Name: direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes
Uploaded: 2019-07-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes at JoVE.com

Prof. Elly M. Tanaka 'ya sürekli ve uzun vadeli destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma Çin 'in Ulusal Doğal Bilim Vakfı (NSFC) Grant (317716), Güney Çin normal Üniversitesi (S82111 ve 8S0109) ve bir Çin doktora sonrası Bilim Vakfı Grant (2018M633067) itibaren araştırma başlangıç hibe tarafından desteklenmektedir.

Tüm hayvan deneyleri, Hayvan deneylerinde yerel ve ulusal düzenlemelere uygun olarak ve ilgili kurumsal İnceleme Kurulu onayı ile yapılmalıdır.
1. CAS9-gRNA RNP karışımı hazırlama
<ol><li>GRNAs 'ı tasarlama ve sentezlemek. Not: sadece semenderlerin15,20,21,22ile ilgili biri dahil olmak üzere grnas tasarlama ve synthesizer için diğer yayınlara ba...

<ol>
	<li>O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+the+ependyma+during+axolotl+spinal+cord+regeneration:+Changes+in+intermediate+filament+and+fibronectin+expression.">Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression.</a> Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+Central+Nervous+System+During+Salamander+Tail+Regeneration+from+the+Implanted+Neurospheres.">Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres.</a> Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).</li><li>Nordlander, R. H., Singer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ependyma+in+regeneration+of+the+spinal+cord+in+the+urodele+amphibian+tail.">The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail.</a> Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-+and+time-directed+electroporation+of+CAS9+protein&#8211;gRNA+complexes+in+vivo+yields+efficient+multigene+knock-out+for+studying+gene+function+in+regeneration.">Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein&#8211;gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration.</a> npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+genomic+deletion+of+Sox2+in+the+axolotl+shows+a+requirement+in+spinal+cord+neural+stem+cell+amplification+during+tail+regeneration.">CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome.">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 373548, (2019).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sal-Site:+Integrating+new+and+existing+ambystomatid+salamander+research+and+informational+resources.">Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources.</a> BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Stewart, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+RNA-seq+Analysis+in+the+Unsequenced+Axolotl:+The+Oncogene+Burst+Highlights+Early+Gene+Expression+in.">Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in.</a> the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+optimization+of+CRISPR&#8211;Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Application and optimization of CRISPR&#8211;Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li><li>Holder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+growth+of+the+motor+system+in+the+axolotl.">Continuous growth of the motor system in the axolotl.</a> Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).</li><li>Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salamander+spinal+cord+regeneration:+The+ultimate+positive+control+in+vertebrate+spinal+cord+regeneration.">Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration.</a> Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).</li><li>Albors, A. R., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Electroporation+of+the+Spinal+Cord+in+Larval+Axolotl.">High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).</li><li>Albors, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Planar+cell+polarity-mediated+induction+of+neural+stem+cell+expansion+during+axolotl+spinal+cord+regeneration.">et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration.</a> eLife. 4, 1-29 (2015).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Graham, D. B., Root, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resources+for+the+design+of+CRISPR+gene+editing+experiments.">Resources for the design of CRISPR gene editing experiments.</a> Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li></ol>

Açıklanan protokol, Axolotl omuriliğinde NSCs 'de zaman ve uzaya kısıtlı gen çarpmasına olanak sağlar. Geçerli protokol, NSCs 'nin belirli bir zaman ve konumda yüksek penetrance ile belirli hedeflemesini sağlar. CRE-LoxP sistemini kullanırken ortaya çıkan beyin gibi diğer bölgelerde NSCs 'deki gen knock-out ' d a n kaynaklanan potansiyel istenmeyen efektleri önler. Aynı zamanda kalıcı bir knock-out kaynaklanan gelişimsel etkileri önler, gen fonksiyonu rejenerasyon odaklı çalışma izin. Buna ek o...

