Name: formation of human periodontal ligament cell spheroids on chitosan films
Uploaded: 2019-06-19T15:00:00
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Este estudo foi patrocinado pela National natural Science Foundation of China (NSFC 81700978), fundos de pesquisa fundamental para as universidades centrais (1504219050), Fundação de ciência natural de Xangai (17ZR1432800), e Shanghai Medical Exploration Project ( 17411972600).

O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de ética da escola e hospital de Estomatologia da Universidade de Tongji. Todos os pacientes forneceram o consentimento informado escrito.
1. isolação da pilha de PDL
<ol><li>Faça meio de proliferação para cultura de células PDL: meio α-MEM suplementado com 10% FCS e 100 U/mL Pen/Strep.</li>
	<li>Prepare um recipiente com gelo para transferir terceiros molares isolados.</li>
	<li>Esterilizar instrumentos cirúrgicos usando uma autoclave...

<ol>
	<li>Albandar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+of+periodontal+diseases.">Epidemiology and risk factors of periodontal diseases.</a> Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).</li><li>Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering:+a+new+paradigm+for+periodontal+regeneration+based+on+molecular+and+cell+biology.">Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology.</a> Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).</li><li>Chen, F. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities.">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li><li>Yeh, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+with+injectable+cell+sheet+fragments+of+human+amniotic+fluid+stem+cells+in+an+immune-suppressed+rat+model.">Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model.</a> Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).</li><li>Kabiri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+mesenchymal+stem/stromal+cell+osteogenesis+and+autocrine+signalling.">3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).</li><li>Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Duration+Three-Dimensional+Spheroid+Culture+Promotes+Angiogenic.">Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic.</a> Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules &amp; therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).</li><li>Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+formation+and+stemness+preservation+of+human+periodontal+ligament+cells+on+chitosan+films.">Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films.</a> Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).</li><li>Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+a+three-dimensional,+microarray+environment+on+human+Cell+culture+in+drug+screening+systems.">Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems.</a> Biomaterials. , (2012).</li><li>LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors.">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).</li><li>Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compaction,+fusion,+and+functional+activation+of+three-dimensional+human+mesenchymal+stem+cell+aggregate.">Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate.</a> Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).</li><li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 9176357 (2016).</li><li>Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+spheroid+culture+to+human+hepatocytes+and+maintenance+of+their+differentiation.">Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation.</a> Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).</li><li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+injectable+spherically+symmetric+cell+aggregates+self-assembled+in+a+thermo-responsive+hydrogel+for+enhanced+cell+transplantation.">The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation.</a> Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).</li><li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties.">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li><li>Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+culture+of+mesenchymal+stem+cell+spheroids+in+suspension+preserves+multilineage+potential.">Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential.</a> Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).</li><li>Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan+as+antimicrobial+agent:+applications+and+mode+of+action.">Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action.</a> Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).</li></ol>

O presente estudo introduziu um sistema de cultura de células 3D para superar algumas limitações relacionadas à cultura de células monocamada 2D convencional. De acordo com o protocolo, os esferoides celulares de PDL foram formados com sucesso cultivando pilhas em películas do quitosana. Nosso estudo prévio relatou que a formação de esferóides aumentou a autorenovação e as capacidades de diferenciação osteogênica das células PDL14. Em vez de usar uma enzima para colher células de ...

