Name: direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes
Uploaded: 2019-07-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes at JoVE.com

Vi takker Prof Elly M. Tanaka for hennes kontinuerlige og langsiktige støtte. Dette arbeidet ble støttet av en National Natural Science Foundation i Kina (NSFC) Grant (317716), forskning starter Grants fra Sør-Kina normal University (S82111 og 8S0109), og en Kina postdoktor Science Foundation Grant (2018M633067).

Alle dyreforsøk må utføres i samsvar med lokale og nasjonale forskrifter om dyr eksperimentering og med godkjennelse av relevante institusjonelle gjennomgang bord.
1. klargjøre CAS9-gRNA RNP-miksen
<ol><li>Design og syntetisere gRNAs. Merk: se andre publikasjoner for å designe og syntetisere gRNAs, inkludert en utelukkende om axolotler15,20,21,22.</li>
	<li...

<ol>
	<li>O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+the+ependyma+during+axolotl+spinal+cord+regeneration:+Changes+in+intermediate+filament+and+fibronectin+expression.">Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression.</a> Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+Central+Nervous+System+During+Salamander+Tail+Regeneration+from+the+Implanted+Neurospheres.">Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres.</a> Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).</li><li>Nordlander, R. H., Singer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ependyma+in+regeneration+of+the+spinal+cord+in+the+urodele+amphibian+tail.">The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail.</a> Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-+and+time-directed+electroporation+of+CAS9+protein&#8211;gRNA+complexes+in+vivo+yields+efficient+multigene+knock-out+for+studying+gene+function+in+regeneration.">Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein&#8211;gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration.</a> npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+genomic+deletion+of+Sox2+in+the+axolotl+shows+a+requirement+in+spinal+cord+neural+stem+cell+amplification+during+tail+regeneration.">CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome.">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 373548, (2019).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sal-Site:+Integrating+new+and+existing+ambystomatid+salamander+research+and+informational+resources.">Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources.</a> BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Stewart, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+RNA-seq+Analysis+in+the+Unsequenced+Axolotl:+The+Oncogene+Burst+Highlights+Early+Gene+Expression+in.">Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in.</a> the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+optimization+of+CRISPR&#8211;Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Application and optimization of CRISPR&#8211;Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li><li>Holder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+growth+of+the+motor+system+in+the+axolotl.">Continuous growth of the motor system in the axolotl.</a> Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).</li><li>Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salamander+spinal+cord+regeneration:+The+ultimate+positive+control+in+vertebrate+spinal+cord+regeneration.">Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration.</a> Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).</li><li>Albors, A. R., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Electroporation+of+the+Spinal+Cord+in+Larval+Axolotl.">High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).</li><li>Albors, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Planar+cell+polarity-mediated+induction+of+neural+stem+cell+expansion+during+axolotl+spinal+cord+regeneration.">et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration.</a> eLife. 4, 1-29 (2015).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Graham, D. B., Root, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resources+for+the+design+of+CRISPR+gene+editing+experiments.">Resources for the design of CRISPR gene editing experiments.</a> Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li></ol>

Den beskrevne protokollen gir tid og plass begrenset gen Knock-Out i NSCs i Axolotl ryggmargen. Den gjeldende protokollen tillater spesifikk målretting av NSCs på en definert tid og sted med høy penetrans. Det unngår potensielle uønskede effekter som stammer fra Gen Knock-Out i NSCs i andre regioner som hjernen som oppstår ved bruk av grobunn-LoxP system. Det unngår også utviklingsmessige effekter som stammer fra en vedvarende knock-out, slik at studiet av genet funksjon fokusert på regenerering. I tillegg kan d...

