Name: direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes
Uploaded: 2019-07-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes at JoVE.com

Ringraziamo la prof.ssa Elly M. Tanaka per il suo continuo e lungo supporto. Questo lavoro è stato sostenuto da una National Natural Science Foundation of China (NSFC) Grant (317716), Research Starting Grants della South China Normal University (S82111 e 8S0109), e un China Postdoctoral Science Foundation Grant (2018M633067).

Tutti gli esperimenti sugli animali devono essere effettuati in conformità con le normative locali e nazionali in materia di sperimentazione animale e con l'approvazione del comitato di revisione istituzionale competente.
1. Preparazione del mix DI RNP CAS9-gRNA
<ol><li>Progettare e sintetizzare gRNA. NOTA: fare riferimento ad altre pubblicazioni per la progettazione e la sintesi di gRNA, inclusa una esclusivamente relativa agli axolotl15,<sup class="xr...

<ol>
	<li>O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+the+ependyma+during+axolotl+spinal+cord+regeneration:+Changes+in+intermediate+filament+and+fibronectin+expression.">Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression.</a> Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+Central+Nervous+System+During+Salamander+Tail+Regeneration+from+the+Implanted+Neurospheres.">Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres.</a> Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).</li><li>Nordlander, R. H., Singer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ependyma+in+regeneration+of+the+spinal+cord+in+the+urodele+amphibian+tail.">The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail.</a> Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-+and+time-directed+electroporation+of+CAS9+protein&#8211;gRNA+complexes+in+vivo+yields+efficient+multigene+knock-out+for+studying+gene+function+in+regeneration.">Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein&#8211;gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration.</a> npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+genomic+deletion+of+Sox2+in+the+axolotl+shows+a+requirement+in+spinal+cord+neural+stem+cell+amplification+during+tail+regeneration.">CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome.">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 373548, (2019).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sal-Site:+Integrating+new+and+existing+ambystomatid+salamander+research+and+informational+resources.">Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources.</a> BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Stewart, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+RNA-seq+Analysis+in+the+Unsequenced+Axolotl:+The+Oncogene+Burst+Highlights+Early+Gene+Expression+in.">Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in.</a> the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+optimization+of+CRISPR&#8211;Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Application and optimization of CRISPR&#8211;Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li><li>Holder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+growth+of+the+motor+system+in+the+axolotl.">Continuous growth of the motor system in the axolotl.</a> Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).</li><li>Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salamander+spinal+cord+regeneration:+The+ultimate+positive+control+in+vertebrate+spinal+cord+regeneration.">Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration.</a> Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).</li><li>Albors, A. R., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Electroporation+of+the+Spinal+Cord+in+Larval+Axolotl.">High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).</li><li>Albors, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Planar+cell+polarity-mediated+induction+of+neural+stem+cell+expansion+during+axolotl+spinal+cord+regeneration.">et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration.</a> eLife. 4, 1-29 (2015).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Graham, D. B., Root, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resources+for+the+design+of+CRISPR+gene+editing+experiments.">Resources for the design of CRISPR gene editing experiments.</a> Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li></ol>

Il protocollo descritto consente l'abbattimento del gene limitato di tempo e spazio nelle NSC nel midollo spinale axolotl. Il protocollo corrente consente il targeting specifico delle NSC a un'ora e una posizione definite con elevata penetrazione. Evita potenziali effetti indesiderati derivanti dall'eliminazione genica nelle NSC in altre regioni come il cervello che si verificano quando si utilizza il sistema Cre-LoxP. Evita inoltre effetti di sviluppo derivanti da un knock-out persistente, consentendo lo studio della fu...

