Name: formation of human periodontal ligament cell spheroids on chitosan films
Uploaded: 2019-06-19T15:00:00
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Questo studio è stato sponsorizzato dalla National Natural Science Foundation of China (NSFC 81700978), dai Fondi di Ricerca Fondamentali per le Università Centrali (1504219050), dalla Natural Science Foundation di Shanghai (17-R1432800) e dal Shanghai Medical Exploration Project ( 17411972600).

Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico della Scuola e Ospedale di Stomatologia, Università di Tongji. Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato scritto.
1. Isolamento delle celle PDL
<ol><li>Rendere il mezzo di proliferazione per la coltura delle cellule PDL: mezzo di z-MEM integrato con 10% FCS e 100 U/mL penna/strep.</li>
	<li>Preparare un contenitore con ghiaccio per trasferire i terzi molari isolati.</li>
	<li>Sterilizzare gli strumenti chirurgici utili...

<ol>
	<li>Albandar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+of+periodontal+diseases.">Epidemiology and risk factors of periodontal diseases.</a> Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).</li><li>Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering:+a+new+paradigm+for+periodontal+regeneration+based+on+molecular+and+cell+biology.">Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology.</a> Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).</li><li>Chen, F. M., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodontal+tissue+engineering+and+regeneration:+current+approaches+and+expanding+opportunities.">Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities.</a> Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).</li><li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+periodontal+tissue+regeneration+by+periodontal+cell+implantation.">Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation.</a> Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).</li><li>Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Based+Approaches+in+Periodontal+Regeneration:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Periodontal+Defect+Models+in+Animal+Experimental+Work.">Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work.</a> Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).</li><li>Itaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+changes+of+periodontal+ligament-derived+cells+during+passage.">Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage.</a> Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).</li><li>Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+engineered+tendon+matrix+in+the+stemness+of+tendon+stem+cells+in+vitro+and+the+promotion+of+tendon-like+tissue+formation+in+vivo.">The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo.</a> Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).</li><li>Elliott, N. T., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+three-dimensional+in+vitro+tissue+models+for+drug+discovery+and+transport+studies.">A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).</li><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities.">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li><li>Yeh, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+with+injectable+cell+sheet+fragments+of+human+amniotic+fluid+stem+cells+in+an+immune-suppressed+rat+model.">Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model.</a> Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).</li><li>Kabiri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+mesenchymal+stem/stromal+cell+osteogenesis+and+autocrine+signalling.">3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).</li><li>Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Duration+Three-Dimensional+Spheroid+Culture+Promotes+Angiogenic.">Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic.</a> Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules &amp; therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).</li><li>Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+formation+and+stemness+preservation+of+human+periodontal+ligament+cells+on+chitosan+films.">Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films.</a> Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).</li><li>Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+a+three-dimensional,+microarray+environment+on+human+Cell+culture+in+drug+screening+systems.">Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems.</a> Biomaterials. , (2012).</li><li>LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors.">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).</li><li>Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compaction,+fusion,+and+functional+activation+of+three-dimensional+human+mesenchymal+stem+cell+aggregate.">Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate.</a> Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).</li><li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 9176357 (2016).</li><li>Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+spheroid+culture+to+human+hepatocytes+and+maintenance+of+their+differentiation.">Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation.</a> Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).</li><li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+injectable+spherically+symmetric+cell+aggregates+self-assembled+in+a+thermo-responsive+hydrogel+for+enhanced+cell+transplantation.">The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation.</a> Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).</li><li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential.">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+spheroid+culture+system+on+micropatterned+substrates+for+improved+differentiation+efficiency+of+multipotent+mesenchymal+stem+cells.">3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).</li><li>Miyagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfabricated+scaffold+induces+the+spheroid+formation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+progenitor+cells+and+promotes+efficient+adipogenic+differentiation.">A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).</li><li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties.">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li><li>Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+culture+of+mesenchymal+stem+cell+spheroids+in+suspension+preserves+multilineage+potential.">Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential.</a> Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).</li><li>Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan+as+antimicrobial+agent:+applications+and+mode+of+action.">Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action.</a> Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).</li></ol>

