Name: direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes
Uploaded: 2019-07-09T14:00:00
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継続的かつ長期的な支援を賜り、ありがとうございます。この研究は、中国国立自然科学財団(NSFC)助成金(317716)、南中国師範大学(S82111および8S0109)からの研究開始助成金、および中国ポストドクター科学財団助成金(2018M633067)によって支援されました。

すべての動物実験は、動物実験に関する地域および国の規制に従い、関連する機関審査委員会の承認を得て行われる必要があります。
1. CAS9-gRNA RNP ミックスの準備
<ol><li>gRNAの設計と合成を行います。 注: gRNA の設計および合成に関する他の出版物を参照してください。</li...

<ol>
	<li>O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+the+ependyma+during+axolotl+spinal+cord+regeneration:+Changes+in+intermediate+filament+and+fibronectin+expression.">Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression.</a> Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+Central+Nervous+System+During+Salamander+Tail+Regeneration+from+the+Implanted+Neurospheres.">Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres.</a> Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).</li><li>Nordlander, R. H., Singer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ependyma+in+regeneration+of+the+spinal+cord+in+the+urodele+amphibian+tail.">The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail.</a> Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-+and+time-directed+electroporation+of+CAS9+protein&#8211;gRNA+complexes+in+vivo+yields+efficient+multigene+knock-out+for+studying+gene+function+in+regeneration.">Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein&#8211;gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration.</a> npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+genomic+deletion+of+Sox2+in+the+axolotl+shows+a+requirement+in+spinal+cord+neural+stem+cell+amplification+during+tail+regeneration.">CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome.">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 373548, (2019).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sal-Site:+Integrating+new+and+existing+ambystomatid+salamander+research+and+informational+resources.">Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources.</a> BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Stewart, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+RNA-seq+Analysis+in+the+Unsequenced+Axolotl:+The+Oncogene+Burst+Highlights+Early+Gene+Expression+in.">Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in.</a> the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+optimization+of+CRISPR&#8211;Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Application and optimization of CRISPR&#8211;Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li><li>Holder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+growth+of+the+motor+system+in+the+axolotl.">Continuous growth of the motor system in the axolotl.</a> Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).</li><li>Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salamander+spinal+cord+regeneration:+The+ultimate+positive+control+in+vertebrate+spinal+cord+regeneration.">Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration.</a> Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).</li><li>Albors, A. R., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Electroporation+of+the+Spinal+Cord+in+Larval+Axolotl.">High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).</li><li>Albors, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Planar+cell+polarity-mediated+induction+of+neural+stem+cell+expansion+during+axolotl+spinal+cord+regeneration.">et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration.</a> eLife. 4, 1-29 (2015).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Graham, D. B., Root, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resources+for+the+design+of+CRISPR+gene+editing+experiments.">Resources for the design of CRISPR gene editing experiments.</a> Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li></ol>

記載されたプロトコルは、軸総部脊髄のNSCにおける時間および空間制限遺伝子ノックアウトを可能にする。現在のプロトコルでは、NSC を定義された時間と場所で特定のターゲティングを可能にします。Cre-LoxPシステムを使用する際に発生する脳などの他の領域のNSCの遺伝子ノックアウトに起因する潜在的な望ましくない影響を回避します。また、持続的なノックアウトに起因する発達効果を?...