Ryggmargen i de fleste virveldyr er ikke i stand til å regenerere følgende skade, noe som fører til varig uførhet. Flere salamandere, for eksempel Axolotl, er bemerkelsesverdige unntak. Axolotl kan regenerere en strukturelt identisk ryggmarg og fullstendig gjenopprette rygg mARGs funksjonen. Mye av regenererende evne til Axolotl ryggmargen skyldes ependymal celler. Disse cellene linje den sentrale kanalen, og i motsetning til de i pattedyr, Axolotl ependymal celler forbli som nevrale stamceller (NSCs) post-embryoutvikling. Etter ryggmargsskade (f. eks, fra en hale amputasjon), disse NSCs sprer å regrow ependymal røret og differensiere å erstatte tapte neurons1,2,3. Avdekke hvordan Axolotl ryggmargen NSCs forbli pluripotent og bli aktivert etter skade kan gi verdifull informasjon om utvikling av nye terapeutiske strategier for menneskelige pasienter.
På grunn av fremskritt i CRISPR-Cas9 gen Knock-Out teknikken, utføre knock-outs å dechiffrere gen funksjonen har blitt enklere og har vist seg å ha bred anvendelse i ulike arter, inkludert axolotler4,5, 6 andre priser , 7 andre er , 8. den nylige utgivelsen av full Axolotl Genova og transcriptome nå tillater noen genomisk geometriske steder å være målrettet og for bedre vurdere til off-Target effekter9,10,11,12 , 13 på alle , 14. optimaliserte protokoller er utviklet for knock-out og knock-in i axolotler ved hjelp av CRISPR-Cas9-systemet15. Levering av CRISPR-Cas9 maskiner i form av CAS9 protein-gRNA ribonucleoprotein (RNP) har vist å være mer effektiv enn å bruke Cas9 og gRNA-Encoding plasmider4. Dette skyldes sannsynligvis at RNP er mindre i størrelse enn plasmider vektorer, dens evne til å skape DNA pauser umiddelbart, og beskytte gRNA fra RNA degradering. I tillegg bruker RNPs omgår transkripsjon og oversettelse; Dermed unngår den problemer som promoter styrke og optimal Codon bruk når plasmider elementer er avledet fra en annen art.
Tap av funksjon studier er en av de generelle tilnærminger til å undersøke potensielle funksjoner av gener av interesse. For å studere gen funksjon under regenerering, bør en knock-out ideelt utføres like før en skade for å unngå effekter på utvikling. I tillegg bør Knock-Out være begrenset til både NSCs og regionen regenerering. En knock-out av målet genet i alle NSCs (inkludert de i hjernen, som er tilfellet i grobunn-LoxP systemer), kan produsere effekter som ikke er relatert til regenerering som kan forvirre tolkningen av resultatene. Heldigvis, strukturen i Axolotl ryggmargen gir en unik mulighet for tid-og plass-begrenset Knock-Out i NSCs. Mesteparten av ryggmargen NSCs er i kontakt med sentralkanalen og utgjør det store flertallet av cellene i kontakt med sentralkanalen16,17. Derfor, en injeksjon av CAS9-gRNA kompleks i sentralkanalen, etterfulgt av electroporation, tillater levering til ryggmargen NSCs i en ønsket region på et bestemt tidspunkt4,18,19. Denne protokollen demonstrerer hvordan dette er utført, noe som fører til svært gjennomtrengende Knock-Out i den målrettede ryggmargen NSCs. påfølgende analyse blir deretter utført for å studere virkningene på regenerering og NSC oppførsel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1355px;" width="1354">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Agarose</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">A9539</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;Benzocaine</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">E1501-100G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 0.03 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 500 ml of 10&#215; TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter&#8217;s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. &#65279;The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 10 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Borosilicate glass capillaries &#65279;1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D.</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">BF120-94-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;102382</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">CAS9 buffer, 10x</td>
			<td style="width:455px;">Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at &#8722;20 &#176;C for up to 24 months</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;CAS9-NLS protein&#160;&#160;</td>
			<td style="width:455px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:241px;">CP03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Cell culture dishes, 10cm</td>
			<td style="width:455px;">Falcon</td>
			<td style="width:241px;">351029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11254-20</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Electroporator</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">NEPA21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;"></td>
			<td style="width:455px;">BEX</td>
			<td style="width:241px;">Pulse Generator CUY21EDIT II</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Fast Green FCF Solution, 5x</td>
			<td style="width:455px;">Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1&#215; PBS.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Flaming/Brown Micropipette Puller&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:492px;">&#65279;Holtfreter&#8217;s solution 400% (wt/vol)&#160;</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 11.125 g of MgSO4&#183;7H2O, 5.36 g of CaCl2&#183;2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">KCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;104936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;105886</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Microloader pipette tips</td>
			<td style="width:455px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:241px;">5242956003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Narishige</td>
			<td style="width:241px;">MN-153&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">NaCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;106404</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Pneumatic PicoPump</td>
			<td style="width:455px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:241px;">SYS-PV830</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Ring Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11103-09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:455px;">Olympus</td>
			<td style="width:241px;">SZX10&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Tris base</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;T6066</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="112">
			<td height="112" style="height:112px;width:492px;">Tris-buffered saline, 10x</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;CUY650P10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes

Axolotl har den unike evnen til å regenerere ryggmargen fullt ut. Dette skyldes i stor grad de ependymal cellene som er igjen som nevrale stamceller (NSCs) gjennom hele livet, som sprer seg for å reformere ependymal røret og differensiere til tapte neurons etter ryggmargsskade. Tyde hvordan disse NSCs beholder pluripotency etter utvikling og spredning på ryggmargsskade for å reformere den eksakte pre-skade struktur kan gi verdifull innsikt i hvordan pattedyr rygg ledninger kan regenerere så vel som potensielle behandlingstilbud. Utføre genet knock-outs i bestemte delsett av NSCs innenfor en begrenset periode vil tillate studier av molekylære mekanismer bak disse regenererende prosesser, uten å bli forvirret av utviklingen perturbing effekter. Beskrevet her er en metode for å utføre gen Knock-Out i Axolotl ryggmargen NSCs bruker CRISPR-Cas9 systemet. Ved å injisere CAS9-gRNA kompleks i ryggmargen sentrale kanalen etterfulgt av electroporation, er målet gener slått ut i NSCs innen bestemte regioner i ryggmargen på en ønsket timepoint, noe som åpner for molekylær studier av ryggmargen NSCs under Regenerering.

Injeksjon og electroporation av CAS9-gRNA kompleks mot Sox2 inn i Axolotl ryggmargen Central Canal førte til et massivt tap av Sox2 immunoreactivity i et flertall av ryggmargen NSCs, med GRNA mot Tyrosinase (Tyr) som en kontroll (figur 2 A). B3-tubulin (BEISET med TUJ1) er en markør for neurons og ble ikke uttrykt i NSCs, og SOX2-TUJ1-celler rundt sentralkanalen ble ansett å være celler harboring SOX2 slettinger. Kvantifisering viste Sox2 Knock...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes at JoVE.com

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Direkte Gene knock-out av Axolotl spinal Cord nevrale stamceller via electroporation av CAS9 protein-gRNA komplekser

Presentert her er en protokoll for å utføre tid-og plassbegrensede genet Knock-Out i Axolotl spinal snorer ved å injisere CAS9-gRNA kompleks i ryggmargen sentrale kanalen etterfulgt av electroporation.