Çoğu omurgasının omuriliği, kalıcı sakatlığa yol açan yaralanma sonrasında yeniden üretilemiyor. Axolotl gibi birçok Salamanders önemli istisnalar içindedir. Axolotl tamamen yapısal olarak özdeş bir omurilik yeniden üretebilir ve tamamen omurilik fonksiyonunu geri. Axolotl omurilik rejeneratif kapasitinin çoğunu ependim hücrelerden kaynaklanmaktadır. Bu hücreler merkezi kanalı hizalar ve memelilerin aksine, Axolotl ependim hücreler nöral kök hücreler (nscs) sonrası embriyonik gelişim olarak kalır. Omurilik yaralanması (örneğin, bir kuyruk amputasyonu) sonra, bu nscs ependim tüp regrow çoğalırlar ve kayıp nöronların yerine ayırt1,2,3. Axolotl omurilik NSCs 'lerin pluripotent olarak kaldığı ve yaralanma sonrasında aktif hale getirilmesinde, insan hastaları için yeni terapötik stratejiler geliştirme konusunda değerli bilgiler temin edilebilir.
Crispr-Cas9 gen knock-out tekniğinde yapılan ilerlemeler nedeniyle, deşifre gen fonksiyonunun çökmesini gerçekleştirmek daha kolay hale gelmiştir ve semenderlerin4,5 de dahil olmak üzere çeşitli türlerin geniş uygulanabilirliğini göstermiştir. 6 , 7 , 8. tam Axolotl genom ve transkriptom son sürümü şimdi herhangi bir genomik Locus hedeflenmesini sağlar ve off-hedef etkileri için daha iyi değerlendirmek için9,10,11,12 , 13 ' ü , 14. Crispr-Cas9 sistemi15kullanarak aksiyolotlar içinde knock-out ve knock-in için iyileştirilmiş protokoller geliştirilmiştir. Cas9 protein-Grna ribonukleoprotein (RNP) şeklinde Crispr-Cas9 makinenin teslimi, Cas9 ve Grna-kodlama plazmids4kullanarak daha verimli olduğu gösterilmiştir. Bu büyük olasılıkla RNP Plasmid vektörler daha küçük olması nedeniyle, onun yeteneği hemen DNA tatili oluşturmak ve RNA bozulması gRNA koruma. Buna ek olarak, RNPs kullanarak transkripsiyon ve çeviri atlar; Böylece, Plasmid elemanları farklı bir türden türetildiği zaman Organizatör gücü ve optimum kodon kullanımı gibi sorunları önler.
Fonksiyon kaybı çalışmaları, ilgi genlerinin potansiyel işlevlerini araştırmak için genel yaklaşımlardan biridir. Rejenerasyon sırasında gen fonksiyonunu incelemek için, bir vuruş ideal gelişim üzerindeki etkileri önlemek için bir yaralanma hemen önce yapılmalıdır. Ayrıca, knock-out hem NSCs hem de rejenerasyon bölgesi ile sınırlandırılmalıdır. Tüm NSCs 'deki hedef geni (CRE-LoxP sistemlerinde bulunan beyinde de dahil olmak üzere) bir vuruş, sonuçların yorumlanmasında bulunabilen rejenerasyona bağlı olmayan efektler üretebilir. Neyse ki, Axolotl omuriliğin yapısı NSCs 'de zaman ve boşluk kısıtlanması için benzersiz bir fırsat sağlar. Omurilik nscs çoğu merkezi kanal ile temas halinde ve merkezi kanal ile temas hücrelerin büyük çoğunluğu teşkil16,17. Bu nedenle, CAS9-Grna kompleksinin merkezi kanala enjekte edilmesi, ardından Elektroporasyon, belirli bir zamanda istenilen bölgede omurilik nscs 'ye teslim edilmesini sağlar4,18,19. Bu protokol, bunun nasıl gerçekleştirileceğini, hedeflenen omurilik NSCs 'de son derece penetran bir vuruş yapmaya neden olduğunu gösterir. daha sonra rejenerasyon ve NSC davranışı üzerindeki etkileri incelemek için sonraki analiz gerçekleştirilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1355px;" width="1354">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Agarose</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">A9539</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;Benzocaine</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">E1501-100G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 0.03 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 500 ml of 10&#215; TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter&#8217;s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. &#65279;The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">&#65279;Benzocaine 10 % (wt/vol)</td>
			<td style="width:455px;">Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Borosilicate glass capillaries &#65279;1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D.</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">BF120-94-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;102382</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:492px;">CAS9 buffer, 10x</td>
			<td style="width:455px;">Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at &#8722;20 &#176;C for up to 24 months</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">&#65279;CAS9-NLS protein&#160;&#160;</td>
			<td style="width:455px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:241px;">CP03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Cell culture dishes, 10cm</td>
			<td style="width:455px;">Falcon</td>
			<td style="width:241px;">351029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11254-20</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Electroporator</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">NEPA21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;"></td>
			<td style="width:455px;">BEX</td>
			<td style="width:241px;">Pulse Generator CUY21EDIT II</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Fast Green FCF Solution, 5x</td>
			<td style="width:455px;">Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1&#215; PBS.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Flaming/Brown Micropipette Puller&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Stutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:241px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:492px;">&#65279;Holtfreter&#8217;s solution 400% (wt/vol)&#160;</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 11.125 g of MgSO4&#183;7H2O, 5.36 g of CaCl2&#183;2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">KCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;104936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:492px;">MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;105886</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Microloader pipette tips</td>
			<td style="width:455px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:241px;">5242956003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:455px;">Narishige</td>
			<td style="width:241px;">MN-153&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">NaCl</td>
			<td style="width:455px;">Merck</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;106404</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Pneumatic PicoPump</td>
			<td style="width:455px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:241px;">SYS-PV830</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Ring Forceps</td>
			<td style="width:455px;">Fine Scientific Instruments</td>
			<td style="width:241px;">11103-09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:455px;">Olympus</td>
			<td style="width:241px;">SZX10&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:492px;">Tris base</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;T6066</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="112">
			<td height="112" style="height:112px;width:492px;">Tris-buffered saline, 10x</td>
			<td style="width:455px;">&#65279;Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.</td>
			<td style="width:241px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:492px;">Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter</td>
			<td style="width:455px;">Nepa Gene&#160;</td>
			<td style="width:241px;">&#65279;CUY650P10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct gene knock-out of axolotl spinal cord neural stem cells via electroporation of cas9 protein-grna complexes