ほとんどの脊椎動物の脊髄は、損傷後に再生することができず、永久的な障害につながる。アクソロトルのようないくつかのサラマンダーは、顕著な例外です。アクソロtlは構造的に同一の脊髄を完全に再生し、脊髄機能を完全に回復させることができる。軸次脊髄の再生能力の多くは、エペンディマル細胞によるものです。これらの細胞は中央運河に並び、哺乳類とは異なり、軸三ロットエペンディマル細胞は胚発生後の神経幹細胞(NSC)として残ります。脊髄損傷(例えば、尾切断から)の後、これらのNSCは、エペンディマルチューブを再成長させ、失われたニューロン1、2、3を置き換えるために分化するために増殖する。アクソロtl脊髄NSCが多能性であり、損傷後に活性化される方法を明らかにすると、ヒト患者の新しい治療戦略の開発に関する貴重な情報を提供することができます。
CRISPR-Cas9遺伝子ノックアウト技術の進歩により、遺伝子機能を解読するためのノックアウトを行うことが容易になり、アキセロチル4、5を含む様々な種で幅広い適用性を有することが示されている。6,7,8.完全なアクソロトルゲノムとトランスクリプトームの最近のリリースは、現在、任意のゲノム遺伝子座を標的にし、より良いオフターゲット効果9、10、11、12を評価することができます,13歳,14.CRISPR-Cas9システム15を使用してアクセオロチルのノックアウトおよびノックイン用に最適化されたプロトコルが開発されました。CAS9タンパク質-gRNAリボヌクレオタンパク質(RNP)の形態でのCRISPR-Cas9機械の送達は、Cas9およびgRNAコードプラスミド4を使用するよりも効率的であることが示された。これは、RNPがプラスミドベクターよりもサイズが小さく、DNA切断をすぐに作成する能力、およびRNA分解からgRNAを保護するためである可能性があります。さらに、RMP を使用すると、転写と変換をバイパスします。したがって、プラスミド要素が異なる種から派生した場合、プロモーター強度や最適なコドン使用量などの問題を回避します。
機能喪失研究は、対象遺伝子の潜在的な機能を調査するための一般的なアプローチの一つです。再生中の遺伝子機能を研究するためには、発達への影響を避けるために、損傷の直前にノックアウトを行うのが理想的です。さらに、ノックアウトは NSC と再生領域の両方に制限する必要があります。すべてのNSC(Cre-LoxPシステムの場合)における標的遺伝子のノックアウトは、結果の解釈を混乱させる可能性のある再生に関連しない効果を生み出す可能性があります。幸いなことに、軸総進脊髄の構造はNSCの時間およびスペース制限されたノックアウトのための独特な機会を提供する。脊髄NSCのほとんどは中央管と接触し、中央運河16、17と接触する細胞の大部分を構成する。したがって、CAS9-gRNA複合体を中央運河に注入し、続いてエレクトロポレーションを行い、特定の時間4、18、19における所望の領域における脊髄NSCへの送達を可能にする。このプロトコルは、これがどのように行われるかを示し、標的脊髄NSCのノックアウトを高度に浸透させ、その後の分析を行い、再生およびNSC行動への影響を研究する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1355px;" width="1354">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Agarose</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">A9539</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;Benzocaine</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">E1501-100G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 0.03 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 500 ml of 10&#215; TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter&#8217;s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. &#65279;The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 10 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Borosilicate glass capillaries &#65279;1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D.</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">BF120-94-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;102382</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">CAS9 buffer, 10x</td>
			<td style="width:455px;">Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at &#8722;20 &#176;C for up to 24 months</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;CAS9-NLS protein&#160;&#160;</td>
			<td style="width:455px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:241px;">CP03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Cell culture dishes, 10cm</td>
			<td style="width:455px;">Falcon</td>
			<td style="width:241px;">351029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11254-20</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Electroporator</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">NEPA21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;"></td>
			<td style="width:455px;">BEX</td>
			<td style="width:241px;">Pulse Generator CUY21EDIT II</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Fast Green FCF Solution, 5x</td>
			<td style="width:455px;">Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1&#215; PBS.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Flaming/Brown Micropipette Puller&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:492px;">&#65279;Holtfreter&#8217;s solution 400% (wt/vol)&#160;</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 11.125 g of MgSO4&#183;7H2O, 5.36 g of CaCl2&#183;2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">KCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;104936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;105886</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Microloader pipette tips</td>
			<td style="width:455px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:241px;">5242956003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Narishige</td>
			<td style="width:241px;">MN-153&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">NaCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;106404</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Pneumatic PicoPump</td>
			<td style="width:455px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:241px;">SYS-PV830</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Ring Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11103-09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:455px;">Olympus</td>
			<td style="width:241px;">SZX10&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Tris base</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;T6066</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="112">
			<td height="112" style="height:112px;width:492px;">Tris-buffered saline, 10x</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;CUY650P10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes

軸次は脊髄を完全に再生する独特な機能を有する。これは主に、生涯を通じて神経幹細胞(NSC)として残存するエペンディマル細胞が、エペンディマルチューブを改変し、脊髄損傷後に失われたニューロンに分化するために増殖するためである。これらのNSCが発達後に多能性を維持し、脊髄損傷時に増殖する方法を解読し、正確な損傷前の構造を改革することで、哺乳類の脊髄がどのように再生できるか、また潜在的な治療選択肢に関する貴重な洞察を提供することができます。限られた期間内にNSCの特定のサブセットで遺伝子ノックアウトを行うことで、開発摂動効果に惑わされることなく、これらの再生プロセスの背後にある分子機構の研究が可能になります。ここで説明するCRISPR-Cas9システムを用いて軸次脊髄NSCで遺伝子ノックアウトを行う方法である。CAS9-gRNA複合体を脊髄中央管路に注入し、その後エレクトロポレーションを行うことで、標的遺伝子は所望の時点で脊髄の特定の領域内のNSCでノックアウトされ、期間中に脊髄NSCの分子研究が可能になります。再生。

