवरों को उसी तरीके से इंजेक्ट और इलेक्ट्रोपरेट करें।प्रोटीन स्तर पर नॉक आउट की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए, पूंछ का एक क्रॉस-सेक्शन प्राप्त करें और मानक प्रोटोकॉल के अनुसार इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण करें। वैकल्पिक रूप से, इलेक्ट्रोपोजेटेड रीढ़ की हड्डी निकालें और डीएनए प्राप्त करने के लिए नमूना lyse। फिर संपादित आनुवंशिक लोकी के प्रतिशत का आकलन करने के लिए सेंगर अनुक्रमण या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के बाद जेनोटीपिंग पीसीआर करते हैं।एक्सोलोटल रीढ़ की हड्डी केंद्रीय नहर में Sox2 के खिलाफ Cas9 गाइड आरएनए परिसरों के इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपाउशन से रीढ़ की हड्डी के तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के बहुमत में Sox2 इम्यूनोरएक्टिविटी का भारी नुकसान होता है, जो एक नियंत्रण के रूप में टायरोसाइनेस के खिलाफ Cas9 गाइड आरएनए परिसरों के इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपाउशन की तुलना में होता है। रीढ़ की हड्डी के ऊतक अनुभाग नमूनों में Sox2-सकारात्मक कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करने से Cas9 Sox2 गाइड आरएनए इलेक्ट्रोपॉलपॉरेशन नॉक आउट जानवरों में Sox2-व्यक्त कोशिकाओं की संख्या में काफी कमी का पता चलता है, यह दर्शाता है कि इस विधि रीढ़ की हड्डी तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं में एक कुशल और अत्यधिक मर्मज्ञ जीन नॉक आउट की ओर जाता है । सर्वव्यापी GFP अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक एक्सोलोट्स में Sox2 और GFP के खिलाफ दो Cas9 गाइड आरएनए परिसरों के एक साथ इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपाउशन के बाद, डबल नॉक आउट तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का एक उच्च प्रतिशत मनाया जाता है, यह दर्शाता है कि प्रोटोकॉल का उपयोग लचीले तरह से कई जीन को खटखटाने के लिए किया जा सकता है।यह एक केशिका के साथ केंद्रीय नहर को लक्षित करने का अभ्यास करने के लिए और जब इंजेक्शन की उम्मीद के अनुसार काम नहीं करता है के लिए समस्या निवारण कदम के साथ फार्मूला पर डाल करने के लिए उपयोगी है । यह तकनीक शोधकर्ताओं को तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं में जीन के कार्यों का अध्ययन करने की अनुमति देती है जो पुनर्जनन के लिए विशिष्ट हैं। केशिका में हेरफेर करते समय ध्यान रखें और सुनिश्चित करें कि अपनी उंगलियों को छुरा न दें।

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में सीआरआईएसपीआर / कैस 9-मध्यस्थता वाली जीन नॉकआउट्स के चयन-आश्रित और स्वतंत्र जनरेशन

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

एक मानक पद्धति पर जांच करने के लिए साइट Mutagenicity के एक समारोह के रूप में बिंदु उत्परिवर्तन मरंमत Catalyzed द्वारा CRISPR/Cas9 और SsODN मानव कोशिकाओं में

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection CRISPR/Cas9 प्रोटीन की चैनल कैटफ़िश, Ictalurus punctatus, जीन संपादन के लिए भ्रूण

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

CRISPR/Cas9 के लिए Integrase-कमी Lentiviral वैक्टर के उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल-विभाजन कोशिकाओं में मध्यस्थता जीन नॉकआउट

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Murine और मानव टेम जनक कोशिकाओं के अत्यधिक कुशल जीन व्यवधान CRISPR द्वारा Cas9/

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

अंतर्जात प्रोटीन टैगिंग में मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं का उपयोग CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

तैयारी और अमानवीय रहनुमा टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं के जीन संशोधन

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

का उपयोग निशानची-Cas9 का लक्ष्य कम करने के लिए crispr-Cas9 के नुकसान के बिना निर्देशित विकास के माध्यम से पर लक्ष्य गतिविधि की हानि के लिए

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoप्रोटीन-मध्यस्थ सटीक जीन संपादन द्वारा ट्यूब इलेक्ट्रोपोरेशन

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

मानव Pluripotent स्टेम सेल में CRISPR-CAS9 का उपयोग कर परिभाषित जीनोमिक संशोधनों का उत्पादन

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...