Axolotl, omuriliği tamamen yeniden üretebilmek için eşsiz bir yetenektir. Bu büyük ölçüde, ependim tüp reform ve spinal kord yaralanmasından sonra kayıp nöronlar ayırt çoğalırlar yaşam boyunca nöral kök hücreleri (nscs) olarak kalan ependim hücreler kaynaklanmaktadır. Bu nscs 'nin pluripotkans sonrası gelişimini nasıl koruyacağı ve spinal kord yaralanması üzerine çoğalırlar tam ön yaralanma yapısının yeniden çözülmesi, memelinin spinal tellerinin nasıl rejenere olduğu ve potansiyel tedavi seçeneklerinin nasıl ortaya çıktığı konusunda değerli bilgiler sunabilir. Kısıtlı bir süre içinde nscs 'nin belirli alt kümelerinde gen çarpması gerçekleştirme, kalkınma müdahaleci etkileri ile şaşırtmadan bu rejeneratif süreçlerin arkasındaki moleküler mekanizmaların incelenmesi sağlayacaktır. Burada açıklanan, CRISPR-Cas9 sistemi kullanılarak Axolotl omurilik NSCs içinde gen knock-out gerçekleştirmek için bir yöntemdir. CAS9-gRNA kompleksini omurilik merkezi kanalına enjekte ederek, Elektroporasyon sonrasında, hedef genler, NSCs 'de omuriliğin belirli bölgelerinde istenen bir zaman noktasında yıkıldı, spinal kord NSCs 'de Moleküler çalışmalar için izin Rejenerasyon.

Sox2 karşı CAS9-Grna kompleksinin enjeksiyonu ve electroporasyonu, Axolotl omurilik merkezi kanalına, spinal kord nscs çoğunluğu IÇINDE büyük Sox2 immünoreactivity kaybına yol açtı, Grna, Tyrosinaz (TYR) karşı bir kontrol olarak (Şekil 2 A). B3-tubulin (TUJ1 ile lekelenmiş), nöronlar için bir Işarettir ve nscs 'de ifade edilmedi ve merkezi kanalı çevreleyen SOX2-TUJ1-hücreler SOX2 silmeleri barındıran hücreler olarak kabul edildi. ...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes at JoVE.com

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

CAS9 protein-gRNA kompleksleri Electroporation yoluyla Axolotl omurilik nöral kök hücrelerinin doğrudan gen Knock-Out

Burada sunulan, CAS9-gRNA kompleksini omurilik merkezi kanalına enjekte ederek, akolotl spinal tellerinde zaman ve uzaya kısıtlı gen vuruş yapmak için bir protokoldür ve ardından Electroporation.

