Name: direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes
Uploaded: 2019-07-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes at JoVE.com

Agradecemos a la Profesora Elly M. Tanaka por su apoyo continuo y a largo plazo. Este trabajo fue apoyado por una Beca de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC) (317716), Becas de Inicio de Investigación de la Universidad Normal del Sur de China (S82111 y 8S0109), y una Beca de la Fundación de Ciencia postdoctoral de China (2018M633067).

Todos los experimentos con animales deben llevarse a cabo de conformidad con las reglamentaciones locales y nacionales sobre experimentación con animales y con la aprobación de la junta de revisión institucional pertinente.
1. Preparación de la mezcla CAS9-gRNA RNP
<ol><li>Diseñar y sintetizar gRNAs. NOTA: Consulte otras publicaciones para diseñar y sintetizar ARNm, incluida una exclusivamente relativa a axolotls15,20,<...

<ol>
	<li>O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+the+ependyma+during+axolotl+spinal+cord+regeneration:+Changes+in+intermediate+filament+and+fibronectin+expression.">Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression.</a> Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+Central+Nervous+System+During+Salamander+Tail+Regeneration+from+the+Implanted+Neurospheres.">Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres.</a> Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).</li><li>Nordlander, R. H., Singer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ependyma+in+regeneration+of+the+spinal+cord+in+the+urodele+amphibian+tail.">The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail.</a> Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-+and+time-directed+electroporation+of+CAS9+protein&#8211;gRNA+complexes+in+vivo+yields+efficient+multigene+knock-out+for+studying+gene+function+in+regeneration.">Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein&#8211;gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration.</a> npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+genomic+deletion+of+Sox2+in+the+axolotl+shows+a+requirement+in+spinal+cord+neural+stem+cell+amplification+during+tail+regeneration.">CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome.">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 373548, (2019).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sal-Site:+Integrating+new+and+existing+ambystomatid+salamander+research+and+informational+resources.">Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources.</a> BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Stewart, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+RNA-seq+Analysis+in+the+Unsequenced+Axolotl:+The+Oncogene+Burst+Highlights+Early+Gene+Expression+in.">Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in.</a> the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+optimization+of+CRISPR&#8211;Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Application and optimization of CRISPR&#8211;Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li><li>Holder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+growth+of+the+motor+system+in+the+axolotl.">Continuous growth of the motor system in the axolotl.</a> Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).</li><li>Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salamander+spinal+cord+regeneration:+The+ultimate+positive+control+in+vertebrate+spinal+cord+regeneration.">Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration.</a> Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).</li><li>Albors, A. R., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Electroporation+of+the+Spinal+Cord+in+Larval+Axolotl.">High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).</li><li>Albors, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Planar+cell+polarity-mediated+induction+of+neural+stem+cell+expansion+during+axolotl+spinal+cord+regeneration.">et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration.</a> eLife. 4, 1-29 (2015).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Graham, D. B., Root, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resources+for+the+design+of+CRISPR+gene+editing+experiments.">Resources for the design of CRISPR gene editing experiments.</a> Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li></ol>

El protocolo descrito permite el desoparamiento de genes restringidos en el tiempo y el espacio en los SCN en la médula espinal del axolotl. El protocolo actual permite la segmentación específica de los SCN en un momento y una ubicación definidos con alta penetrancia. Evita posibles efectos no deseados que se originan en el knock-out de genes en los SCN en otras regiones como el cerebro que se producen cuando se utiliza el sistema Cre-LoxP. También evita los efectos del desarrollo que se originan en un knock-out per...

