Name: direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes
Uploaded: 2019-07-09T14:00:00
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Agradecemos ao Prof. Elly M. Tanaka pelo seu apoio contínuo e a longo prazo. Este trabalho foi apoiado por uma Fundação Nacional de ciência natural da China (NSFC) Grant (317716), pesquisa de início de subvenções da Universidade do Sul da China normal (S82111 e 8S0109), e uma China pós-doutorado ciência Fundação Grant (2018M633067).

Todos os experimentos com animais devem ser realizados de acordo com as regulamentações locais e nacionais sobre experimentação animal e com a aprovação do quadro de revisão institucional pertinente.
1. preparando a mistura de CAS9-gRNA RNP
<ol><li>Projetar e sintetizar gRNAs. Nota: refira outras publicações para projetar e sintetizar grnas, incluindo um exclusivamente a respeito dos axolotls15,20,<sup class="x...

<ol>
	<li>O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+the+ependyma+during+axolotl+spinal+cord+regeneration:+Changes+in+intermediate+filament+and+fibronectin+expression.">Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression.</a> Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+Central+Nervous+System+During+Salamander+Tail+Regeneration+from+the+Implanted+Neurospheres.">Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres.</a> Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).</li><li>Nordlander, R. H., Singer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ependyma+in+regeneration+of+the+spinal+cord+in+the+urodele+amphibian+tail.">The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail.</a> Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-+and+time-directed+electroporation+of+CAS9+protein&#8211;gRNA+complexes+in+vivo+yields+efficient+multigene+knock-out+for+studying+gene+function+in+regeneration.">Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein&#8211;gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration.</a> npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+genomic+deletion+of+Sox2+in+the+axolotl+shows+a+requirement+in+spinal+cord+neural+stem+cell+amplification+during+tail+regeneration.">CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome.">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 373548, (2019).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sal-Site:+Integrating+new+and+existing+ambystomatid+salamander+research+and+informational+resources.">Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources.</a> BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Stewart, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+RNA-seq+Analysis+in+the+Unsequenced+Axolotl:+The+Oncogene+Burst+Highlights+Early+Gene+Expression+in.">Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in.</a> the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+optimization+of+CRISPR&#8211;Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Application and optimization of CRISPR&#8211;Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li><li>Holder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+growth+of+the+motor+system+in+the+axolotl.">Continuous growth of the motor system in the axolotl.</a> Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).</li><li>Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salamander+spinal+cord+regeneration:+The+ultimate+positive+control+in+vertebrate+spinal+cord+regeneration.">Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration.</a> Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).</li><li>Albors, A. R., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Electroporation+of+the+Spinal+Cord+in+Larval+Axolotl.">High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).</li><li>Albors, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Planar+cell+polarity-mediated+induction+of+neural+stem+cell+expansion+during+axolotl+spinal+cord+regeneration.">et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration.</a> eLife. 4, 1-29 (2015).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Graham, D. B., Root, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resources+for+the+design+of+CRISPR+gene+editing+experiments.">Resources for the design of CRISPR gene editing experiments.</a> Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li></ol>

O protocolo descrito permite que o tempo e o espaço restringidos o gene knock-out nos NSCs na medula espinal do Axolotl. O protocolo atual permite direcionamento específico de NSCs em um tempo definido e local com alta penetrância. Evita potenciais efeitos indesejáveis originários de nocaute genético em NSCs em outras regiões, como o cérebro que ocorrem ao usar o sistema CRE-LoxP. Também evita efeitos de desenvolvimento originados de um knock-out persistente, permitindo o estudo da função gênica focada na reg...