Il midollo spinale della maggior parte dei vertebrati non è in grado di rigenerarsi dopo lesioni, portando a disabilità permanente. Diverse salamandre, come l'axolotl, sono eccezioni degne di nota. L'axolotl può rigenerare completamente un midollo spinale strutturalmente identico e ripristinare completamente la funzione del midollo spinale. Gran parte della capacità rigenerativa del midollo spinale axolotl è dovuta alle cellule ependymal. Queste cellule allineano il canale centrale, e a differenza di quelle nei mammiferi, le cellule ependymal axolotli rimangono come cellule staminali neurali (NSC) sviluppo post-embrionale. Dopo la lesione del midollo spinale (ad esempio, da un'amputazione della coda), queste NSC proliferano per far ricrescere il tubo ependymal e differenziarsi per sostituire i neuroni perduti1,2,3. Scoprire come le NSC axolotl spinal cord rimangono pluripotenti e si attivano dopo la lesione può fornire preziose informazioni sullo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per i pazienti umani.
A causa dei progressi nella tecnica di knock-out del gene CRISPR-Cas9, l'esecuzione di knock-out per decifrare la funzione genica è diventata più facile ed è stato dimostrato di avere un'ampia applicabilità in varie specie, tra cui axolotls4,5, 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8. Il recente rilascio dell'intero genoma axolotl e del trascrittoma consente ora di prendere di mira qualsiasi locus genomico e di valutare meglio gli effetti fuori target9,10,11,12 , 13 del sistema , 14.Sono stati sviluppati protocolli ottimizzati per knock-out e knock-in in axolotls utilizzando il sistema CRISPR-Cas915. La consegna del macchinario CRISPR-Cas9 sotto forma di proteina-gRNA ribonucleoproteina CAS9 (RNP) ha dimostrato di essere più efficiente rispetto all'utilizzo di Cas9 e plasmidi di codifica gRNA4. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che il RNP è di dimensioni inferiori rispetto ai vettori plasmici, alla sua capacità di creare immediatamente le rotture del DNA e alla protezione del gRNA dalla degradazione dell'RNA. Inoltre, l'utilizzo di RNP bypassa la trascrizione e la traduzione; così, evita problemi come la forza promotrice e l'uso ottimale di codone quando gli elementi plasmidi sono derivati da una specie diversa.
Gli studi sulla perdita di funzione sono uno degli approcci generali allo studio delle potenziali funzioni dei geni di interesse. Per studiare la funzione genica durante la rigenerazione, un knock-out dovrebbe idealmente essere eseguito appena prima di una lesione per evitare effetti sullo sviluppo. Inoltre, l'eliminazione dovrebbe essere limitata sia alle NSC che alla regione di rigenerazione. Un knock-out del gene bersaglio in tutte le NSC (comprese quelle nel cervello, come nel caso dei sistemi Cre-LoxP), può produrre effetti non correlati alla rigenerazione che possono confondere l'interpretazione dei risultati. Fortunatamente, la struttura del midollo spinale axolotl offre un'opportunità unica per l'eliminazione limitata di tempo e spazio nelle NSC. La maggior parte delle NSC del midollo spinale sono in contatto con il canale centrale e costituiscono la stragrande maggioranza delle cellule a contatto con il canale centrale16,17. Pertanto, un'iniezione del complesso CAS9-gRNA nel canale centrale, seguita da elettroporazione, consente la consegna agli NSC del midollo spinale in una regione desiderata in un momento specifico4,18,19. Questo protocollo dimostra come questo viene eseguito, portando ad altamente penetrante knock-out nelle NSC midollo del midollo spinale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1355px;" width="1354">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Agarose</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">A9539</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;Benzocaine</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">E1501-100G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 0.03 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 500 ml of 10&#215; TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter&#8217;s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. &#65279;The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 10 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Borosilicate glass capillaries &#65279;1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D.</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">BF120-94-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;102382</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">CAS9 buffer, 10x</td>
			<td style="width:455px;">Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at &#8722;20 &#176;C for up to 24 months</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;CAS9-NLS protein&#160;&#160;</td>
			<td style="width:455px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:241px;">CP03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Cell culture dishes, 10cm</td>
			<td style="width:455px;">Falcon</td>
			<td style="width:241px;">351029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11254-20</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Electroporator</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">NEPA21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;"></td>
			<td style="width:455px;">BEX</td>
			<td style="width:241px;">Pulse Generator CUY21EDIT II</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Fast Green FCF Solution, 5x</td>
			<td style="width:455px;">Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1&#215; PBS.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Flaming/Brown Micropipette Puller&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:492px;">&#65279;Holtfreter&#8217;s solution 400% (wt/vol)&#160;</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 11.125 g of MgSO4&#183;7H2O, 5.36 g of CaCl2&#183;2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">KCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;104936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;105886</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Microloader pipette tips</td>
			<td style="width:455px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:241px;">5242956003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Narishige</td>
			<td style="width:241px;">MN-153&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">NaCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;106404</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Pneumatic PicoPump</td>
			<td style="width:455px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:241px;">SYS-PV830</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Ring Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11103-09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:455px;">Olympus</td>
			<td style="width:241px;">SZX10&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Tris base</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;T6066</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="112">
			<td height="112" style="height:112px;width:492px;">Tris-buffered saline, 10x</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;CUY650P10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
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direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes

L'axolotl ha la capacità unica di rigenerare completamente il suo midollo spinale. Ciò è in gran parte dovuto alle cellule ependymal rimaste come cellule staminali neurali (NSC) per tutta la vita, che proliferano per riformare il tubo ependymal e si differenziano in neuroni persi dopo la lesione del midollo spinale. Decifrare come queste NSC mantengono la pluripotenza post-sviluppo e proliferano sulla lesione del midollo spinale per riformare l'esatta struttura pre-infortunio può fornire preziose informazioni su come i midollo spinale dei mammiferi possono rigenerarsi e sulle potenziali opzioni di trattamento. L'esecuzione di eliminazioni genetiche in sottoinsiemi specifici di NSC in un periodo di tempo limitato consentirà di studiare i meccanismi molecolari alla base di questi processi rigenerativi, senza essere confusi dagli effetti perturbanti dallo sviluppo. Qui è descritto un metodo per eseguire il knock-out genico negli NSC axolotl del midollo spinale utilizzando il sistema CRISPR-Cas9. Iniettando il complesso CAS9-gRNA nel canale centrale del midollo spinale seguito dall'elettroporazione, i geni bersaglio vengono eliminati nelle NSC all'interno di specifiche regioni del midollo spinale in un momento desiderato, consentendo studi molecolari delle NSC del midollo spinale durante Rigenerazione.

L'iniezione e l'elettroporazione del complesso DI CAS9-gRNA contro Sox2 nel canale centrale del midollo spinale axolotl hanno portato a una massiccia perdita di immunoreattività SOX2 nella maggior parte delle NSC del midollo spinale, con gRNA contro la tirosinasi (Tyr) come controllo (Figura 2) come controllo(Figura 2) A). B3-tubulina (macchiata con TUJ1) è un marcatore per i neuroni e non è stato espresso nelle NSC, e le cellule SOX2- TUJ1- che circondano il can...

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Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Knock-out gene diretto delle cellule staminali neurali del midollo spinale ad axolotl tramite elettroporazione dei complessi CAS9 Protein-gRNA

Presentato qui è un protocollo per eseguire il knock-out genico limitato nel tempo e nello spazio nei midollo spinale axolotl iniettando il complesso CAS9-gRNA nel canale centrale del midollo spinale seguito dall'elettroporazione.

