Name: direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes
Uploaded: 2019-07-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes at JoVE.com

Мы благодарим профессора Элли М. Танаку за ее постоянную и долгосрочную поддержку. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC) Грант (317716), исследования Начиная гранты от южнокитайского университета нормальный (S82111 и 8S0109), и Китай постдокторской науки Фонд Грант (2018M633067).

Все эксперименты на животных должны проводиться в соответствии с местными и национальными правилами по экспериментам на животных и с одобрения соответствующего институционального совета по обзору.
1. Подготовка смеси CAS9-gRNA RNP
<ol><li>Дизайн и синтез гРНК. ПРИМЕЧАНИЕ: Обр?...

<ol>
	<li>O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+the+ependyma+during+axolotl+spinal+cord+regeneration:+Changes+in+intermediate+filament+and+fibronectin+expression.">Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression.</a> Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+Central+Nervous+System+During+Salamander+Tail+Regeneration+from+the+Implanted+Neurospheres.">Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres.</a> Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).</li><li>Nordlander, R. H., Singer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ependyma+in+regeneration+of+the+spinal+cord+in+the+urodele+amphibian+tail.">The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail.</a> Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-+and+time-directed+electroporation+of+CAS9+protein&#8211;gRNA+complexes+in+vivo+yields+efficient+multigene+knock-out+for+studying+gene+function+in+regeneration.">Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein&#8211;gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration.</a> npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+genomic+deletion+of+Sox2+in+the+axolotl+shows+a+requirement+in+spinal+cord+neural+stem+cell+amplification+during+tail+regeneration.">CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome.">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 373548, (2019).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sal-Site:+Integrating+new+and+existing+ambystomatid+salamander+research+and+informational+resources.">Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources.</a> BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Stewart, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+RNA-seq+Analysis+in+the+Unsequenced+Axolotl:+The+Oncogene+Burst+Highlights+Early+Gene+Expression+in.">Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in.</a> the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+optimization+of+CRISPR&#8211;Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Application and optimization of CRISPR&#8211;Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li><li>Holder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+growth+of+the+motor+system+in+the+axolotl.">Continuous growth of the motor system in the axolotl.</a> Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).</li><li>Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salamander+spinal+cord+regeneration:+The+ultimate+positive+control+in+vertebrate+spinal+cord+regeneration.">Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration.</a> Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).</li><li>Albors, A. R., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Electroporation+of+the+Spinal+Cord+in+Larval+Axolotl.">High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).</li><li>Albors, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Planar+cell+polarity-mediated+induction+of+neural+stem+cell+expansion+during+axolotl+spinal+cord+regeneration.">et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration.</a> eLife. 4, 1-29 (2015).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Graham, D. B., Root, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resources+for+the+design+of+CRISPR+gene+editing+experiments.">Resources for the design of CRISPR gene editing experiments.</a> Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li></ol>

Описанный протокол позволяет времени и пространства ограниченного гена нокаут в NSCs в аксолотель спинного мозга. Текущий протокол позволяет конкретно таргетинга НСК в определенное время и место с высоким penetrance. Он позволяет избежать потенциальных нежелательных эффектов, происходящих...

