Name: direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes
Uploaded: 2019-07-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes at JoVE.com

엘리 M. 다나카 교수님의 지속적인 장기적지원에 감사드립니다. 이 작품은 중국의 국립 자연 과학 재단에 의해 지원되었다 (NSFC) 보조금 (317716), 남중국 사범 대학에서 연구 시작 보조금 (S821111 및 8S0109), 중국 박사 후 과학 재단 보조금 (2018M633067).

모든 동물 실험은 동물 실험에 대한 지역 및 국가 규정에 따라 관련 기관 검토 위원회의 승인을 받아 수행되어야 합니다.
1. CAS9-gRNA RNP 믹스 준비
<ol><li>gRNA를 설계하고 합성합니다. 참고 : axolotls15,20,21,22에관한 것을 포함하여 gRNA를 디자인하고 합성하기위한 다른 출판물을 참조하십시?...

<ol>
	<li>O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+the+ependyma+during+axolotl+spinal+cord+regeneration:+Changes+in+intermediate+filament+and+fibronectin+expression.">Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression.</a> Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+Central+Nervous+System+During+Salamander+Tail+Regeneration+from+the+Implanted+Neurospheres.">Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres.</a> Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).</li><li>Nordlander, R. H., Singer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ependyma+in+regeneration+of+the+spinal+cord+in+the+urodele+amphibian+tail.">The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail.</a> Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-+and+time-directed+electroporation+of+CAS9+protein&#8211;gRNA+complexes+in+vivo+yields+efficient+multigene+knock-out+for+studying+gene+function+in+regeneration.">Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein&#8211;gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration.</a> npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+genomic+deletion+of+Sox2+in+the+axolotl+shows+a+requirement+in+spinal+cord+neural+stem+cell+amplification+during+tail+regeneration.">CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome.">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 373548, (2019).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sal-Site:+Integrating+new+and+existing+ambystomatid+salamander+research+and+informational+resources.">Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources.</a> BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Stewart, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+RNA-seq+Analysis+in+the+Unsequenced+Axolotl:+The+Oncogene+Burst+Highlights+Early+Gene+Expression+in.">Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in.</a> the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+optimization+of+CRISPR&#8211;Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Application and optimization of CRISPR&#8211;Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li><li>Holder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+growth+of+the+motor+system+in+the+axolotl.">Continuous growth of the motor system in the axolotl.</a> Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).</li><li>Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salamander+spinal+cord+regeneration:+The+ultimate+positive+control+in+vertebrate+spinal+cord+regeneration.">Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration.</a> Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).</li><li>Albors, A. R., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Electroporation+of+the+Spinal+Cord+in+Larval+Axolotl.">High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).</li><li>Albors, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Planar+cell+polarity-mediated+induction+of+neural+stem+cell+expansion+during+axolotl+spinal+cord+regeneration.">et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration.</a> eLife. 4, 1-29 (2015).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Graham, D. B., Root, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resources+for+the+design+of+CRISPR+gene+editing+experiments.">Resources for the design of CRISPR gene editing experiments.</a> Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li></ol>

기술된 프로토콜은 액소로틀 척수에 있는 NSC에 있는 시간 및 공간 제한한 유전자 녹아웃을 허용합니다. 현재 프로토콜은 높은 침투와 정의 된 시간과 위치에 NSC의 특정 타겟팅을 할 수 있습니다. 그것은 Cre-LoxP 시스템을 사용할 때 발생하는 뇌와 같은 다른 지역의 CS에서 유전자 녹아웃에서 발생하는 잠재적 인 원치 않는 효과를 방지 할 수 있습니다. 그것은 또한 지속적인 녹아웃에서 유래 하는 개...