Il presente studio ha introdotto un sistema di coltura cellulare 3D per superare alcune limitazioni legate alla coltura convenzionale delle cellule monostrato 2D. Secondo il protocollo, gli sferoidi cellulari PDL sono stati formati con successo culcolando le cellule sui film chitosani. Il nostro studio precedente ha riferito che la formazione di sferoidi ha aumentato l'auto-rinnovamento e le capacità di differenziazione osteogenica delle cellule PDL14. Invece di utilizzare un enzima per raccoglie...

La parodontite, inizializzataprincipalmente dalla placca dentale 1, è caratterizzata dal danno dei tessuti parodontali tra cui legamento parontale (PDL), osso alveolar e cementum. Gli attuali trattamenti per la parodontite di solito riescono a prevenire il progresso della malattia attiva, ma la rigenerazione dei tessuti parodontali perduti rimane una sfida clinica. Recentemente, sono stati compiuti importanti progressi negli approcci basati sulle cellule per la rigenerazione del tessuto parodontale per superare gli inconvenienti dei trattamenti attuali2,3,4.
La nostra precedente revisione sistematica ha rivelato che le cellule PDL hanno mostrato un grande potenziale per la rigenerazione parodontale5. Convenzionalmente, le cellule PDL sono coltivate su substrati bidimensionali (2D) come il polistirolo di coltura dei tessuti (TCPS). Tuttavia, sono stati osservati cambiamenti caratteristici delle cellule PDL durante la coltura in vitro6. Questo fenomeno è probabilmente dovuto al fatto che il TCPS 2D differisce dal microambiente tridimensionale in vivo (3D)7. Rispetto alle cellule coltivate su substrati 2D, le cellule coltivate in un microambiente 3D presentano maggiori somiglianze con le cellule in vivo8. Pertanto, i modelli di coltura cellulare 3D forniscono un'alternativa promettente per la coltura cellulare monostrato 2D convenzionale.
Il metodo di coltura 3D convenzionale incapsula le cellule nei biomateriali 3D. Rispetto alle cellule incapsulate in biomateriali 3D, gli sferoidi cellulari imitano più da vicino la situazione in vivo perché gli sferoidi sono aggregati di cellule che crescono libere da materiali estranei9,10,11, 12.Si dice che gli sferoidi cellulari promuovevano le bioattività MSC attraverso la conservazione dei componenti della matrice extracellulare (ECM), tra cui fibronectina e laminina13. Per migliorare i modelli convenzionali di coltura cellulare PDL, abbiamo recentemente sviluppato un metodo di coltura cellulare PDL 3D, che si basa sulla formazione di sferoidi di cellule PDL su pellicole chitosani14. La formazione di spheroid ha aumentato l'auto-rinnovamento e le capacità di differenziazione osteogenica delle cellule PDL14. Qui, presentiamo protocolli dettagliati di coltura di sferoidi delle cellule PDL basati su pellicole chitosane. Il sistema di coltura 3D degli sferoidi cellulari PDL supera alcune delle carenze legate alla coltura convenzionale delle cellule TCPS, e quindi può essere adatto per produrre cellule PDL con una maggiore efficacia terapeutica per la futura rigenerazione dei tessuti parodontali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:718px;" width="718">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">&#945;-MEM</td>
			<td style="width:158px;">Gibco</td>
			<td style="width:166px;">11900-073</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">acetic acid&#160;</td>
			<td style="width:158px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">64197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell culture flask 25 cm2</td>
			<td style="width:158px;">Corning</td>
			<td style="width:166px;">430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell culture flask 75 cm2</td>
			<td style="width:158px;">Corning</td>
			<td style="width:166px;">430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:223px;">Chitosan</td>
			<td style="width:158px;">Heppe Medical&#160;Chitosan GmbH</td>
			<td style="width:166px;">/</td>
			<td>molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FCS</td>
			<td style="width:158px;">Gibco</td>
			<td style="width:166px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td style="width:158px;">Molecular&#160;Probes</td>
			<td style="width:166px;">L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaOH</td>
			<td style="width:158px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">1310732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">PBS</td>
			<td>KeyGen Biotech&#160;</td>
			<td style="width:166px;">KGB5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">pen/strep</td>
			<td style="width:158px;">Gibco</td>
			<td style="width:166px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Trypsin/EDTA&#160;</td>
			<td>KeyGen Biotech&#160;</td>
			<td style="width:166px;">KGM25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:158px;">Corning</td>
			<td style="width:166px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">24-well plate</td>
			<td style="width:158px;">Corning</td>
			<td style="width:166px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formation of human periodontal ligament cell spheroids on chitosan films