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Denne protokollen tillater rask og svært gjennomtrengende tid og plassbegrensede genutslag i axolotl ryggmargs nevrale stamceller for studier av molekylære mekanismer for ryggmargsregenerering. Denne teknikken tillater studiet av genfunksjon i nevrale stamceller, dens medisinske regenerering uten å bli forvirret av utviklingseffekter eller effekter fra andre celletyper. Axolotl nevrale stamceller bidrar i stor grad til deres evne til å regenerere ryggmargene.Forstå regenerering mekanismer kan føre til innsikt for å utvikle behandlinger for menneskelig ryggmargsskade. Denne metoden gir innsikt i hvordan axolotl nevrale stamceller montere en regenerativ respons på ryggmargsskade. Riktig posisjonering injeksjon kapillær i ryggmargen sentrale kolonnen kan være utfordrende og praktisere på testdyr hjelper med å mestre teknikken.Visning av administrasjonen kan vise hvordan du utfører injeksjonen og hvordan en vellykket injeksjon ser ut. For å forberede Cas9-veiledningen RNA ribonuclear proteinblanding, bland fem mikrogram Cas9 kjernefysisk lokalisering sekvens protein, fire mikrogram guide RNA, og 0,9 mikroliter av 10X Cas9 buffer. Deretter bringe det totale volumet til 10 mikroliter med kjerner-fritt vann og lagre Cas9 guide RNA ribonuclear protein blanding på minus 80 grader Celsius hvis ikke brukes umiddelbart.For agarose elektroporasjon plate forberedelse, forberede 200 milliliter av 2% agarose i Dulbecco PBS og oppløse blandingen i en mikrobølgeovn. Etter liten kjøling, hell væsken agarose i 10-centimeter Petri retter til en dybde på ca 10 millimeter og la platene størkne ved romtemperatur. Når agarose er fast til berøring, bruk en kirurgisk skalpell til å kutte en spalte i agarose av hver tallerken for å holde halen rett, en brønn for å passe dyrets kropp og to ekstra brønner for å holde elektrodene.Legg deretter platene på is og fyll dem til felgen med iskalde DPBS. For å konfigurere elektroporen setter du poringpulsen til en bipolar puls på 70 volt med en varighet på fem millisekunder, et intervall på 50 millisekunder og ingen spenningsforfall. Sett overføringspulsen til fire bipolare pulser på 40 volt med en varighet på 50 millisekunder, et intervall på 999 millisekunder og en 10% spenningsforfall.Koble deretter elektrodene til elektroporen og juster pinsettene slik at de er syv millimeter fra hverandre før elektrodene senkes ned i et beger av PBS. For å forberede glassmikroinjeksjonskapillærer, utfør en rampetest på en mikropipetteavtrekker i henhold til produsentens instruksjoner for å bestemme varmeverdien. Trekk deretter injeksjonskapillærer med koniske ender med de angitte parametrene.Etter å ha trukket, bruk et stereomikroskop og fine tang for å bryte kapillæren i en vinkel, slik at den har en skråtupp i en posisjon der spissen er tynn nok til å målrette den sentrale kanalen i axolotl ryggraden mens den forblir sterk nok til å pierce huden. Før du laster spissen, tilsett rask grønn FCF-løsning på ribonukleærproteinblandingen med ett til 30-forhold og bruk en gellastende pipettespiss for å laste inn omtrent fem mikroliter av injeksjonsblandingen i kapillæren. Monter deretter kapillæren på den pneumatiske pumpen med skråspissen vendt nedover.Hvis du vil konfigurere den pneumatiske pumpen, setter du lasterommet til 0,5 pund per kvadrattomme, utstøtingen til to pund per kvadrattomme hold, og varigheten til inngjerdet. For å teste kapillær- og pumpeinnstillingene dypper du kapillæren i en dråpe vann og trykker på fotpedalen for å injisere. Injeksjonsblandingen skal komme ut i en langsom, men jevn strøm.For å injisere ribonuclear proteinblandingen, snu axolotlene som skal injiseres opp ned i vannet for å bekrefte sedasjon og bruk ring tang for å overføre ett dyr til en seng av silikon med venstre side av dyret vendt opp og halen peker mot høyre. Plasser injeksjonsstedet midt i synsfeltet til stereomikroskopet og juster mikromanipulatoren slik at kapillæren kommer inn i dyret i en 60-graders vinkel fra høyre side av synsfeltet. Etter å ha identifisert ryggmargen og sentralkanalen, flytt sakte kapillæren mot ryggmargens sentrale kanal til den forsiktig pierces huden og muskelen.Når kapillæren er på plass, trykker du på og holder nede fotpedalen for å