軸次脊髄中央管へのSox2に対するCAS9-gRNA複合体の注入とエレクトロポレーションは、脊柱NSCの大部分でSOX2免疫反応性の大規模な損失を引き起こし、コントロールとしてチロシナーゼ(Tyr)に対するgRNAを用いた(図2)。A)B3-チューブリン(TUJ1で染色された)はニューロンのマーカーであり、NSCでは発現しなかったが、中央管を取り囲むSOX2-TUJ1-細胞はSox2?...

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Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

CAS9タンパク質-gRNA複合体のエレクトロポレーションによるアクソロトル脊髄神経幹細胞の直接遺伝子ノックアウト

ここに提示されるプロトコルは、CAS9-gRNA複合体を脊髄中央管に注入し、続いてエレクトロポレーションを行うことによって、軸総便脊髄の時間および空間制限遺伝子ノックアウトを行うプロトコルである。

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

このプロトコルは、脊髄再生の分子機構の研究のために、アキソロテル脊髄神経幹細胞における迅速かつ高度に貫通する時間および空間制限遺伝子ノックアウトを可能にする。この技術は、神経幹細胞における遺伝子機能の研究を可能にし、その医学的再生は、他の細胞型の発達効果または効果によって混乱することなく。アキソロテル神経幹細胞は、脊髄を再生する能力に大きく貢献しています。再生メカニズムを理解することは、ヒト脊髄損傷の治療法を開発するための洞察につながる可能性があります。この方法は、アショロテル神経幹細胞が脊髄損傷に対する再生応答をどのように取り付けるかについての洞察を提供する。注射毛細血管を脊髄中央列に正しく配置することは困難であり、試験動物に練習することは、技術を習得するのに役立ちます。投与を見ると、注射の実行方法と、正常な注射がどのように見えるかを示すことができます。Cas9ガイドRNAリボ核タンパク質混合物を調製するには、Cas9核局在配列タンパク質の5マイクログラム、ガイドRNAの4マイクログラム、および10X Cas9バッファーの0.9マイクロリットルを混合します。その後、ヌクレアーゼフリー水で総体積を10マイクロリットルにし、Cas9ガイドRNAリボ核タンパク質混合物をマイナス80°Cですぐに使用しない場合は、摂氏80度で保存します。アガロースエレクトロポレーションプレート調製の場合、ダルベッコPBSで2%アガロースの200ミリリットルを調製し、混合物を電子レンジで溶解する。わずかな冷却の後、液体アガロースを約10ミリメートルの深さまで10センチメートルのペトリ皿に注ぎ、プレートを室温で固めます。アガロースが触れるにしっかりしている場合は、手術用メスを使用して、尾をまっすぐに保持するための各皿のアガロースのスリットをカットし、動物の体にフィットする井戸、電極を保持するための2つの余分な井戸を使用します。その後、氷の上にプレートを置き、氷冷DPBSでリムにそれらを埋めます。エレクトロポレーターを構成するには、70 ボルトの 1 つのバイポーラパルスにポーリングパルスを設定し、時間は 5 ミリ秒、間隔は 50 ミリ秒、電圧減衰なし。転送パルスを40ボルトの4つのバイポーラパルスに設定し、持続時間は50ミリ秒、間隔は999ミリ秒、電圧減衰は10%です。次に、電極をエレクトロポレーターに接続し、ピンセットを7ミリメートル離れた後に調整してから、PBSのビーカーに電極を浸します。ガラスマイクロ注入毛細血管を準備するには、メーカーの指示に従ってマイクロピペットプーラーでランプテストを行い、熱値を決定します。次に、指示されたパラメータでテーパードエンドで注射毛細血管を引っ張ります。引っ張った後、ステレオ顕微鏡と細かい鉗子を使用して毛細血管を斜めで割り、先端がアショロテル脊椎の中央運河を標的にするのに十分な薄さの位置に傾斜した先端を持ち、皮膚を突き刺すのに十分な強さを残します。先端をロードする前に、1〜30の比率でリボ核タンパク質混合物に速緑色のFCF溶液を加え、ゲルローディングピペットチップを使用して約5マイクロリットルの注入ミックスを毛細管にロードします。次に、傾斜した先端を下向きにして、空気圧ポンプにキャピラリーを取り付けます。空気圧ポンプを構成するには、ホールドを1平方インチあたり0.5ポンド、1平方インチのホールドあたり2ポンドに、ゲートする持続時間に設定します。毛細管とポンプの設定をテストするには、キャピラリーを水滴に浸し、フットペダルを押して注入します。注射ミックスは、ゆっくりと安定した流れで出てくるはずです。リボ核タンパク質混合物を注入するには、水中に逆さまに注入されるaxolotlsを反転させて沈降を確認し、リング鉗子を使用して1匹の動物をシリコーンのベッドに移し、動物の左側を上に向け、尾を右を指します。