A medula espinal da maioria de vertebrados é incapaz de regenerar depois da lesão, conduzindo à inabilidade permanente. Várias salamandras, como o Axolotl, são exceções notáveis. O Axolotl pode regenerar inteiramente uma medula espinal estruturalmente idêntica e restaurar completamente a função da medula espinal. Grande parte da capacidade regenerativa da medula espinhal Axolotl é devida a células ependímicas. Estas células alinham o canal central, e ao contrário daquelas em mamíferos, as pilhas ependymal de Axolotl permanecem como pilhas de haste neural (NSCs) desenvolvimento borne-Embryonic. Após ferimento da medula espinal (por exemplo, de uma amputação da cauda), estes NSCS proliferar para Regrow o tubo ependymal e para diferenciar-se para substituir os neurônios perdidos1,2,3. Descobrindo como Axolotl medula espinhal NSCs permanecem pluripotentes e tornam-se ativados após a lesão pode fornecer informações valiosas sobre o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para pacientes humanos.
Devido aos avanços na técnica de knock-out do gene crispr-Cas9, a realização de knock-outs para decifrar a função gênica tornou-se mais fácil e demonstrou ter ampla aplicabilidade em várias espécies, incluindo axolotls4,5, 6 anos de , 7 anos de , 8. a liberação recente do genoma completo do Axolotl e do transcriptoma agora permite que qualquer Locus genómico seja direcionado e para melhor avaliar os efeitos fora do alvo9,10,11,12 , 13 anos de , 14. protocolos otimizados foram desenvolvidos para knock-out e knock-in em axolotls usando o sistema Crispr-Cas915. A entrega da maquinaria de crispr-CAS9 a forma do ribonucleoprotein de proteína-grna de CAS9 (RNP) foi mostrada para ser mais eficiente do que usando plasmídeos da codificação de CAS9 e de grna-4. Isto é provável devido ao RNP que é menor no tamanho do que vetores do plasmídeo, sua habilidade de criar rupturas do ADN imediatamente, e protegendo do gRNA da degradação do RNA. Além disso, o uso de RNPs ignora a transcrição e a tradução; assim, evita edições tais como a força do promotor e o uso óptimo do Codon quando os elementos do plasmídeo são derivados de uma espécie diferente.
Os estudos da perda--função são uma das aproximações gerais a investigar funções potenciais dos genes do interesse. A fim estudar a função do gene durante a regeneração, um knock-out deve idealmente ser executado apenas antes de um ferimento para evitar efeitos no desenvolvimento. Além disso, o knock-out deve ser restrito às NSCs e região de regeneração. Um knock-out do gene alvo em todos os NSCs (incluindo aqueles no cérebro, que é o caso em sistemas CRE-LoxP), pode produzir efeitos não relacionados com a regeneração que pode confundir a interpretação dos resultados. Felizmente, a estrutura da medula espinhal Axolotl fornece uma oportunidade única para o tempo e espaço restrito knock-out em NSCs. A maioria das NSCS da medula espinhal estão em contato com o canal central e constituem a grande maioria das células em contato com o canal central16,17. Portanto, uma injeção do complexo CAS9-grna no canal central, seguida de eletroporação, permite a entrega às NSCS da medula espinhal em uma região desejada em um tempo específico4,18,19. Este protocolo demonstra como isto é executado, conduzindo ao knock-out altamente penetrante nos NSCs alvejados da medula espinal. posteriormente, são realizadas análises subsequentes para estudar os efeitos sobre a regeneração e o comportamento do NSC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1355px;" width="1354">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Agarose</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">A9539</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;Benzocaine</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">E1501-100G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 0.03 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 500 ml of 10&#215; TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter&#8217;s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. &#65279;The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 10 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Borosilicate glass capillaries &#65279;1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D.</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">BF120-94-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;102382</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">CAS9 buffer, 10x</td>
			<td style="width:455px;">Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at &#8722;20 &#176;C for up to 24 months</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;CAS9-NLS protein&#160;&#160;</td>
			<td style="width:455px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:241px;">CP03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Cell culture dishes, 10cm</td>
			<td style="width:455px;">Falcon</td>
			<td style="width:241px;">351029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11254-20</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Electroporator</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">NEPA21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;"></td>
			<td style="width:455px;">BEX</td>
			<td style="width:241px;">Pulse Generator CUY21EDIT II</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Fast Green FCF Solution, 5x</td>
			<td style="width:455px;">Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1&#215; PBS.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Flaming/Brown Micropipette Puller&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:492px;">&#65279;Holtfreter&#8217;s solution 400% (wt/vol)&#160;</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 11.125 g of MgSO4&#183;7H2O, 5.36 g of CaCl2&#183;2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">KCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;104936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;105886</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Microloader pipette tips</td>
			<td style="width:455px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:241px;">5242956003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Narishige</td>
			<td style="width:241px;">MN-153&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">NaCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;106404</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Pneumatic PicoPump</td>
			<td style="width:455px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:241px;">SYS-PV830</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Ring Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11103-09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:455px;">Olympus</td>
			<td style="width:241px;">SZX10&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Tris base</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;T6066</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="112">
			<td height="112" style="height:112px;width:492px;">Tris-buffered saline, 10x</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;CUY650P10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
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direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes

O Axolotl tem a habilidade original de regenerar inteiramente sua medula espinal. Isto é pela maior parte devido às pilhas ependymal permanecendo como pilhas de haste neural (NSCS) durante todo a vida, que proliferar para reformar o tubo ependymal e para diferenciar-se em neurônios perdidos após ferimento da medula espinal. Deciphering como estes NSCS mantêm o borne-desenvolvimento do pluripotência e proliferar em cima da lesão da medula espinal para reformar a estrutura exata do pre-ferimento pode fornecer a introspecção valiosa em como os cabos espinais mamíferos podem regenerar assim como opções potenciais do tratamento. Executar knock-outs do gene em subconjuntos específicos de NSCS dentro de um período de tempo restrito permitirá o estudo dos mecanismos moleculars atrás destes processos regenerativa, sem ser confundidos pelo desenvolvimento que perturbam efeitos. Descrito aqui é um método para realizar o knock-out do gene no NSCs da medula espinal de Axolotl usando o sistema de CRISPR-Cas9. Injetando o complexo de CAS9-gRNA no canal central da medula espinal seguido pelo Electroporation, os genes do alvo são nocauteados para fora em NSCs dentro das regiões específicas da medula espinal em um timepoint desejado, permitindo estudos moleculars de NSCs da medula espinal durante Regeneração.