A periodontite, inicializada principalmente pela placa dentária1, caracteriza-se pelo dano dos tecidos periodontais, incluindo o ligamento periodontal (PDL), o osso alveolar e o cementum. Os tratamentos atuais para o periodontite são geralmente bem sucedidos em impedir o progresso da doença ativa, mas a regeneração de tecidos peridentais perdidos permanece um desafio clínico. Recentemente, avanços importantes foram feitos em abordagens baseadas em células para a regeneração tecidual periodontal para superar as desvantagens dos tratamentos atuais2,3,4.
Nossa revisão sistemática prévia revelou que as pilhas de PDL mostraram o grande potencial para a regeneração peridental5. Convencionalmente, as células PDL são cultivadas em substratos bidimensionais (2D), como poliestireno de cultura tecidual (TCPS). No entanto, alterações características das células PDL foram observadas durante a cultura in vitro6. Este fenômeno é provavelmente porque o 2D TCPS difere do in vivo tridimensional (3D) microambiente7. Comparado às células cultivadas em substratos 2D, as células cultivadas em um microambiente 3D exibem mais semelhanças com as células in vivo8. Portanto, os modelos de cultura de células 3D fornecem uma alternativa promissora para a cultura de células monocamada 2D convencional.
O método convencional da cultura 3D está encapsulando pilhas em biomateriais 3D. Comparado com as células encapsuladas em biomateriais 3D, os esferoides celulares imitam a situação in vivo mais de perto porque os esferóides são agregados de células que crescem livres de materiais estranhos9,10,11, 12. é relatado que os esferóides celulares promoveram BIOATIVIDADES do MSC através da preservação dos componentes da matriz extracelular (ECM), incluindo fibronectina e laminina13. Para melhorar os modelos convencionais da cultura de pilha de PDL, nós desenvolvemos recentemente um método da cultura de pilha de 3D PDL, que seja baseado na formação esferóide de pilhas de PDL em películas14do quitosana. A formação de esferóides aumentou a autorenovação e a capacidade de diferenciação osteogênica das células de PDL14. Aqui, nós apresentamos protocolos detalhados da cultura do esferóide da pilha de PDL baseados em películas do quitosana. O sistema da cultura 3D de esferoides celulares de PDL supera algumas das deficiências relativas à cultura de pilha convencional de TCPs, e pode assim ser apropriada para produzir pilhas de PDL com uma eficácia terapêutica realçada para a regeneração peridental futura do tecido.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:718px;" width="718">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">&#945;-MEM</td>
			<td style="width:158px;">Gibco</td>
			<td style="width:166px;">11900-073</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">acetic acid&#160;</td>
			<td style="width:158px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">64197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell culture flask 25 cm2</td>
			<td style="width:158px;">Corning</td>
			<td style="width:166px;">430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell culture flask 75 cm2</td>
			<td style="width:158px;">Corning</td>
			<td style="width:166px;">430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:223px;">Chitosan</td>
			<td style="width:158px;">Heppe Medical&#160;Chitosan GmbH</td>
			<td style="width:166px;">/</td>
			<td>molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FCS</td>
			<td style="width:158px;">Gibco</td>
			<td style="width:166px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td style="width:158px;">Molecular&#160;Probes</td>
			<td style="width:166px;">L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaOH</td>
			<td style="width:158px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">1310732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">PBS</td>
			<td>KeyGen Biotech&#160;</td>
			<td style="width:166px;">KGB5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">pen/strep</td>
			<td style="width:158px;">Gibco</td>
			<td style="width:166px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Trypsin/EDTA&#160;</td>
			<td>KeyGen Biotech&#160;</td>
			<td style="width:166px;">KGM25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:158px;">Corning</td>
			<td style="width:166px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">24-well plate</td>
			<td style="width:158px;">Corning</td>
			<td style="width:166px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formation of human periodontal ligament cell spheroids on chitosan films

As pilhas do ligamento peridental (PDL) prendem a grande promessa para a regeneração peridental do tecido. Convencionalmente, as células PDL são cultivadas em substratos bidimensionais (2D), como poliestireno de cultura tecidual (TCPS). Entretanto, as mudanças características de pilhas de PDL foram observadas durante a cultura in vitro. Este fenômeno é provavelmente porque o 2D TCPS difere do in vivo tridimensional (3D) microambiente. Comparado às células cultivadas em substratos 2D, as células cultivadas em um microambiente 3D exibem mais semelhanças com as células in vivo. Portanto, os modelos de cultura de células 3D fornecem uma alternativa promissora para a cultura de células monocamada 2D convencional. Para melhorar os modelos convencionais da cultura de pilha de PDL, nós desenvolvemos recentemente um método da cultura da pilha 3D, que seja baseado na formação esferóide de pilhas de PDL em películas do quitosana. Aqui, nós apresentamos protocolos detalhados da cultura do esferóide da pilha baseados em películas do quitosana. O sistema da cultura 3D de esferoides celulares de PDL supera algumas das limitações relativas à cultura convencional da pilha da monocamada 2D, e pode assim ser apropriada produzindo pilhas de PDL com uma eficácia terapêutica realçada para a regeneração peridental futura do tecido.