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Bu protokol, omurilik rejenerasyonunun moleküler mekanizmalarının incelenmesi için axolotl spinal kord sinir kök hücrelerinde hızlı ve yüksek nüfuz lu zaman ve uzay kısıtlamalı gen nakavtları sağlar. Bu teknik, nöral kök hücrelerde gen fonksiyonunun incelenmesini, diğer hücre tiplerinden gelen gelişimsel etkiler veya etkilerle şaşkına girmeden tıbbi yenilenmesine olanak sağlar. Axolotl nöral kök hücreler omuriliklerini yenileme yeteneklerine büyük ölçüde katkıda bulunurlar.Rejenerasyon mekanizmaları anlamak insan omurilik yaralanması için tedavi geliştirmek için anlayışlar yol açabilir. Bu yöntem, axolotl nöral kök hücrelerin omurilik yaralanmasına karşı rejeneratif bir yanıt ı nasıl monte ettiğine dair içgörü sağlar. Enjeksiyon kılcal damarını omurilik merkezi kolona doğru konumlandırmak zor olabilir ve test hayvanları üzerinde pratik yapmak teknikte ustalaşmaya yardımcı olur.Yönetimi görüntülemek nasıl enjeksiyon gerçekleştirmek ve başarılı bir enjeksiyon gibi görünüyor gösterebilir. Cas9 kılavuzu RNA ribonnükleer protein karışımını hazırlamak için beş mikrogram Cas9 nükleer lokalizasyon sırası proteini, dört mikrogram kılavuz RNA ve 0,9 mikrolitre 10X Cas9 tamponunu karıştırın. Daha sonra çekirdeksiz su ile 10 mikrolitreye toplam hacmi getirin ve hemen kullanılmadığı takdirde Cas9 kılavuzu RNA ribonnükleer protein karışımını eksi 80 santigrat derecede saklayın.Agarose elektroporasyon plakası hazırlama için, Dulbecco'nun PBS'inde %2 agarose 200 mililitre hazırlayın ve karışımı mikrodalgafırında çözün. Hafif bir soğuğa girdikten sonra, sıvı agarose'u 10 santimetrelik Petri tabaklarına yaklaşık 10 milimetre derinliğe dökün ve tabakların oda sıcaklığında katılaşmasını bekleyin. Agarose dokunmak için sağlam olduğunda, kuyruk düz tutmak için her yemeğin agarose bir yarık kesmek için bir cerrahi neşter kullanın, hayvanın vücuduna uyacak bir kuyu, ve elektrotlar tutmak için iki ekstra kuyu.Daha sonra plakaları buz üzerine yerleştirin ve buz gibi DPBS ile janta doldurun. Elektroporatörü yapılandırmak için, poring darbesini 5 milisaniyelik bir süre, 50 milisaniye lik bir aralık ve voltaj bozunması olmadan 70 voltta bir bipolar darbeye ayarlayın. Transfer darbesini 50 milisaniyelik bir süre, 999 milisaniye lik bir aralık ve %10 voltaj bozunması ile 40 voltluk dört bipolar darbeye ayarlayın.Daha sonra elektrotları elektroporatöre bağlayın ve elektrotları PBS kabına batırmadan önce cımbızları yedi milimetre arayla ayarlayın. Cam mikro enjeksiyon kılcal damarlar hazırlamak için, ısı değerini belirlemek için üreticinin talimatları uyarınca bir mikropipet çekmece üzerinde bir rampa testi gerçekleştirin. Daha sonra belirtilen parametrelerile konik biter enjeksiyon kılcal çekin.Çektikten sonra, bir stereo mikroskop ve ince forseps bir açıyla kılcal kırmak için kullanın, böylece ucu yeterince ince bir konumda eğimli bir ucu var aksolotl omurganın merkezi kanal hedef için yeterince ince ise cildi delmek için yeterince güçlü kalırken. Ucu yüklemeden önce, ribonuclear protein karışımına 1-30 oranında hızlı yeşil FCF çözeltisi ekleyin ve enjeksiyon karışımının yaklaşık beş mikrolitresini kılcal damara yüklemek için jel yükleme pipet ucu kullanın. Daha sonra kılcal damarı pnömatik pompaya monte edin ve eğimli ucu aşağı bakacak şekilde.Pnömatik pompa yapılandırmak için, inç kare başına 0,5 pound tutun ayarlayın, inç kare tutun başına iki pound fırlatma, ve kapılı süresi. Kılcal damar ve pompa ayarlarını test etmek için, kılcal damarı bir damla suya batırın ve enjekte etmek için ayak pedalına basın. Enjeksiyon karışımı yavaş ama istikrarlı bir akış içinde çıkmalıdır.Ribonükleer protein karışımıenjekte etmek için, sedasyon onaylamak için suya baş aşağı enjekte edilecek aksolotls çevirin ve bir hayvan Silikon bir yatak üzerine bir hayvan transfer etmek için halka forceps kullanmak yukarı bakacak ve kuyruk sağa bakacak. Enjeksiyon bölgesini stereo mikroskobun görüş alanının ortasına yerleştirin ve mikromanipülörü, kılcal damarın hayvana görüş alanının sağ tarafından 60 derecelik bir açıyla gireceğini görebilmeniz için ayarlayın. Omurilik ve merkezi kanal tespit ettikten sonra, yavaşça yavaşça deri ve kas deler kadar omurilik merkezi kanal doğru kılcal hareket.Kılcal damar pozisyondayken, karışımı merkezi kanala enjekte etmek için ayak pedalına basın ve basılı tutun. Kılcal damar düzgün yerleştirilmiş ise, ribonükleer protein karışımı her iki yönde mavi bir çizgi olarak merkezi kanal boyunca yayılır. Kılcal damarı doğru konumlandırmak zor olabilir.Karışım doğru yayMazsa, ayak takımı basılı tutarken kılcal pozisyonu küçük adımlarla ayarlayın. Karışım omurilik ve beyindeki ventriküller sonunda terminal vezikül ulaşana kadar ayak pedalına basılı tutmaya devam edin. Enjeksiyon sırasında fırlatma basıncını ayarlamak gerekebilir.Enjeksiyondan hemen sonra, hayvanı buz üzerinde hazırlanan agarose elektroporasyon plakasına aktarmak için halka forceps kullanın ve kuyruğu yarık içine yerleştirin, böylece agarose tarafından sandviç edilir. Tüm hayvan ve elektrotlar buz gibi PBS ile kaplı dır dikkat, kuyruk her iki tarafında kuyuiçine elektrotlar yerleştirin ve elektroporasyon başlatmak için ayak anahtarı basın. Daha sonra hayvanı tam iyileşmeye kadar izleyerek suya geri döndürün ve sonraki hayvanları da aynı şekilde enjekte edip elektroporate edin.Nakavtın protein düzeyindeki etkinliğini değerlendirmek için kuyruğun kesitini elde edin ve standart protokollere göre immünohistokimyasal analiz yapın. Alternatif olarak, elektroporated omurilik ayıklayın ve DNA elde etmek için örnek lize. Daha sonra düzenlenen genetik loci yüzdesini değerlendirmek için Sanger sıralama veya yeni nesil sıralama ardından genotipleme PCR gerçekleştirin.Axolotl omurilik merkezi kanalına Sox2'ye karşı Cas9 kılavuz RNA komplekslerinin enjeksiyonu ve elektroporasyonu, omurilik sinir kök hücrelerinin çoğunda Sox2 immünoraktivitesinde büyük bir kayba yol açar ve Cas9 kılavuz RNA komplekslerinin enjeksiyonve elektroporasyonunu kontrol olarak tirozinaza karşı karşılaştırır. Omurilik dokusu kesitörneklerinde Sox2-pozitif hücrelerin sayısallaştırılması, Cas9 Sox2 kılavuzu RNA elektroporasyon knock-out hayvanlarda Sox2-ekspres hücrelerin önemli ölçüde azaltılmış sayıda ortaya koymaktadır, bu yöntem omurilik sinir kök hücrelerinde etkili ve yüksek nüfuz gen knock-out yol açan gösteren. Sox2 ve GFP'ye karşı iki Cas9 kılavuz RNA kompleksinin her yerde GFP ekspresyonu olan transgenik aksokolotllara eşzamanlı enjeksiyon ve elektroporasyondan sonra, protokolün birden fazla geni esnek bir şekilde yok etmek için kullanılabileceğini gösteren yüksek oranda çift nakavt nöral kök hücre yüzdesi gözlenir.Merkezi kanalı bir kılcal damarla hedefleme alıştırması yapmak ve enjeksiyon beklendiği gibi çalışmadığında sorun giderme adımlarını formüle koymak yararlıdır. Bu teknik, araştırmacıların rejenerasyona özgü nöral kök hücrelerdeki genlerin işlevlerini incelemelerine olanak tanır. Kılcal damarı manipüle ederken dikkatli olun ve kendi parmaklarınızı bıçaklamamaya dikkat edin.

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

CRISPR/Cas9 Protein gen düzenleme için mikroenjeksiyon kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, embriyo içine

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Integrase-eksik Lentiviral vektörler üretimi için CRISPR/Cas9-aracılı Gene hücre bölünmesi içinde nakavt için bir iletişim kuralı

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endojen Protein insan etiketleme Pluripotent kök hücre kullanarak CRISPR/Cas9 indüklenen

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Hazırlık ve Nonhuman primat hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin gen modifikasyonu

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Keskin nişancı-Cas9 CRISPR-Cas9 hedef olarak faaliyet yönlendirilmiş evrim yoluyla kaybı olmadan hedef kapalı etkilerini en aza indirmek için kullanma

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-boru Elektroporasyon tarafından aracılı hassas gen düzenleme

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...