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Questo protocollo consente di eliminare il tempo rapido e altamente penetrante e il gene a limiti di spazio nelle cellule staminali neurali del midollo spinale axolotl per lo studio dei meccanismi molecolari della rigenerazione del midollo spinale. Questa tecnica consente lo studio della funzione genica nelle cellule staminali neurali, la sua rigenerazione medica senza essere confusa da effetti di sviluppo o effetti di altri tipi di cellule. Le cellule staminali neurali axolotl contribuiscono in gran parte alla loro capacità di rigenerare il midollo spinale.Comprendere i meccanismi di rigenerazione potrebbe portare a approfondimenti per lo sviluppo di trattamenti per lesioni del midollo spinale umano. Questo metodo fornisce informazioni su come le cellule staminali neurali axolotl montano una risposta rigenerativa alla lesione del midollo spinale. Posizionare correttamente il capillare di iniezione nella colonna centrale del midollo spinale può essere impegnativo e praticare sugli animali da test aiuta a padroneggiare la tecnica.La visualizzazione dell'amministrazione può mostrare come eseguire l'iniezione e come appare un'iniezione riuscita. Per preparare la miscela di proteine ribonucleari RNA guida Cas9, mescolare cinque microgrammi di proteina della sequenza di localizzazione nucleare Cas9, quattro microgrammi di RNA guida e 0,9 microlitri di tampone Cas9 10X. Quindi portare il volume totale a 10 microlitri con acqua priva di nucleasi e conservare la miscela di proteine ribonucleari RNA guida Cas9 a meno 80 gradi Celsius se non utilizzata immediatamente.Per la preparazione della piastra di elettroporazione dell'agarosio, preparare 200 millilitri di 2%agarosio nel PBS di Dulbecco e sciogliere la miscela in un forno a microonde. Dopo un leggero raffreddamento, versare l'agarosio liquido in piastre di Petri di 10 centimetri a una profondità di circa 10 millimetri e lasciare che le piastre si solidificheranno a temperatura ambiente. Quando l'agarosio è sodo al tatto, usa un bisturi chirurgico per tagliare una fessura nell'agarosio di ogni piatto per tenere la coda dritta, un pozzo adatto al corpo dell'animale e due pozzali extra per tenere gli elettrodi.Quindi posizionare le piastre sul ghiaccio e riempirle sul bordo con DPBS ghiacciato. Per configurare l'elettroporatore, impostare l'impulso poring su un impulso bipolare a 70 volt con una durata di cinque millisecondi, un intervallo di 50 millisecondi e nessun decadimento della tensione. Impostare l'impulso di trasferimento su quattro impulsi bipolari di 40 volt con una durata di 50 millisecondi, un intervallo di 999 millisecondi e un decadimento della tensione del 10%.Quindi collegare gli elettrodi all'elettroporatore e regolare le pinzette in modo che siano distanti sette millimetri prima di immergere gli elettrodi in un becher di PBS. Per preparare capillari di micro-iniezione di vetro, eseguire un test di rampa su un estrattore di micropipette secondo le istruzioni del produttore per determinare il valore del calore. Quindi tirare i capillari di iniezione con estremità affusolata con i parametri indicati.Dopo aver tirato, utilizzare un microscopio stereo e forceps fini per rompere il capillare ad angolo in modo che abbia una punta inclinata in una posizione in cui la punta è abbastanza sottile da colpire il canale centrale della colonna vertebrale axolotl pur rimanendo abbastanza forte da perforare la pelle. Prima di caricare la punta, aggiungere una soluzione FCF verde veloce alla miscela proteica ribonucleare con un rapporto uno a 30 e utilizzare una punta di pipetta a caricamento gel per caricare circa cinque microlitri della miscela di iniezione nel capillare. Quindi montare il capillare sulla pompa pneumatica con la punta inclinata rivolta verso il basso.Per configurare la pompa pneumatica, impostare la presa su 0,5 libbre per pollice quadrato, l'espulsione su due libbre per pollice quadrato e la durata da recintare. Per testare le impostazioni capillare e della pompa, immergere il capillare in una goccia d'acqua e premere il pedale per iniettare. Il mix di iniezione dovrebbe uscire in un flusso lento ma costante.Per iniettare la miscela proteica ribonucleare, capovolgere gli assoloni da iniettare a testa in giù nell'acqua per confermare la sedazione e utilizzare le forcette ad anello per trasferire un animale su un letto di silicone con il lato sinistro dell'animale rivolto verso l'alto e la coda rivolta a destra. Posizionare il sito di iniezione al centro del campo visivo del microscopio stereo e regolare il micromanipolatore in modo che il capillare entri nell'animale con un angolo di 60 gradi dal lato destro del campo visivo. Dopo aver identificato il midollo spinale e il canale centrale, spostare lentamente il capillare