대부분의 척추동물의 척수는 상해를 입고 재생할 수 없으므로 영구적인 장애를 초래합니다. 액소로틀과 같은 몇몇 도롱뇽은 주목할 만한 예외입니다. 액소로틀은 구조적으로 동일한 척수를 완전히 재생하고 척수 기능을 완전히 회복시킬 수 있습니다. 액소로틀 척수의 재생 능력의 대부분은 형형세포에 기인한다. 이 세포는 중앙 운하를 일렬로 세게하고, 포유동물에 있는 것과는 달리, axolotl ependymal 세포는 신경 줄기 세포로 남아 (NSC) 배아 후 발달. 척수 손상 후 (예를 들어, 꼬리 절단에서), 이러한 NSCs는 ependymal 관을 재성장하고 잃어버린 뉴런을 대체하기 위해 분화증1,2,3. axolotl 척수 NSC가 다능성으로 남아 있고 부상 후에 활성화되는 방법을 밝히는 것은 인간 환자를 위한 새로운 치료 전략 개발에 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다.
CRISPR-Cas9 유전자 녹아웃 기술의 발전으로 인해 유전자 기능을 해독하기 위한 녹아웃 을 수행하는 것이 더 쉬워졌으며 액소로톨 4,5를포함한 다양한 종에서 광범위한 적용 가능성을 가지고 있는 것으로 나타났습니다. 6개 , 7명 , 8. 전체 액소로틀 게놈 및 전사체의 최근 릴리스는 이제 모든 게놈 궤적을 표적으로 하고오프 타겟 효과에 더 나은 평가를 위해 9,10,11,12를 허용합니다 , 13세 , 14. CRISPR-Cas9 시스템15를사용하여 축삭에서 녹아웃 및 녹아웃을 위해 최적화 된 프로토콜이 개발되었습니다. CAS9 단백질-gRNA 리보뉴클레오프로테인트(RNP)의 형태로 CRISPR-Cas9 기계류의 전달은 Cas9 및 gRNA-인코딩 플라스미드4를사용하는 것보다 더 효율적인 것으로 나타났다. 이것은 RNP가 플라스미드 벡터보다 크기가 작고, DNA 를 즉시 생성하는 능력, RNA 분해로부터 gRNA를 보호하기 때문입니다. 또한, RNP를 사용하여 전사 및 번역을 우회; 따라서, 플라스미드 원소가 다른 종으로부터 유래될 때 프로모터 강도 및 최적의 코돈 사용과 같은 문제를 방지한다.
기능 상실 연구는 관심 있는 유전자의 잠재적인 기능을 조사하는 일반적인 접근법 중 하나입니다. 재생 중에 유전자 기능을 연구하기 위해, 녹아웃이상적으로 개발에 미치는 영향을 피하기 위해 부상 직전에 수행해야합니다. 또한 녹아웃은 NSC와 재생 영역 모두에 국한되어야 합니다. 모든 NSCs에서 표적 유전자의 녹아웃(Cre-LoxP 시스템의 경우인 뇌의 유전자 포함)은 결과의 해석을 혼동할 수 있는 재생과 관련이 없는 효과를 생성할 수 있습니다. 다행히도, 액소로틀 척수의 구조는 NSC에서 시간 및 공간 제한 녹아웃을위한 독특한 기회를 제공합니다. 척수 의 대부분은 중앙 운하와 접촉하고 중앙 운하와 접촉하는 세포의 대다수를구성합니다 16,17. 따라서 CAS9-gRNA 복합체를 중앙 운하로 주입한 다음 전기 포출을 한 후 특정 시간 4,18,19에서원하는 부위의 척수 NSC로 전달할 수 있습니다. 이 프로토콜은 이것이 어떻게 수행되는지 를 보여 주며, 표적 척수 NSC에서 고도로 관통하는 녹아웃으로 이어집니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1355px;" width="1354">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Agarose</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">A9539</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;Benzocaine</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">E1501-100G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 0.03 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 500 ml of 10&#215; TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter&#8217;s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. &#65279;The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 10 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Borosilicate glass capillaries &#65279;1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D.</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">BF120-94-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;102382</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">CAS9 buffer, 10x</td>
			<td style="width:455px;">Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at &#8722;20 &#176;C for up to 24 months</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;CAS9-NLS protein&#160;&#160;</td>
			<td style="width:455px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:241px;">CP03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Cell culture dishes, 10cm</td>
			<td style="width:455px;">Falcon</td>
			<td style="width:241px;">351029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11254-20</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Electroporator</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">NEPA21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;"></td>
			<td style="width:455px;">BEX</td>
			<td style="width:241px;">Pulse Generator CUY21EDIT II</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Fast Green FCF Solution, 5x</td>
			<td style="width:455px;">Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1&#215; PBS.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Flaming/Brown Micropipette Puller&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:492px;">&#65279;Holtfreter&#8217;s solution 400% (wt/vol)&#160;</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 11.125 g of MgSO4&#183;7H2O, 5.36 g of CaCl2&#183;2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">KCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;104936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;105886</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Microloader pipette tips</td>
			<td style="width:455px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:241px;">5242956003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Narishige</td>
			<td style="width:241px;">MN-153&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">NaCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;106404</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Pneumatic PicoPump</td>
			<td style="width:455px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:241px;">SYS-PV830</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Ring Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11103-09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:455px;">Olympus</td>
			<td style="width:241px;">SZX10&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Tris base</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;T6066</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="112">
			<td height="112" style="height:112px;width:492px;">Tris-buffered saline, 10x</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;CUY650P10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes

액소로틀은 척수를 완전히 재생할 수 있는 독특한 능력을 가지고 있습니다. 이것은 주로 신경 줄기 세포로 남아 있는 ependymal 세포 때문 (NSC) 일생 내내, 이는 ependymal 관을 개혁하고 척수 손상 후에 분실한 신경으로 분화하기 위하여 증식합니다. 이러한 NSC가 개발 후 다능성을 유지하고 정확한 사전 손상 구조를 개혁하기 위해 척수 손상 시 증식하는 방법을 해독하면 포유류 척수가 재생되는 방법과 잠재적인 치료 옵션에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 제한된 기간 내에 NSC의 특정 하위 집합에서 유전자 녹아웃을 수행하면 개발 교란 효과에 의해 혼동되지 않고 이러한 재생 프로세스 뒤에 분자 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 여기서 설명된 것은 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 축색척수 NSC에서 유전자 녹아웃을 수행하는 방법이다. CAS9-gRNA 복합체를 척수 중앙 운하에 주입하고 전기 천공에 이어 표적 유전자는 원하는 시점에서 척수의 특정 영역 내의 NSC에서 기절하여 척수 NSC의 분자 연구를 가능하게 합니다. 재생.

Sox2에 대한 CAS9-gRNA 복합체의 주입 및 전기 천공은 축색선 척수 중앙 운하로 SOX2 면역 반응성의 대규모 손실을 주도, 대조군으로 gRNA와 척수 NSCs의 대부분에 (Tyr) 대조군으로 (그림2 A). B3-tubulin (TUJ1로 염색)은 뉴런에 대한 마커이며 NSC에서 발현되지 않았으며, 중앙 운하를 둘러싼 SOX2-TUJ1 세포는 Sox2 삭제를 수용하는 세포로 간주되었다. 정량화는 CAS9-So...

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Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

CAS9 단백질-gRNA 복합체의 전기 포출을 통해 악소로틀 척수 신경 줄기 세포의 직접 유전자 녹아웃

여기에 제시된 프로토콜은 CAS9-gRNA 복합체를 척수 중앙 운하에 주입하고 전기 포공에 의해 액소로틀 척수에서 시간 및 공간 제한 유전자 녹아웃을 수행하는 프로토콜입니다.