Спинной мозг большинства позвоночных не может регенерировать после травмы, что приводит к постоянной инвалидности. Некоторые саламандры, такие как аксолотль, являются заметными исключениями. Аксолотл может полностью регенерировать структурно идентичный спинной мозг и полностью восстановить функцию спинного мозга. Большая часть регенеративной способности аксолотов огорожения обусловлена эпендимальными клетками. Эти клетки выстраивались в линию центрального канала, и в отличие от клеток млекопитающих, аксолотальные эпендимальные клетки остаются в виде нервных стволовых клеток (НСК) после эмбрионального развития. После травмы спинного мозга (например, от ампутации хвоста), эти NSCs размножаться, чтобы вырастить эпендимальной трубки и дифференцировать, чтобы заменить потерянные нейроны1,2,3. Раскрытие того, как аксолотл спинного мозга NSCs остаются плюрипотентными и активировать после травмы может предоставить ценную информацию о разработке новых терапевтических стратегий для пациентов.
В связи с достижениями в CRISPR-Cas9 ген нокаут техники, выполнение нокаутов, чтобы расшифровать функцию гена стало легче и было показано, что широкое применимость в различных видах, в том числе аксолотлы4,5, 6 , 7 (г. , 8. Недавний выпуск полного генома аксолоцла и транскриптома теперь позволяет любой геномный локус быть мишенью и для лучшей оценки вне целевых эффектов9,10,11,12 , 13 Год , 14. Разработаны оптимизированные протоколы для нокаута и стука в аксолотах с использованием системы CRISPR-Cas915. Доставка оборудования CRISPR-Cas9 в виде циноворенного рибонуклеопротеина CAS9 (РНП) оказалась более эффективной, чем использование плазмид Cas9 и gRNA-encoding4. Это, вероятно, из-за RNP быть меньше по размеру, чем плазмидные векторы, его способность создавать ДНК перерывы немедленно, и защита гРНК от деградации РНК. Кроме того, использование RNPs обходит транскрипцию и перевод; Таким образом, он избегает таких вопросов, как прочность промотора и оптимальное использование кодона, когда плазмидные элементы являются производными от различных видов.
Исследования потери функций являются одним из общих подходов к изучению потенциальных функций генов, представляющих интерес. Для того, чтобы изучить функцию генов во время регенерации, нокаут в идеале должны быть выполнены непосредственно перед травмой, чтобы избежать воздействия на развитие. Кроме того, выбивка должна быть ограничена как НСК, так и областью регенерации. Выбив из целевого гена во всех NSCs (в том числе в головном мозге, что имеет место в системах Cre-LoxP), может производить эффекты, не связанные с регенерацией, которые могут сбить с толку интерпретацию результатов. К счастью, структура аксолотового спинного мозга предоставляет уникальную возможность для времени и ограниченного пространства нокаутом в НСК. Большинство спинного мозга NSCs находятся в контакте с центральным каналом и составляют подавляющее большинство клеток в контакте с центральным каналом16,17. Таким образом, инъекция комплекса CAS9-gRNA в центральный канал, за которым следует электропорация, позволяет доставлять в спинной мозг НСК в нужном регионе в определенное время4,18,19. Этот протокол демонстрирует, как это выполняется, что приводит к весьма проникающим нокаутом в целевом спинном мозге NSCs. Последующий анализ затем проводится для изучения влияния на регенерацию и поведение НСК.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1355px;" width="1354">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Agarose</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">A9539</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;Benzocaine</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">E1501-100G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 0.03 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 500 ml of 10&#215; TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter&#8217;s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. &#65279;The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 10 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Borosilicate glass capillaries &#65279;1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D.</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">BF120-94-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;102382</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">CAS9 buffer, 10x</td>
			<td style="width:455px;">Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at &#8722;20 &#176;C for up to 24 months</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;CAS9-NLS protein&#160;&#160;</td>
			<td style="width:455px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:241px;">CP03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Cell culture dishes, 10cm</td>
			<td style="width:455px;">Falcon</td>
			<td style="width:241px;">351029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11254-20</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Electroporator</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">NEPA21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;"></td>
			<td style="width:455px;">BEX</td>
			<td style="width:241px;">Pulse Generator CUY21EDIT II</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Fast Green FCF Solution, 5x</td>
			<td style="width:455px;">Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1&#215; PBS.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Flaming/Brown Micropipette Puller&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:492px;">&#65279;Holtfreter&#8217;s solution 400% (wt/vol)&#160;</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 11.125 g of MgSO4&#183;7H2O, 5.36 g of CaCl2&#183;2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">KCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;104936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;105886</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Microloader pipette tips</td>
			<td style="width:455px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:241px;">5242956003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Narishige</td>
			<td style="width:241px;">MN-153&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">NaCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;106404</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Pneumatic PicoPump</td>
			<td style="width:455px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:241px;">SYS-PV830</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Ring Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11103-09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:455px;">Olympus</td>
			<td style="width:241px;">SZX10&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Tris base</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;T6066</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="112">
			<td height="112" style="height:112px;width:492px;">Tris-buffered saline, 10x</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;CUY650P10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes

Аксолотль обладает уникальной способностью полностью регенерировать спинной мозг. Это в значительной степени из-за эпендимальных клеток, оставшихся в качестве нервных стволовых клеток (НСК) на протяжении всей жизни, которые распространяются на реформу эпендимальной трубки и дифференцироваться в потерянные нейроны после травмы спинного мозга. Расшифровка, как эти NSCs сохранить плюрипотентность после развития и размножаться на повреждение спинного мозга для реформирования точной структуры до травмы может обеспечить ценную информацию о том, как млекопитающих спинного мозга может регенерировать, а также потенциальные варианты лечения. Выполнение генных нокаутов в конкретных подмножествах НСК в течение ограниченного периода времени позволит изучать молекулярные механизмы, стоящие за этими регенеративными процессами, не будучи сбит с толку эффектами, возмущающимися развитием. Описано здесь метод для выполнения гена нокаут в аксолоттный спинной мозг NSCs с помощью системы CRISPR-Cas9. Путем впрыскивать комплекс CAS9-gRNA в центральный канал спинного мозга последованного за электропорированием, гены цели постучаны вне в NSCs внутри специфически зоны спинного мозга на познаваемое timepoint, позволяющ для молекулярных изучений NSCs спинного мозга во время Регенерации.