Le cellule del legamento parodontale (PDL) sono molto promettenti per la rigenerazione del tessuto parodontale. Convenzionalmente, le cellule PDL sono coltivate su substrati bidimensionali (2D) come il polistirolo di coltura dei tessuti (TCPS). Tuttavia, sono stati osservati cambiamenti caratteristici delle cellule PDL durante la coltura in vitro. Questo fenomeno è probabilmente dovuto al fatto che il TCPS 2D differisce dal microambiente tridimensionale in vivo (3D). Rispetto alle cellule coltivate su substrati 2D, le cellule coltivate in un microambiente 3D presentano maggiori somiglianze con le cellule in vivo. Pertanto, i modelli di coltura cellulare 3D forniscono un'alternativa promettente per la coltura cellulare monostrato 2D convenzionale. Per migliorare i modelli convenzionali di coltura cellulare PDL, abbiamo recentemente sviluppato un metodo di coltura cellulare 3D, che si basa sulla formazione di sferoidi delle cellule PDL su pellicole chitosane. Qui, presentiamo protocolli dettagliati di coltura sferoide cellulare basati su pellicole chitosane. Il sistema di coltura 3D degli sferoidi cellulari PDL supera alcune delle limitazioni legate alla coltura convenzionale delle cellule monostrato 2D, e quindi può essere adatto per produrre cellule PDL con una maggiore efficacia terapeutica per la futura rigenerazione dei tessuti parodontali.

Utilizzando l'attuale protocollo, sono stati formati con successo sferoidi cellulari PDL. La figura 1 ha mostrato che le cellule sospese o gli sferoidi invece delle cellule attaccate sono stati osservati principalmente sulle pellicole chitosane. Per la densità di semina di 0,5 x 104 cellule/cm2,le cellule PDL collegate sono state occasionalmente trovate il giorno 1 e 3, e gli sferoidi delle cellule PDL sono stati raramente osservati. Al...

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Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films

Qui, presentiamo protocolli di coltura del legamento parontale umano (PDL) sferoidi cellulari da pellicole chitosane. La coltura degli sferoidi cellulari tridimensionali (3D) fornisce un'alternativa al sistema di coltura del polistirolo (TCPS) della coltura dei tessuti convenzionale.

Formazione di spheroidcellule a celle di legamento parontale umano su Chitosan Films

Periodontal ligament (PDL) cells hold great promise for periodontal tissue regeneration. Conventionally, PDL cells are cultured on two-dimensional (2D) ...