injisere blandingen i den sentrale kanalen. Hvis kapillæren er riktig plassert, vil ribonuclearproteinblandingen spre seg langs den sentrale kanalen som en blå linje i begge retninger. Det kan være utfordrende å plassere kapillæren riktig.Hvis blandingen ikke sprer seg riktig, justerer du kapillærposisjonen i små trinn mens du holder fotplaten inne. Fortsett å holde nede fotpedalen til blandingen når terminalens vesikkel på enden av ryggmargen og ventriklene i hjernen. Det kan være nødvendig å justere utstøtingstrykket under injeksjonen.Umiddelbart etter injeksjonen, bruk ring tang for å overføre dyret til den tilberedte agarose elektroporasjonsplaten på is og legg halen inne i spalten slik at den er klemt av agarose. Plasser elektrodene i brønnene på begge sider av halen, og vær forsiktig med at hele dyret og elektrodene er dekket av iskald PBS og trykk på fotbryteren for å starte elektroporasjonen. Deretter returnerer du dyret til vannet med overvåking til full gjenoppretting og injiserer og elektroporate de påfølgende dyrene på samme måte.For å evaluere effektiviteten av knock-out på proteinnivå, få et tverrsnitt av halen og utfør immunohistokjemisk analyse i henhold til standardprotokoller. Alternativt kan du trekke ut den elektroporerte ryggmargen og lyse prøven for å oppnå DNA. Utfør deretter genotyping PCR etterfulgt av Sanger sekvensering eller neste generasjons sekvensering for å vurdere prosentandelen av redigert genetisk loci.Injeksjon og elektroporasjon av Cas9 guide RNA komplekser mot Sox2 inn i axolotl ryggmargen sentralkanalen fører til et massivt tap av Sox2 immunoreaktivitet i de fleste ryggmargen nevrale stamceller sammenlignet injeksjon og elektroporasjon av Cas9 guide RNA komplekser mot tyrosinase som en kontroll. Kvantifisering av Sox2-positive celler i ryggmargsvevsseksjonsprøver avslører et betydelig redusert antall Sox2-uttrykkende celler i Cas9 Sox2-guiden RNA-elektroporasjonsutstårne dyr, noe som indikerer at denne metoden fører til en effektiv og svært gjennomtrengende genutstår i ryggmargens nevrale stamceller. Etter samtidig injeksjon og elektroporasjon av to Cas9-guide RNA-komplekser mot Sox2 og GFP i transgene axolotls med allestedsnærværende GFP-uttrykk, observeres en høy prosentandel av doble knock-out nevrale stamceller, noe som indikerer at protokollen kan brukes til å fleksibelt slå ut flere gener.Det er nyttig å øve på å målrette den sentrale kanalen med en kapillær og å sette på formel med feilsøkingstrinnene for når injeksjonen ikke fungerer som forventet. Denne teknikken gjør det mulig for forskere å studere funksjonene til gener i nevrale stamceller som er spesifikke for regenerering. Vær forsiktig når du manipulerer kapillæren og sørg for ikke å stikke dine egne fingre.

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Utvalgsavhengig og uavhengig generasjon av CRISPR / Cas9-medierte Gene Knockouts i mammale celler

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En Standard metode for å undersøke stedet genetisk virkning som en funksjon av punkt mutasjon reparasjon katalysert av CRISPR/Cas9 og SsODN i menneskeceller

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection CRISPR/Cas9 protein i kanalen Gråsteinbit, Ictalurus punctatus, embryo for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

En protokoll for produksjon av Integrase dårlig Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-mediert Gene Knockout i dele celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Svært effektiv Gene avbrudd i Murine og menneskelig blodkreft stamfar celler av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein merking i menneskelig indusert Pluripotent stilk celler med CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Forberedelse og genet modifikasjon Nonhuman primas blodkreft stilk og Progenitor celler

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Bruke Sniper-Cas9 å minimere Off-målet effekter av CRISPR-Cas9 uten tap av på målet aktivitet Via regissert evolusjon

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediert presis Genredigering av tube electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generering av definerte genomisk modifikasjoner bruke CRISPR-CAS9 i Human Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...