Инъекции и электропорации комплекса CAS9-gRNA против Sox2 в аксолоттальный спинной мозг центрального канала привело к массовой потере SOX2 иммунореактивности в большинстве спинного мозга NSCs, с гРНК против тиросинезы (Тир) в качестве контроля (Рисунок 2 A).B3-tubulin (ок?...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes at JoVE.com

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Прямой ген knock-out аксолотла спинного мозга нейронных стволовых клеток через Электропорации CAS9 Белковые-gRNA комплексов

Представлено здесь протокол для выполнения времени и пространства ограниченного гена нокаут в аксолотль спинного мозга путем введения CAS9-gRNA комплекса в спинной мозг центрального канала с последующим электропорированием.

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Этот протокол позволяет быстро и высоко проникающее время и пространство ограниченных генных нокаутов в аксолотл спинного мозга нервных стволовых клеток для изучения молекулярных механизмов регенерации спинного мозга. Этот метод позволяет изучать функцию генов в нервных стволовых клетках, его медицинскую регенерацию, не путаясь с последствиями развития или эффектами других типов клеток. Аксолотл нервных стволовых клеток в значительной степени способствовать их способности регенерировать спинной мозг.Понимание механизмов регенерации может привести к пониманию для разработки методов лечения травм спинного мозга человека. Этот метод дает представление о том, как аксолотл нервных стволовых клеток монтировать регенеративную реакцию на повреждение спинного мозга. Правильное позиционирование инъекций капилляров в центральный столб спинного мозга может быть сложной задачей и практикующих на тест животных помогает с освоением техники.Просмотр администрации может показать, как выполнить инъекцию и как выглядит успешная инъекция. Для подготовки смеси РНК-рибонуклеарной белковой смеси Cas9 смешайте пять микрограммов белка последовательности ядерной локализации Cas9, четыре микрограмма направляющий РНК и 0,9 микролитров буфера 10X Cas9. Затем доведите общий объем до 10 микролитров с безклеазной водой и храните смесь РНК-рибонуклеарного белка Cas9 при температуре минус 80 градусов по Цельсию, если не использовать ее немедленно.Для подготовки электропорации агарозной пластины приготовьте 200 миллилитров 2%агарозы в PBS Дулбекко и растворите смесь в микроволновой печи. После небольшого охлаждения, залить жидкой агарозой в 10-сантиметровые чашки Петри на глубину около 10 миллиметров и позволить пластин затвердеть при комнатной температуре. Когда агароза тверда на ощупь, используйте хирургический скальпель, чтобы вырезать щель в агарозе каждого блюда для проведения хвост прямо, хорошо, чтобы соответствовать телу животного, и два дополнительных колодца для проведения электродов.Затем поместите тарелки на лед и заполните их обода ледяным DPBS. Чтобы настроить электропоратор, установите пульс углубивания в один биполярный импульс на 70 вольт с продолжительностью пять миллисекунд, интервалом в 50 миллисекунд и отсутствием распада напряжения. Установите импульс передачи до четырех биполярных импульсов 40 вольт с продолжительностью 50 миллисекунд, интервалом 999 миллисекунд и 10%-ным распадом напряжения.Затем подключите электроды к электропоратору и отрегулируйте пинцет так, чтобы они были на семь миллиметров друг от друга, прежде чем погрузить электроды в стакан PBS. Для подготовки стеклянных микро-инъекций капилляров, выполнить тест рампы на шкив микропайпта в соответствии с инструкциями производителя, чтобы определить теплосмощь. Затем потяните инъекционные капилляры с конические концы с указанными параметрами.После потянув, использовать стерео микроскоп и тонкие типсы, чтобы сломать капилляр под углом так, что он имеет наклонный кончик в положении, когда кончик достаточно тонкий, чтобы целевой центральный канал аксолотля позвоночника, оставаясь достаточно сильным, чтобы проколоть кожу. Перед загрузкой наконечника добавьте быстрое зеленое решение FCF в рибонуклеарную белковую смесь в соотношении от одного до 30 и используйте наконечник трубочки для загрузки около пяти микролитров смеси инъекций в капилляр. Затем смонтировать капилляр на пневматический насос с наклонным кончиком лицом вниз.Чтобы настроить пневматический насос, установите удержание до 0,5 фунтов на квадратный дюйм, выброс до двух фунтов на квадратный дюйм провести, и продолжительность закрытой. Чтобы проверить настройки капилляров и насосов, окуните капилляр в капилляр в каплю воды и нажмите педаль ноги, чтобы ввести. Смесь инъекций должна выходить в медленном, но устойчивом потоке.Чтобы ввести рибонуклеарную белковую смесь, переверните аксолотлы, которые будут введены вверх дном в воду, чтобы подтвердить осея и использовать forceые кольца для передачи одного животного на кровать из силикона с левой стороны животного вверх и хвост, указывающий на право. Распоистить место инъекции в середине поля зрения стерео микроскопа и настроить микроманипулятор так, чтобы капилляр вошел в животное под углом 60 градусов с правой стороны поля зрения. После выявления спинного мозга и центрального канала, медленно двигаться капилляров к центральному каналу спинного мозга, пока он мягко пронзает кожу и мышцы.