La médula espinal de la mayoría de los vertebrados es incapaz de regenerarse después de una lesión, lo que conduce a una discapacidad permanente. Varias salamandras, como el axolotl, son notables excepciones. El axolotl puede regenerar completamente una médula espinal estructuralmente idéntica y restaurar completamente la función de la médula espinal. Gran parte de la capacidad regenerativa de la médula espinal axololol se debe a las células ependímicas. Estas células recubren el canal central, y a diferencia de las de los mamíferos, las células axolomales ependílicos permanecen como células madre neurales (NSC) de desarrollo postembrionario. Después de una lesión de la médula espinal (por ejemplo, a partir de una amputación de cola), estos SCN proliferan para regenerar el tubo ependimal y diferenciarse para reemplazar las neuronas perdidas1,2,3. Descubrir cómo los NSC de la médula espinal axolotl siguen siendo pluripotentes y se activan después de la lesión puede proporcionar información valiosa sobre el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para pacientes humanos.
Debido a los avances en la técnica de eliminación del gen CRISPR-Cas9, la realización de noqueos para descifrar la función génica se ha vuelto más fácil y se ha demostrado que tiene una amplia aplicabilidad en varias especies, incluyendo axolotls4,5, 6 , 7 , 8. La reciente publicación del genoma y transcriptoma completos del axolotl ahora permite atacar cualquier locus genómico y evaluar mejor los efectos fuera del objetivo9,10,11,12 , 13 , 14. Se han desarrollado protocolos optimizados para knock-out y knock-in en axolotls utilizando el sistema CRISPR-Cas915. Se ha demostrado que la entrega de la maquinaria CRISPR-Cas9 en forma de ribonucleoproteína CAS9 proteína-gRNA (RNP) es más eficiente que el uso de Plásmidos con codificación Cas9 y gRNA4. Esto es probablemente debido a que el RNP es más pequeño en tamaño que los vectores plásmidos, su capacidad para crear rupturas de ADN inmediatamente, y la protección del ARNR de la degradación del ARN. Además, el uso de RNPs evita la transcripción y la traducción; por lo tanto, evita cuestiones como la fuerza promotora y el uso óptimo de codón cuando los elementos plásmidos se derivan de una especie diferente.
Los estudios de pérdida de funciones son uno de los enfoques generales para investigar las posibles funciones de los genes de interés. Con el fin de estudiar la función génica durante la regeneración, un knock-out debe realizarse idealmente justo antes de una lesión para evitar efectos en el desarrollo. Además, el knock-out debe limitarse tanto a los NSC como a la región de regeneración. Un nocaut del gen objetivo en todos los SCN (incluidos los del cerebro, que es el caso en los sistemas Cre-LoxP), puede producir efectos no relacionados con la regeneración que pueden confundir la interpretación de los resultados. Afortunadamente, la estructura de la médula espinal axolotl proporciona una oportunidad única para el desaqueo con tiempo y espacio restringido en los NSC. La mayoría de los NSC de la médula espinal están en contacto con el canal central y constituyen la gran mayoría de las células en contacto con el canal central16,17. Por lo tanto, una inyección del complejo CAS9-gRNA en el canal central, seguida de electroporación, permite la administración a los NSC de la médula espinal en una región deseada en un momento específico4,18,19. Este protocolo demuestra cómo se lleva a cabo esto, lo que conduce a un nocaut altamente penetrante en los NSC de la médula espinal objetivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1355px;" width="1354">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Agarose</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">A9539</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;Benzocaine</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">E1501-100G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 0.03 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 500 ml of 10&#215; TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter&#8217;s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. &#65279;The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 10 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Borosilicate glass capillaries &#65279;1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D.</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">BF120-94-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;102382</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">CAS9 buffer, 10x</td>
			<td style="width:455px;">Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at &#8722;20 &#176;C for up to 24 months</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;CAS9-NLS protein&#160;&#160;</td>
			<td style="width:455px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:241px;">CP03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Cell culture dishes, 10cm</td>
			<td style="width:455px;">Falcon</td>
			<td style="width:241px;">351029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11254-20</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Electroporator</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">NEPA21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;"></td>
			<td style="width:455px;">BEX</td>
			<td style="width:241px;">Pulse Generator CUY21EDIT II</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Fast Green FCF Solution, 5x</td>
			<td style="width:455px;">Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1&#215; PBS.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Flaming/Brown Micropipette Puller&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:492px;">&#65279;Holtfreter&#8217;s solution 400% (wt/vol)&#160;</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 11.125 g of MgSO4&#183;7H2O, 5.36 g of CaCl2&#183;2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">KCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;104936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;105886</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Microloader pipette tips</td>
			<td style="width:455px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:241px;">5242956003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Narishige</td>
			<td style="width:241px;">MN-153&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">NaCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;106404</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Pneumatic PicoPump</td>
			<td style="width:455px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:241px;">SYS-PV830</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Ring Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11103-09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:455px;">Olympus</td>
			<td style="width:241px;">SZX10&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Tris base</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;T6066</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="112">
			<td height="112" style="height:112px;width:492px;">Tris-buffered saline, 10x</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;CUY650P10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes

El axolotl tiene la capacidad única de regenerar completamente su médula espinal. Esto se debe en gran parte a las células ependimales que permanecen como células madre neurales (NSC) a lo largo de la vida, que proliferan para reformar el tubo ependimal y diferenciarse en neuronas perdidas después de una lesión de la médula espinal. Descifrar cómo estos NSC retienen la pluripotencia después del desarrollo y proliferan sobre la lesión de la médula espinal para reformar la estructura exacta antes de la lesión puede proporcionar información valiosa sobre cómo las médulas espinales de los mamíferos pueden regenerarse, así como posibles opciones de tratamiento. La realización de de knock-outs genéticos en subconjuntos específicos de NSC dentro de un período de tiempo restringido permitirá el estudio de los mecanismos moleculares detrás de estos procesos regenerativos, sin ser confundido por efectos perturbadores de desarrollo. Aquí se describe un método para realizar el knock-out genético en los NSC de la médula espinal axolotl utilizando el sistema CRISPR-Cas9. Al inyectar el complejo CAS9-gRNA en el canal central de la médula espinal seguido de electroporación, los genes diana se eliminan en los NSC dentro de regiones específicas de la médula espinal en el momento deseado, lo que permite estudios moleculares de los SEN de la médula espinal durante Regeneración.

La inyección y electroporación del complejo CAS9-gRNA contra Sox2 en el canal central de la médula espinal axolol condujo a una pérdida masiva de inmunoreactividad SOX2 en la mayoría de los NSC de la médula espinal, con EL RNA contra la tirosinasa (Tyr) como control (Figura 2 A). B3-tubulina (manchado con TUJ1) es un marcador para las neuronas y no se expresó en NSCs, y las células SOX2- TUJ1- que rodeaban el canal central se consideraron células que alberg...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes at JoVE.com

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Desmontaje genético directo de las células madre neurales de la médula espinal de Axolotl a través de la electroporación de los complejos de proteína-gRNA CAS9

Aquí se presenta un protocolo para realizar el desomo genético con tiempo y espacio restringido en las médulas espinales de axolotl inyectando el complejo CAS9-gRNA en el canal central de la médula espinal seguido de electroporación.