Questo è un protocollo dettagliato di coltivare sferoidi cellulari legamento parodontali da pellicole chitosane. Rispetto al sistema di coltura convenzionale, il sistema di coltura sferoide produce cellule legamentose parodontali con maggiori capacità di autori rinnovamento e differenziazione osteogenica. Per iniziare, preparare una soluzione chitosa peso-volume dell'1% come indicato nel manoscritto.Aggiungere 0,5 millilitri di soluzione chitosana in ogni pozzo di una piastra di polistirene coltura tissutale a 24 pozzo. Asciugare il piatto in un forno a 60 gradi Celsius per 24 ore per formare pellicole chitosane. Per neutralizzare le pellicole chitosane, aggiungere 0,5 millilitri di idrossido di sodio normale 0,5 ad ogni pozzo della piastra da 24 pozzetti e incubare a temperatura ambiente per due ore.Quindi, lavare le pellicole chitosane tre volte con acqua doppia distillata. Sterilizzare la piastra da 24 pozzi rivestita di chitosano con alcool al 70% durante la notte a temperatura ambiente. Risciacquare la piastra tre volte con PBS, quindi lasciarla sotto la luce ultravioletta durante la notte.Prima della semina cellulare, mezzo di proliferazione pre-caldo, soluzione PBS e soluzione EDTA di tripina a 37 gradi Celsius. Scartare il supernatante dal pallone di coltura cellulare e lavare il legamento parodontale confluente, o cellule PDL, con 10 millilitri di PBS. Scartare il PBS e aggiungere un millilitro di soluzione DI EDTA di tripina al pallone.Incubare il pallone a 37 gradi Celsius per tre minuti e quindi aggiungere tre millilitri di mezzo di proliferazione per terminare la digestione della tripina. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri, quindi centrifugarla per cinque minuti a 300 volte g. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in 500 microlitri di mezzo di proliferazione.Contare le cellule con un emocitometro e seminarle sulla piastra a cinque, 10, 30 e 60 mila cellule per centimetro quadrato. Coltura delle cellule PDL in un'incubatrice a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% e aria umidificata, cambiando il mezzo di coltura due volte a settimana. Osserva la morfologia cellulare ogni giorno per cinque giorni tramite un microscopio a contrasto di fase inversa.Gli sferoidi cellulari PDL vitali si formano correttamente utilizzando questo protocollo. Gli sferoidi sono raramente osservati per la densità di semina inferiore nei giorni uno e tre. Ma alle due densità più elevate, varie dimensioni di sferoidi sono presenti fin dal primo giorno.La densità di semina ottimale è di 30 mila cellule per centimetro al quadrato perché si traduce in sferoidi omogenei. Dopo cinque giorni di coltura, si osservano sferoidi più grandi per tutte le densità di semina. Un saggio di vitalità dimostra che la maggior parte delle cellule PDL sono vive nei giorni uno, tre e sei, ma il numero di cellule morte aumenta il sesto giorno.Una limitazione di questo protocollo è la diminuzione della proliferazione delle cellule dopo la formazione di sferoidi. Sono quindi necessari ulteriori studi per promuovere la proliferazione delle cellule dopo la formazione di sferoidi.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differenziazione di una linea di cellule staminali neurali umane in Tre Culture dimensionali, Geni Analisi di MicroRNA e putativo di destinazione

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

A Novel cultura Modello pluripotenti staminali umane propagazione delle cellule su Gelatina in Media Placenta condizionata

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Generazione di culture geneticamente modificate pelle organotipiche Uso devitalizzate derma umano

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Coltura umane pluripotenti e neurali cellule staminali in un sistema di coltura cellulare chiuso per base e preclinica di ricerca

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Un base di RANKL Osteoclast cultura Assay di midollo osseo del topo per studiare il ruolo di mTORC1 nella formazione degli osteoclasti

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cella di aggregazione saggi per valutare l'associazione della tacca della drosofila con Trans-ligandi e la sua inibizione di Cis-ligandi

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

HuVEC Analisi della formazione di tubi per valutare l'impatto dei prodotti naturali sull'angiogenesi

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane nelle cellule del fegato

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Riprogrammazione emogenica dei fibroblasti umani mediante l'espressione forzata dei fattori di trascrizione

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...