A injeção e o electroporation do complexo de CAS9-gRNA de encontro a Sox2 no canal central da medula espinal do Axolotl conduziram a uma perda maciça de immunoreactivity Sox2 em uma maioria de NSCS da medula espinal, com o grna de encontro ao tyrosinase (Tyr) como um controle (Figura 2 A). B3-tubulin (manchado com TUJ1) é um marcador para neurônios e não foi expressa em NSCS, e SOX2-TUJ1-células que cercam o canal central foram consideradas células abrigando...

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Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Gene direto knock-out de células-tronco neurais da medula espinhal Axolotl via eletroporação de complexos de proteína-gRNA CAS9

É apresentado aqui um protocolo para executar a batida-para fora do gene tempo-e espaço-restrito em cordas espinais do Axolotl injetando o complexo de CAS9-gRNA no canal central da medula espinal seguido pelo Electroporation.

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Este protocolo permite o tempo rápido e altamente penetrante e eliminações genéticas com restrição de espaço em células-tronco neurais da medula espinhal axolotl para estudo dos mecanismos moleculares de regeneração da medula espinhal. Esta técnica permite o estudo da função genética em células-tronco neurais, sua regeneração médica sem ser confundida por efeitos de desenvolvimento ou efeitos de outros tipos celulares. Células-tronco neurais axolotil contribuem em grande parte para sua capacidade de regenerar suas medulas espinhais.Compreender mecanismos de regeneração pode levar a insights para o desenvolvimento de tratamentos para lesão medular humana. Este método fornece uma visão de como as células-tronco neurais axolotl montam uma resposta regenerativa à lesão medular. Posicionar corretamente a injeção capilar na coluna central da medula espinhal pode ser desafiador e praticar em animais de teste ajuda na dominar a técnica.Ver a administração pode mostrar como executar a injeção e como é uma injeção bem sucedida. Para preparar a mistura de proteína ribonuclear RNA guia Cas9, misture cinco microgramas de proteína sequência de localização nuclear Cas9, quatro microgramas de RNA guia e 0,9 microliters de tampão 10X Cas9. Em seguida, leve o volume total para 10 microlitadores com água sem nuclease e armazene a mistura de proteína ribonuclear RNA guia Cas9 a menos 80 graus Celsius se não for usada imediatamente.Para a preparação da placa de eletroporação agarose, prepare 200 mililitros de 2% de agarose no PBS de Dulbecco e dissolva a mistura em um micro-ondas. Após um leve resfriamento, despeje o líquido em placas de Petri de 10 centímetros a uma profundidade de cerca de 10 milímetros e permita que as placas se solidifiquem à temperatura ambiente. Quando a agarose estiver firme ao toque, use um bisturi cirúrgico para cortar uma fenda na agarose de cada prato para segurar a cauda reta, um poço para caber no corpo do animal, e dois poços extras para segurar os eletrodos.Em seguida, coloque as placas no gelo e encha-as na borda com DPBS gelados. Para configurar o eletroporador, coloque o pulso de desarmamento em um pulso bipolar a 70 volts com uma duração de cinco milissegundos, um intervalo de 50 milissegundos e nenhuma decadência de tensão. Defina o pulso de transferência para quatro pulsos bipolares de 40 volts com uma duração de 50 milissegundos, um intervalo de 999 milissegundos e uma decadência de 10%.Em seguida, conecte os eletrodos ao eletroporador e ajuste as pinças de modo que elas estejam a sete milímetros de distância antes de submergir os eletrodos em um béquer de PBS. Para preparar capilares de micro-injeção de vidro, realize um teste de rampa em um puxador de micropipette de acordo com as instruções do fabricante para determinar o valor do calor. Em seguida, puxe capilares de injeção com extremidades afiladas com os parâmetros indicados.Depois de puxar, use um microscópio estéreo e fórceps finos para quebrar o capilar em um ângulo de modo que ele tenha uma ponta inclinada em uma posição onde a ponta é fina o suficiente para atingir o canal central da coluna axolotl enquanto permanece forte o suficiente para perfurar a pele. Antes de carregar a ponta, adicione a solução FCF verde rápida à mistura de proteína ribonuclear em uma proporção de um a 30 e use uma ponta de pipeta de carregamento de gel para carregar cerca de cinco microliters da mistura de injeção no capilar. Em seguida, monte o capilar na bomba pneumática com a ponta inclinada voltada para baixo.Para configurar a bomba pneumática, ajuste o porão para 0,5 libras por polegada quadrada, a ejeção para dois quilos por polegada quadrada e a duração do portão. Para testar as configurações capilares e da bomba, mergulhe o capilar em uma gota