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

이 프로토콜은 척수 재생의 분자 메커니즘에 대한 연구를 위해 축소로틀 척수 신경 줄기 세포에서 신속하고 관통하는 시간과 공간 제한 유전자 녹아웃을 허용합니다. 이 기술은 신경 줄기 세포에 있는 유전자 기능의 연구 결과, 발달 효과 또는 그밖 세포 모형에서 효력에 의해 혼동되지 않고 그것의 의학 재생을 허용합니다. Axolotl 신경 줄기 세포는 그들의 척수를 재생하는 그들의 기능에 크게 기여합니다.재생 메커니즘을 이해하면 척수 손상에 대한 치료법을 개발하기 위한 통찰력으로 이어질 수 있습니다. 이 방법은 축축골 신경 줄기 세포가 척수 손상에 재생 반응을 어떻게 장착하는지에 대한 통찰력을 제공합니다. 척수 중앙 열에 주입 모세관을 올바르게 배치하는 것은 도전이 될 수 있으며 테스트 동물에서 연습하면 기술을 마스터하는 데 도움이됩니다.관리를 보는 것은 주입을 수행하는 방법과 성공적인 주사가 어떻게 생겼는지 보여줄 수 있습니다. Cas9 가이드 RNA 리보핵 단백질 혼합물을 준비하려면 Cas9 핵 국소화 서열 단백질 5마이크로그램, 가이드 RNA 4마이크로그램, 10X Cas9 완충제의 0.9 마이크로리터를 혼합합니다. 그런 다음 핵이 없는 물로 총 부피를 10 마이크로리터로 가져와 Cas9 가이드 RNA 리보핵 단백질 혼합물을 영하 80도에 즉시 사용하지 않을 경우 저장한다.아가로즈 전기포기 플레이트 준비를 위해 덜벡코의 PBS에서 2%의 아가로즈 200밀리리터를 준비하고 혼합물을 전자레인지에 녹입니다. 약간의 냉각 후, 액체 아가로즈를 10센티미터 페트리 접시에 약 10mm 깊이로 붓고 플레이트가 실온에서 고화되도록 합니다. 아가로즈가 단단할 때, 외과용 메스를 사용하여 꼬리를 똑바로 잡기 위해 각 접시의 아가로즈에 슬릿을 자르고, 동물의 몸에 잘 맞는 우물, 전극을 잡기 위해 2개의 여분의 우물을 사용하십시오.그런 다음 접시를 얼음 위에 놓고 얼음차가운 DPBS로 림에 채웁니다. 전기포레이터를 구성하려면 5밀리초의 지속 시간, 50밀리초의 간격 및 전압 붕괴 없이 70볼트에서 포링 펄스를 하나의 양극성 펄스로 설정합니다. 전송 펄스를 40볼트의 4개의 양극성 펄스로 설정하여 50밀리초, 999밀리초 의 간격, 10%의 전압 감쇠를 설정합니다.그런 다음 전극을 전극을 전기포레이터에 연결하고 핀셋을 조정하여 PBS의 비커에 전극을 잠수하기 전에 7밀리미터 떨어져 있습니다. 유리 마이크로 주입 모세 혈관을 준비하려면 제조업체의 지침에 따라 마이크로 피펫 풀러에서 램프 테스트를 수행하여 열 값을 결정합니다. 그런 다음 표시된 매개 변수로 테이퍼 된 끝으로 사출 모세 혈관을 당깁니다.당기면 스테레오 현미경과 미세 한 집게를 사용하여 모세관을 각도로 부러 뜨리면 끝이 축소로틀 척추의 중앙 운하를 표적으로 할 만큼 얇은 위치에 기울어진 팁을 가지도록하면서 피부를 관통 할 만큼 강하게 유지하십시오. 팁을 로드하기 전에, 1- 30 비율로 리보핵 단백질 혼합물에 빠른 녹색 FCF 용액을 추가하고 젤 로딩 파이펫 팁을 사용하여 주입 혼합물의 약 5 마이크로리터를 모세관에 적재한다. 그런 다음 경사진 팁이 아래쪽으로 향하는 공압 펌프에 모세관을 장착합니다.공압 펌프를 구성하려면 홀드를 평방 인치당 0.5 파운드로 설정하고, 배출은 평방 인치 홀드당 2 파운드로, 게이트 기간은 됩니다. 모세관과 펌프 설정을 테스트하려면 모세관을 물 한 방울에 담그고 발 페달을 눌러 주입하십시오. 사출 믹스는 느리지만 꾸준한 스트림에서 나와야한다.리보핵 단백질 혼합물을 주입하려면, 진정을 확인하기 위해 물에 거꾸로 주입되는 축축토를 뒤집어 링 집게를 사용하여 동물의 왼쪽과 꼬리가 오른쪽을 가리키는 실리콘 침대에 한 동물을 이송한다. 스테레오 현미경의 시야 의 중간에 주입 부위를 배치하고 모세관이 시야의 오른쪽에서 60도 각도로 동물로 들어갈 수 있도록 미세 조작기조절기조정. 척수와 중앙 운하를 확인한 후 모세관을 척수의 중앙 운하쪽으로 천천히 움직여 피부와 근육을 부드럽게 관통합니다.