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Este protocolo permite eliminaciones genéticas rápidas y de alta penetración en células madre neuronales de la médula espinal axolotl para el estudio de los mecanismos moleculares de la regeneración de la médula espinal. Esta técnica permite el estudio de la función génica en las células madre neurales, su regeneración médica sin ser confundido por efectos del desarrollo o efectos de otros tipos de células. Las células madre neurales de Axolotl contribuyen en gran medida a su capacidad para regenerar sus médulas espinales.Comprender los mecanismos de regeneración podría conducir a información para el desarrollo de tratamientos para lesiones de la médula espinal humana. Este método proporciona información sobre cómo las células madre neurales del axolotl montan una respuesta regenerativa a la lesión de la médula espinal. Colocar correctamente el capilar de inyección en la columna central de la médula espinal puede ser un reto y practicar en animales de prueba ayuda con el dominio de la técnica.Ver la administración puede mostrar cómo realizar la inyección y cómo se ve una inyección exitosa. Para preparar la mezcla de proteína ribonuclear de ARN guía Cas9, mezcle cinco microgramos de proteína de secuencia de localización nuclear Cas9, cuatro microgramos de ARN guía y 0,9 microlitros de tampón 10X Cas9. A continuación, lleve el volumen total a 10 microlitros con agua libre de nucleasas y almacene la mezcla de proteína ribonuclear de ARN guía Cas9 a menos 80 grados centígrados si no se utiliza inmediatamente.Para la preparación de la placa de electroporación de agarosa, preparar 200 mililitros de 2% de agarosa en PBS de Dulbecco y disolver la mezcla en un microondas. Después de un ligero enfriamiento, verter la agarosa líquida en platos Petri de 10 centímetros a una profundidad de unos 10 milímetros y permitir que las placas se solidificen a temperatura ambiente. Cuando la agarosa es firme al tacto, utilice un bisturí quirúrgico para cortar una hendidura en la agarosa de cada plato para sostener la cola recta, un pozo para adaptarse al cuerpo del animal, y dos pozos adicionales para sostener los electrodos.A continuación, coloque las placas sobre hielo y llénalas hasta el borde con DPBS heladas. Para configurar el electroporador, ajuste el pulso de porción a un pulso bipolar a 70 voltios con una duración de cinco milisegundos, un intervalo de 50 milisegundos y sin decaimiento de voltaje. Establezca el pulso de transferencia en cuatro pulsos bipolares de 40 voltios con una duración de 50 milisegundos, un intervalo de 999 milisegundos y una decaimiento de 10% de voltaje.A continuación, conecte los electrodos al electroporador y ajuste las pinzas para que estén separadas a siete milímetros antes de sumergir los electrodos en un vaso de precipitados de PBS. Para preparar los capilares de microinyección de vidrio, realice una prueba de rampa en un tirador de micropipeta según las instrucciones del fabricante para determinar el valor de calor. A continuación, tire de los capilares de inyección con extremos cónicos con los parámetros indicados.Después de tirar, utilice un microscopio estéreo y fórceps finos para romper el capilar en un ángulo de modo que tenga una punta inclinada en una posición donde la punta es lo suficientemente delgada como para apuntar al canal central de la columna vertebral de axolotl mientras permanece lo suficientemente fuerte como para perforar la piel. Antes de cargar la punta, agregue una solución FCF verde rápida a la mezcla de proteína ribonuclear en una proporción de uno a 30 y utilice una punta de pipeta de carga en gel para cargar unos cinco microlitros de la mezcla de inyección en el capilar. A continuación, monte el capilar en la bomba neumática con la punta inclinada hacia abajo.Para configurar la bomba neumática, ajuste la retención a 0,5 libras por pulgada cuadrada, la expulsión a dos libras por pulgada cuadrada de retención, y la duración a cerrada. Para probar los ajustes capilares y de la bomba, sumerja el capilar en una gota de agua y presione el pedal para inyectar. La mezcla de inyección debe salir en un flujo lento pero constante.Para inyectar la mezcla de proteína ribonuclear, voltee los axolotls que se van a inyectar boca abajo en el agua para confirmar la sedación y utilice fórceps de anillo para transferir un animal a un lecho de silicona con el lado izquierdo del animal mirando hacia arriba y la cola apuntando hacia la derecha. Coloque el lugar de inyección en el centro del campo de visión del microscopio estéreo y ajuste el micromaniprógrafo para que el capilar entre en el animal en un ángulo de 60 grados desde el lado derecho del campo de visión. Después de identificar la médula espinal y el canal central, mueva lentamente el capilar hacia el canal central de la médula espinal hasta que perfore suavemente la piel y el músculo.Cuando el capilar esté en posición, mantenga presionado el pedal para inyectar la mezcla en el canal central. Si el capilar se ha colocado correctamente, la mezcla de proteína ribonuclear se extenderá a lo largo del canal central como una línea azul en ambas direcciones. Puede ser difícil posicionar el capilar correctamente.Si la mezcla no se extiende correctamente, ajuste la posición capilar en pequeños pasos mientras mantiene presionada la almohadilla. Continúe presionando el pedal hasta que la mezcla llegue a la vesícula terminal al final de la médula espinal y los ventrículos en el cerebro. Es posible que sea necesario ajustar la presión de eyección durante la inyección.Inmediatamente después de la inyección, utilice fórceps de anillo para transferir al animal a la placa de electroporación de agarosa preparada sobre hielo y coloque la cola dentro de la hendidura de modo que sea empareda por la agarosa. Coloque los electrodos en los pozos a ambos lados de la cola, teniendo cuidado de que todo el animal y los electrodos estén cubiertos por PBS helado y presione el interruptor del pie para iniciar la electroporación. A continuación, devolver el animal al agua con monitoreo hasta la recuperación completa e inyectar y electroporar a los animales subsiguientes de la misma manera.Para evaluar la eficiencia del knock-out a nivel proteico, obtenga una sección transversal de la cola y realice análisis inmunohistoquímicos de acuerdo con los protocolos estándar. Alternativamente, extraiga la médula espinal electroporada y anlice la muestra para obtener el ADN. A continuación, realice la PCR de genotipado seguida de la secuenciación de Sanger o la secuenciación de próxima generación para evaluar el porcentaje de loci genéticos editados.La inyección y electroporación de los complejos de ARN guía Cas9 contra Sox2 en el canal central de la médula espinal aolotl conduce a una pérdida masiva de inmunoreactividad Sox2 en la mayoría de las células madre neurales de la médula espinal en comparación con la inyección y electroporación de los complejos de ARN guía Cas9 contra la tirosinasa como control. La cuantificación de las células positivas de Sox2 en las muestras de sección del tejido de la médula espinal revela un número significativamente reducido de células que expresan los Sox2 en los animales de electroporación de ARN guía Cas9 Sox2, lo que indica que este método conduce a un noqueo genético eficiente y altamente penetrante en las células madre neurales de la médula espinal. Después de la inyección simultánea y la electroporación de dos complejos de ARN guía Cas9 contra Sox2 y GFP en axolotls transgénicos con expresión omnipresente de GFP, se observa un alto porcentaje de células madre neurales de doble nocaut, lo que indica que el protocolo se puede utilizar para eliminar de forma flexible múltiples genes.Es útil practicar la orientación del canal central con un capilar y ponerse la fórmula con los pasos de solución de problemas para cuando la inyección no funciona como se esperaba. Esta técnica permite a los investigadores estudiar las funciones de los genes en las células madre neurales que son específicas de la regeneración. Tenga cuidado al manipular el capilar y asegúrese de no apuñalar sus propios dedos.

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Generación dependiente de la selección y independiente de CRISPR / Cas9-mediada Gene Knockouts en células de mamíferos

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Investigación

Genética

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Una metodología estándar para examinar in situ mutagenicidad en función de la mutación de punto reparación catalizada por CRISPR/Cas9 y SsODN en células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Un protocolo para la producción de vectores lentivirales integrasa deficientes para CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout en dividir las células

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteína endógena Tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Preparación y modificación genética de primates no humanos tallo hematopoyéticas y células progenitoras

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Uso de francotirador Cas9 para minimizar efectos Off-target de CRISPR Cas9 sin la pérdida de actividad en blanco mediante evolución dirigida

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Edición génica precisa mediada por Ribonucleoproteína por electroporación de tubo

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generación de modificaciones genómicas definidas utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...