verso il canale centrale del midollo spinale fino a quando non perfora delicatamente la pelle e il muscolo.Quando il capillare è in posizione, premere e tenere premuto il pedale per iniettare la miscela nel canale centrale. Se il capillare è stato posizionato correttamente, la miscela di proteine ribonucleari si diffonderà lungo il canale centrale come linea blu in entrambe le direzioni. Può essere difficile posizionare correttamente il capillare.Se la miscela non si diffonde correttamente, regolare la posizione capillare a piccoli passi mantenendo premuto il pedino. Continuare a tenere premuto il pedale fino a quando la miscela raggiunge la vescicola terminale alla fine del midollo spinale e i ventricoli nel cervello. Potrebbe essere necessario regolare la pressione di espulsione durante l'iniezione.Immediatamente dopo l'iniezione, utilizzare le forcette ad anello per trasferire l'animale sulla piastra di elettroporazione dell'agarosio preparata sul ghiaccio e posizionare la coda all'interno della fessura in modo che sia inserita dall'agarosio. Posizionare gli elettrodi nei pozzi su entrambi i lati della coda, facendo attenzione che l'intero animale e gli elettrodi siano coperti da PBS ghiacciato e premere l'interruttore del piede per avviare l'elettroporazione. Quindi riportare l'animale in acqua con monitoraggio fino al pieno recupero e iniettare ed elettroporare gli animali successivi allo stesso modo.Per valutare l'efficienza del knock-out a livello proteico, ottenere una sezione trasversale della coda ed eseguire analisi immunoistochimiche secondo protocolli standard. In alternativa, estrarre il midollo spinale elettroporato e llyse il campione per ottenere il DNA. Quindi eseguire la PCR genotipizzazione seguita dal sequenziamento Sanger o dal sequenziamento di nuova generazione per valutare la percentuale di loci genetici modificati.L'iniezione e l'elettroporazione dei complessi di RNA guida Cas9 contro Sox2 nel canale centrale del midollo spinale axolotl porta a una massiccia perdita di immunoreattività sox2 nella maggior parte delle cellule staminali neurali del midollo spinale rispetto all'iniezione e all'elettroporazione dei complessi di RNA guida Cas9 contro la tirosinasi come controllo. La quantificazione delle cellule sox2-positive nei campioni di sezione del tessuto del midollo spinale rivela un numero significativamente ridotto di cellule che esprimono Sox2 negli animali knock-out di elettroporazione dell'RNA guida Cas9 Sox2, indicando che questo metodo porta a un knock-out genico efficiente e altamente penetrante nelle cellule staminali neurali del midollo spinale. Dopo l'iniezione simultanea e l'elettroporazione di due complessi di RNA guida Cas9 contro Sox2 e GFP in axolotl transgenici con espressione onnipresente GFP, si osserva un'alta percentuale di cellule staminali neurali a doppio knock-out, indicando che il protocollo può essere utilizzato per eliminare in modo flessibile più geni.È utile esercitarsi a prendere di mira il canale centrale con un capillare e indossare una formula con le fasi di risoluzione dei problemi per quando l'iniezione non funziona come previsto. Questa tecnica consente ai ricercatori di studiare le funzioni dei geni nelle cellule staminali neurali che sono specifici per la rigenerazione. Fai attenzione quando manipoli il capillare e assicurati di non pugnalare le tue dita.

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selezione-dipendente e generazione indipendente di CRISPR / Cas9-mediata Gene Knockouts nelle cellule di mammiferi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Ricerca

Genetica

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Una metodologia Standard per esaminare in loco mutagenicità in funzione della mutazione di punto riparazione catalizzata da CRISPR/Cas9 e SsODN in cellule umane

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection di proteine CRISPR/Cas9 in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embrioni per Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Un protocollo per la produzione di vettori lentivirali integrasi-carenti per CRISPR/Cas9-mediata Knockout del Gene nelle cellule in divisione

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Preparazione e modificazione genetica di staminali ematopoietiche Nonhuman Primate e cellule progenitrici

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Utilizzando il cecchino-Cas9 a minimizzare gli effetti di fuori bersaglio di CRISPR-Cas9 senza la perdita di attività On-target tramite Evolution diretto

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteina-mediato Precision Gene Editing da Elettroporazione Tube

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generazione di modifiche genomiche definite utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...