Когда капилляр находится в положении, нажмите и удерживайте педаль ноги, чтобы ввести смесь в центральный канал. Если капилляр был правильно помещен, рибонуклеарная белковая смесь будет распространяться вдоль центрального канала в качестве синей линии в обоих направлениях. Это может быть сложной задачей, чтобы распоставить капилляр правильно.Если смесь не распространяется правильно, отрегулируйте положение капилляров небольшими шагами, сохраняя при этом нажатую подножку. Продолжайте удерживать педаль стопы, пока смесь не достигнет терминала пузырьков в конце спинного мозга и желудочков в головном мозге. Возможно, необходимо настроить давление выброса во время инъекции.Сразу же после инъекции используйте кольцевые типсы для переноса животного на подготовленную агарозную электропорацию пластины на льду и поместите хвост внутри щели так, чтобы он был зажат агарозой. Поместите электроды в колодцы по обе стороны хвоста, заботясь о том, чтобы все животное и электроды были покрыты ледяным PBS и нажмите переключатель ноги, чтобы начать электропорацию. Затем вернуть животное в воду с мониторингом до полного восстановления и введения и электропората последующих животных таким же образом.Для оценки эффективности нокаута на уровне белка, получить поперечное сечение хвоста и выполнить иммуногистохимический анализ в соответствии со стандартными протоколами. Кроме того, извлечь электропотерированный спинной мозг и подлизать образец для получения ДНК. Затем выполните генотипирование ПЦР с последующим секвенированием Сэнгера или секвенированием следующего поколения для оценки процента отредактированных генетических локусов.Инъекции и электропорации Cas9 руководство РНК комплексов против Sox2 в аксолотль спинного мозга центрального канала приводит к массовой потере Sox2 иммунореактивности в большинстве нервных стволовых клеток спинного мозга по сравнению с инъекцией и электропорации Cas9 руководство РНК комплексов против тирозиназы в качестве контроля. Количественная оценка Sox2-положительных клеток в образцах секции ткани спинного мозга показывает значительно уменьшенное количество Sox2-экспрессивных клеток в Cas9 Sox2 руководство РНК электропорации нокаутом животных, указывая, что этот метод приводит к эффективной и высоко проникающей гена нокаут в спинном мозге нервных стволовых клеток. После одновременной инъекции и электропорации двух комплексов CAS9 руководство РНК против Sox2 и GFP в трансгенных аксолотлов с вездесущим выражением GFP, высокий процент двойного нокаута нервных стволовых клеток наблюдается, что свидетельствует о том, что протокол может быть использован для гибко выбить несколько генов.Полезно практиковать таргетинг на центральный канал с капилляром и надеть формулу с шагами по устранению неполадок, когда инъекция не работает, как ожидалось. Этот метод позволяет исследователям изучать функции генов в нервных стволовых клетках, которые специфичны для регенерации. Позаботьтесь при манипулировании капилляров и убедитесь, что не ударяет пальцами.

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Отборочное и независимое генерирование CRISPR / Cas9-опосредованных генов-нокаутов в клетках млекопитающих

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Стандартная методология для изучения на месте мутагенность как функция Точечная мутация ремонта, катализируемые ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и SsODN в клетках человека

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Микроинъекции ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белка в канал сома, сомик punctatus, эмбрионы для редактирования гена

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Протокол для производства интеграза недостаточным лентивирусные векторы для ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной нокаут генов в делящихся клетках

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Высокоэффективные гена срыв мышиных и человека гемопоэтических предшественников клеток ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Эндогенного белка, пометки в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием ТРИФОСФАТЫ/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Подготовка и генной модификации нечеловеческих приматов гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

С помощью снайпера Cas9 для сведения к минимуму последствий пробить ТРИФОСФАТЫ Cas9 без потери на цель деятельности через направленной эволюции

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Рибонуклеопротеин-опосредовано Точное редактирование генов трубэлектрогенерации

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Поколение определенных геномных модификаций с использованием CRISPR-CAS9 в стволовых клетках человека

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...