射出部位をステレオ顕微鏡の視野の中央に配置し、毛細管が視野の右側から60度の角度で動物に入るようにマイクロマニピュレーターを調整します。脊髄と中央運河を特定した後、毛細血管を脊髄の中央運河に向かってゆっくりと動かし、皮膚と筋肉を穏やかに突き刺す。毛細管が位置したら、足のペダルを押し下げて中央運河に混合物を注入します。毛細管が適切に配置されていれば、リボ核タンパク質混合物は中央運河に沿って青色の線として両方向に広がります。毛細血管を正しく配置するのは難しい場合があります。混合物が正しく広がらない場合は、フットパッドを押したまま、小さなステップでキャピラリーの位置を調整します。混合物が脊髄の端部の小胞および脳の心室に達するまで足のペダルを押し続ける。射出中に吐出圧力を調整する必要があるかもしれません。注射の直後に、リング鉗子を使用して、準備されたアガロースエレクトロポレーションプレート上の動物を氷の上に移し、尾をスリットの内側に置き、アガロースに挟まれるようにします。尾の両側の井戸に電極を入れ、動物と電極全体が氷冷PBSで覆われているのを念こみ、足スイッチを押してエレクトロポレーションを開始します。次に、完全な回復までモニタリングして動物を水に戻し、同じ方法で後続の動物を注入し、電気ポポレートします。ノックアウトの効率をタンパク質レベルで評価するには、尾部の断面を取得し、標準プロトコルに従って免疫体系解析を行います。あるいは、電気ポレートされた脊髄を抽出し、サンプルを分解してDNAを得る。次に、遺伝子型入力 PCR を実行し、続いてサンガーシーケンシングまたは次世代シーケンシングを実行して、編集された遺伝子座の割合を評価します。Cas9ガイドRNA複合体のアショロテル脊髄中央管へのAsx2に対する注入およびエレクトロポレーションは、脊髄神経幹細胞の大部分におけるSox2免疫反応性の大規模な損失をもたらし、Cas9ガイドRNA複合体をチロシナーゼに対する注射およびエレクトロポレーションと比較した。脊髄組織部サンプル中のSox2陽性細胞の定量化は、Cas9 Sox2ガイドRNAエレクトロポレーションノックアウト動物におけるSox2発現細胞の数を有意に減少させることを明らかにし、この方法が脊髄神経幹細胞における効率的で高度に貫通する遺伝子ノックアウトにつながることを示している。Sox2とGFPに対する2つのCas9ガイドRNA複合体を、ユビキタスGFP発現を有するトランスジェニックアクソロTLSに同時に注入およびエレクトロポレーションした後、二重ノックアウト神経幹細胞の高い割合が観察され、プロトコルを使用して複数の遺伝子を柔軟にノックアウトできることを示している。毛細管で中央の運河をターゲットにして練習し、注入が期待どおりに動作しない場合のトラブルシューティング手順を使用して式を置くのが役立ちます。この技術により、神経幹細胞の遺伝子の機能を再生に特異的に研究することができます。毛細血管を操作する際は注意し、自分の指を刺さないようにしてください。

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

哺乳類細胞におけるCRISPR / Cas9媒介遺伝子ノックアウトの選択依存性および独立した世代

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

遺伝子編集アメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイ胚に CRISPR/Cas9 蛋白質のマイクロインジェクション

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

細胞分裂に CRISPR/Cas9 を介した遺伝子ノックアウトのインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターの生産のためのプロトコル

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

準備とヒト以外の霊長造血幹・前駆細胞の遺伝子の改変

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

進化を介してターゲットの活性を失うことがなく CRISPR Cas9 のオフターゲット効果を最小限に抑えるための狙撃兵 Cas9 を使用してください。

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質媒介精密遺伝子編集チューブエレクトロポレーション

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...