Name: formation of human periodontal ligament cell spheroids on chitosan films
Uploaded: 2019-06-19T15:00:00
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Este estudio fue patrocinado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC 81700978), los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (1504219050), la Fundación de Ciencias Naturales de Shanghái (17ZR1432800), y el Proyecto de Exploración Médica de Shanghái ( 17411972600).

El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de ética de la escuela y el hospital de estomatología, Universidad Tongji. Todos los pacientes proporcionaron consentimiento informado por escrito.
1. Aislamiento de células PDL
<ol><li>Haga medio de proliferación para el cultivo de células PDL: medio MEM complementado con 10% FCS y 100 U/ml pluma/estreptococo.</li>
	<li>Preparar un recipiente con hielo para transferir terceros molares aislados.</li>
	<li>Esterilice los instrumentos qu...

<ol>
	<li>Albandar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+of+periodontal+diseases.">Epidemiology and risk factors of periodontal diseases.</a> Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).</li><li>Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering:+a+new+paradigm+for+periodontal+regeneration+based+on+molecular+and+cell+biology.">Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology.</a> Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).</li><li>Chen, F. M., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodontal+tissue+engineering+and+regeneration:+current+approaches+and+expanding+opportunities.">Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities.</a> Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).</li><li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+periodontal+tissue+regeneration+by+periodontal+cell+implantation.">Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation.</a> Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).</li><li>Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Based+Approaches+in+Periodontal+Regeneration:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Periodontal+Defect+Models+in+Animal+Experimental+Work.">Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work.</a> Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).</li><li>Itaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+changes+of+periodontal+ligament-derived+cells+during+passage.">Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage.</a> Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).</li><li>Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+engineered+tendon+matrix+in+the+stemness+of+tendon+stem+cells+in+vitro+and+the+promotion+of+tendon-like+tissue+formation+in+vivo.">The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo.</a> Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).</li><li>Elliott, N. T., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+three-dimensional+in+vitro+tissue+models+for+drug+discovery+and+transport+studies.">A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).</li><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities.">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li><li>Yeh, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+with+injectable+cell+sheet+fragments+of+human+amniotic+fluid+stem+cells+in+an+immune-suppressed+rat+model.">Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model.</a> Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).</li><li>Kabiri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+mesenchymal+stem/stromal+cell+osteogenesis+and+autocrine+signalling.">3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).</li><li>Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Duration+Three-Dimensional+Spheroid+Culture+Promotes+Angiogenic.">Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic.</a> Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules &amp; therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).</li><li>Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+formation+and+stemness+preservation+of+human+periodontal+ligament+cells+on+chitosan+films.">Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films.</a> Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).</li><li>Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+a+three-dimensional,+microarray+environment+on+human+Cell+culture+in+drug+screening+systems.">Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems.</a> Biomaterials. , (2012).</li><li>LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors.">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).</li><li>Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compaction,+fusion,+and+functional+activation+of+three-dimensional+human+mesenchymal+stem+cell+aggregate.">Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate.</a> Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).</li><li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 9176357 (2016).</li><li>Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+spheroid+culture+to+human+hepatocytes+and+maintenance+of+their+differentiation.">Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation.</a> Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).</li><li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+injectable+spherically+symmetric+cell+aggregates+self-assembled+in+a+thermo-responsive+hydrogel+for+enhanced+cell+transplantation.">The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation.</a> Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).</li><li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential.">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+spheroid+culture+system+on+micropatterned+substrates+for+improved+differentiation+efficiency+of+multipotent+mesenchymal+stem+cells.">3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).</li><li>Miyagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfabricated+scaffold+induces+the+spheroid+formation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+progenitor+cells+and+promotes+efficient+adipogenic+differentiation.">A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).</li><li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties.">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li><li>Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+culture+of+mesenchymal+stem+cell+spheroids+in+suspension+preserves+multilineage+potential.">Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential.</a> Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).</li><li>Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan+as+antimicrobial+agent:+applications+and+mode+of+action.">Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action.</a> Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).</li></ol>

El presente estudio introdujo un sistema de cultivo celular 3D para superar algunas limitaciones relacionadas con el cultivo celular monocapa 2D convencional. Según el protocolo, los esferoides celulares PDL se formaron con éxito mediante el cultivo de células en películas de quitosana. Nuestro estudio anterior informó que la formación de esferoides aumentó las capacidades de auto-renovación y diferenciación osteogénica de las células PDL14. En lugar de utilizar una enzima para cosechar...