모세관이 제자리에 있을 때, 발 페달을 누르고 중앙 운하에 혼합물을 주입합니다. 모세관이 제대로 배치되면, 리보핵 단백질 혼합물은 중앙 운하를 따라 양방향으로 청색선으로 퍼질 것이다. 모세관을 올바르게 배치하는 것은 어려울 수 있습니다.혼합물이 올바르게 퍼지지 않으면 풋패드를 누르면서 작은 단계로 모세관 위치를 조정합니다. 혼합물이 척수의 끝에 있는 말단 소포와 두뇌에 있는 심실에 도달할 때까지 발 페달을 계속 누르십시오. 주사 중에 배출 압력을 조정해야 할 수도 있습니다.주입 직후, 링 포셉을 사용하여 동물을 얼음 위에 준비된 아가로즈 전기기판으로 옮기고 슬릿 내부에 꼬리를 놓아 아가로즈에 의해 끼어들게 한다. 전극을 꼬리 양쪽의 우물에 넣고 전체 동물과 전극이 얼음차가운 PBS로 덮여 있음을 주의하고 발 스위치를 눌러 전기포공을 시작합니다. 그런 다음 동물을 완전한 회복이 될 때까지 모니터링하여 물로 돌려보내서 후속 동물을 동일한 방식으로 주입하고 전기포전시합니다.단백질 수준에서 녹아웃의 효율을 평가하기 위해, 꼬리의 단면을 얻고 표준 프로토콜에 따라 면역 히스토케미컬 분석을 수행한다. 대안적으로, 전기화 척수를 추출하고 DNA를 얻기 위해 샘플을 lyse. 그런 다음 유전자 질식 PCR을 수행한 다음 Sanger 시퀀싱 또는 차세대 시퀀싱을 수행하여 편집된 유전 적 loci의 비율을 평가합니다.Sox2에 대한 Cas9 가이드 RNA 복합체의 주사 및 전기포기는 척수 신경줄기 세포의 대다수에서 Sox2 면역 반응활성의 대규모 손실로 이어지며, 대조군으로서 티로시나제에 대한 Cas9 가이드 RNA 복합체의 주사 및 전기화를 비교하였다. 척수 조직 단면 샘플에서 Sox2 양성 세포의 정량화는 Cas9 Sox2 가이드 RNA 전기화 녹아웃 동물에서 Sox2 발현 세포의 현저하게 감소 된 수를 밝혀, 이 방법은 척수 신경 줄기 세포에서 효율적이고 높은 관통 유전자 녹아웃으로 이어질 것을 나타내는. Sox2 및 GFP에 대한 두 개의 Cas9 가이드 RNA 복합체의 동시 주사 및 전기 포기 후 유비쿼터스 GFP 발현을 가진 형질성 축소로오스로, 이중 녹아웃 신경 줄기 세포의 높은 비율이 관찰되어 프로토콜이 여러 유전자를 유연하게 노크하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.모세관으로 중앙 운하를 대상으로 하는 연습을 하고 주사가 예상대로 작동하지 않을 때에 대한 문제 해결 단계를 사용하여 수식을 착용하는 것이 도움이됩니다. 이 기술은 연구원이 재생에 특정신경 줄기 세포에 있는 유전자의 기능을 공부하는 것을 허용합니다. 모세관을 조작 할 때주의하고 자신의 손가락을 찌르지 않도록하십시오.

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

연구

유전학

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

CRISPR/Cas9 단백질의 유전자 편집에 대 한 채널 메기, Ictalurus punctatus, 배아로 microinjection

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

CRISPR/Cas9-중재 유전자 녹아웃 셀 분할에 대 한 Integrase 불충분 한 Lentiviral 벡터의 생산을 위한 프로토콜

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

준비 및 Nonhuman 영장류 조 혈 줄기와 조상 세포의 유전자 수정

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

스나이퍼-Cas9를 사용 하 여 대상에서 감독된 진화를 통해 대상에 활동의 손실 없이 CRISPR Cas9의 영향을 최소화 하

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질-튜브 전기포공에 의한 정밀 유전자 편집

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...