Usando o protocolo atual, os esferoides viáveis da pilha de PDL foram dados forma com sucesso. A Figura 1 mostrou que células suspensas ou esferóides em vez de células anexadas foram observadas principalmente em filmes de quitosana. Para a densidade de semeadura de 0,5 x 104 Cells/cm2, as pilhas PDL anexadas foram encontradas ocasionalmente no dia 1 e 3, e os esferoides da pilha de PDL foram observados raramente. Pelo contrário, par...

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Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films

Aqui, nós apresentamos protocolos de cultivo de esferoides da pilha do ligamento periodontal humano (PDL) por películas do quitosana. A cultura de esferoides celulares tridimensionais (3D) fornece uma alternativa ao sistema convencional da cultura do poliestireno da cultura do tecido (TCPs).

Formação de esferóides da célula do ligamento periodontal humano em filmes de quitosana

Periodontal ligament (PDL) cells hold great promise for periodontal tissue regeneration. Conventionally, PDL cells are cultured on two-dimensional (2D) ...

Este é um protocolo detalhado de cultivo de esferoides de células ligamentares periodontais por filmes quitosanos. Comparado com o sistema de cultura convencional, o sistema de cultura esferoide produz células do ligamento periodontal com maior autoconexão e capacidades de diferenciação osteogênica. Para começar, prepare a solução chitosana de peso para volume de 1%, conforme indicado no manuscrito.Adicione 0,5 mililitros de solução de chitosan em cada poço de uma placa de poliestireno de cultura tecidual de 24 poços. Seque a placa em um forno a 60 graus Celsius durante 24 horas para formar filmes de chitosan. Para neutralizar os filmes de chitosan, adicione 0,5 mililitros de hidróxido de sódio normal de 0,5 a cada poço da placa de 24 poços e incubar à temperatura ambiente por duas horas.Em seguida, lave os filmes de chitosan três vezes com água duplamente destilada. Esterilize a placa de 24 poços revestida de quitosan em 70% de álcool durante a noite à temperatura ambiente. Enxágüe a placa três vezes com PBS e deixe-a sob luz ultravioleta durante a noite.Antes da semeadura celular, meio de proliferação pré-quente, solução PBS e solução EDTA de trippsina a 37 graus Celsius. Descarte o supernascedor do frasco de cultura celular e lave o ligamento periodontal confluente, ou células PDL, com 10 mililitros de PBS. Descarte o PBS e adicione um mililitro de solução EDTA de trippsina ao frasco.Incubar o frasco a 37 graus Celsius por três minutos e, em seguida, adicionar três mililitros de meio de proliferação para terminar a digestão de trippsina. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros e depois centrífuga por cinco minutos a 300 vezes g. Descarte o supernascer e suspenda as células em 500 microliters de meio de proliferação.Conte as células com um hemócito e semee-as na placa a cinco, 10, 30 e 60 mil células por centímetro quadrado. Cultura as células PDL em uma incubadora a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono e ar umidificado, mudando o meio cultural duas vezes por semana. Observe a morfologia celular diariamente por cinco dias através de um microscópio de contraste de fase inversa.Esferoides viáveis de células PDL são formados com sucesso usando este protocolo. Esferoides raramente são observados para a densidade de menor semeadura nos dias um e três. Mas nas duas densidades mais altas, vários tamanhos de esferoides estão presentes desde o primeiro dia.A densidade ideal de semeadura é de 30 mil células por centímetro quadrado porque resulta em esferoides homogêneos. Após cinco dias de cultura, spheróides maiores são observados para todas as densidades de semeadura. Um ensaio de viabilidade demonstra que a maioria das células PDL estão vivas nos dias um, três e seis, mas o número de células mortas aumenta no sexto dia.Uma limitação deste protocolo é a diminuição da proliferação de células após a formação de esferoides. Assim, são necessários mais estudos para promover a proliferação de células após a formação de esferoides.

Research

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Developmental Biology

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Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organotï¿½icas Usando desvitalizado derme humana

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Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Celular agregação ensaios para avaliar a vinculação do entalhe drosófila com Trans-ligantes e sua inibição pelo Cis-ligantes

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

Tubo HUVEC-ensaio de formação para avaliar o impacto dos produtos naturais na angiogênese

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Reprogramação hemogénica de fibroblastos humanos pela expressão forçada de fatores de transcrição

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...