de água e pressione o pedal do pé para injetar. A mistura de injeção deve sair em um fluxo lento, mas constante.Para injetar a mistura de proteína ribonuclear, vire os axlotls a serem injetados de cabeça para baixo na água para confirmar a sedação e use fórceps de anel para transferir um animal para um leito de silicone com o lado esquerdo do animal voltado para cima e a cauda apontando para a direita. Posicione o local da injeção no meio do campo de visão do microscópio estéreo e ajuste o micromanipulador para que o capilar entre no animal em um ângulo de 60 graus do lado direito do campo de visão. Depois de identificar a medula espinhal e o canal central, mova lentamente o capilar em direção ao canal central da medula espinhal até perfurar suavemente a pele e o músculo.Quando o capilar estiver em posição, pressione e segure o pedal do pé para injetar a mistura no canal central. Se o capilar tiver sido devidamente colocado, a mistura de proteína ribonuclear se espalhará ao longo do canal central como uma linha azul em ambas as direções. Pode ser desafiador posicionar o capilar corretamente.Se a mistura não se espalhar corretamente, ajuste a posição capilar em pequenos passos, mantendo o footpad pressionado. Continue a segurar o pedal do pé até que a mistura atinja o vesículo terminal no final da medula espinhal e os ventrículos no cérebro. Pode ser necessário ajustar a pressão de ejeção durante a injeção.Imediatamente após a injeção, use fórceps de anel para transferir o animal para a placa de eletroporação preparada no gelo e coloque a cauda dentro da fenda para que seja sanduíche pela agarose. Coloque os eletrodos nos poços de ambos os lados da cauda, tomando cuidado para que todo o animal e eletrodos estejam cobertos por PBS gelado e pressione o interruptor do pé para iniciar a eletroporação. Em seguida, devolva o animal à água com monitoramento até a recuperação completa e injete e eletroporate os animais subsequentes da mesma forma.Para avaliar a eficiência do knock-out no nível da proteína, obtenha uma seção transversal da cauda e realize análises imunohistoquímicas de acordo com os protocolos padrão. Alternativamente, extrair a medula espinhal eletroporada e lise a amostra para obter o DNA. Em seguida, execute o PCR genotipagem seguido de sequenciamento Sanger ou sequenciamento de próxima geração para avaliar a porcentagem de loci genético editado.A injeção e eletroporação dos complexos de RNA guiado Cas9 contra Sox2 no canal central da medula espinhal axolotl leva a uma perda maciça de imunoreatividade Sox2 na maioria das células-tronco neurais da medula espinhal comparou a injeção e eletroporação dos complexos de RNA guia Cas9 contra a tyrosinase como controle. A quantificação de células positivas sox2 em amostras de seção de tecido medular revela um número significativamente reduzido de células expressas sox2 em animais de eletroporação de RNA guiado Cas9 Sox2, indicando que este método leva a um eficiente e altamente penetrante nocaute genético em células-tronco neurais da medula espinhal. Após injeção simultânea e eletroporação de dois complexos de RNA guiado Cas9 contra Sox2 e GFP em axolotls transgênicos com expressão GFP onipresente, observa-se uma alta porcentagem de células-tronco neurais duplas, indicando que o protocolo pode ser usado para derrubar de forma flexível múltiplos genes.É útil praticar o direcionamento do canal central com um capilar e colocar fórmula com os passos de solução de problemas para quando a injeção não funcionar como esperado. Essa técnica permite que os pesquisadores estudem as funções de genes em células-tronco neurais específicas para a regeneração. Tome cuidado ao manipular o capilar e certifique-se de não esfaquear seus próprios dedos.

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Genética

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjeção de proteína CRISPR/Cas9 em bagre do canal, Ictalurus punctatus, embriões para Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Um protocolo para a produção de Lentivirus vetores Integrase deficiente CRISPR/Cas9-mediada Gene nocaute em dividir células

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Preparação e modificação genética de primatas não humanos tronco hematopoiéticas e células progenitoras

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Usando o Sniper-Cas9 para minimizar efeitos fora do alvo de CRISPR-Cas9 sem perda de atividade no alvo através de evolução dirigida

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteína-mediada por Gene preciso de edição por tubo Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Geração de modificações genómicas definidas usando CRISPR-CAS9 em células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...