La periodontitis, inicializada principalmente por placa dental1, se caracteriza por el daño de los tejidos periodontales incluyendo el ligamento periodontal (PDL), hueso alveolar, y cemento. Los tratamientos actuales para la periodontitis suelen tener éxito en la prevención del progreso de la enfermedad activa, pero la regeneración de los tejidos periodontales perdidos sigue siendo un desafío clínico. Recientemente, se han realizado importantes progresos en los enfoques basados en células para la regeneración del tejido periodontal para superar los inconvenientes de los tratamientos actuales2,3,4.
Nuestra revisión sistemática anterior reveló que las células PDL mostraron un gran potencial para la regeneración periodontal5. Convencionalmente, las células PDL se cultivan en sustratos bidimensionales (2D), como el poliestireno de cultivo tisular (TCPS). Sin embargo, se han observado cambios característicos de las células PDL durante el cultivo in vitro6. Este fenómeno se debe probablemente a que el TCPS 2D difiere del microambiente tridimensional in vivo (3D)7. En comparación con las células cultivadas en sustratos 2D, las células cultivadas en un microambiente 3D presentan más similitudes con las células in vivo8. Por lo tanto, los modelos de cultivo de celdas 3D proporcionan una alternativa prometedora para el cultivo de células monocapa 2D convencional.
El método de cultivo 3D convencional es encapsular células en biomateriales 3D. En comparación con las células encapsuladas en biomateriales 3D, los esferoides celulares imitan más de cerca la situación in vivo porque los esferoides son agregados de células que crecen libres de materiales extraños9,10,11, 12. Se informa que los esferoides celulares promovieron las bioactividades de MSC a través de la preservación de componentes de matriz extracelular (ECM), incluyendo fibronectina y laminina13. Para mejorar los modelos convencionales de cultivo celular PDL, recientemente hemos desarrollado un método de cultivo celular PDL 3D, que se basa en la formación de esferoides de células PDL en películas de quitosana14. La formación de esferoides aumentó la auto-renovación y las capacidades de diferenciación osteogénica de las células PDL14. Aquí, presentamos protocolos detallados de cultivo de esferoides de células PDL basados en películas de quitosano. El sistema de cultivo 3D de esferoides celulares PDL supera algunas de las deficiencias relacionadas con el cultivo celular TCPS convencional, y por lo tanto puede ser adecuado para la producción de células PDL con una eficacia terapéutica mejorada para la regeneración futura del tejido periodontal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:718px;" width="718">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">&#945;-MEM</td>
			<td style="width:158px;">Gibco</td>
			<td style="width:166px;">11900-073</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">acetic acid&#160;</td>
			<td style="width:158px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">64197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell culture flask 25 cm2</td>
			<td style="width:158px;">Corning</td>
			<td style="width:166px;">430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell culture flask 75 cm2</td>
			<td style="width:158px;">Corning</td>
			<td style="width:166px;">430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:223px;">Chitosan</td>
			<td style="width:158px;">Heppe Medical&#160;Chitosan GmbH</td>
			<td style="width:166px;">/</td>
			<td>molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FCS</td>
			<td style="width:158px;">Gibco</td>
			<td style="width:166px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td style="width:158px;">Molecular&#160;Probes</td>
			<td style="width:166px;">L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaOH</td>
			<td style="width:158px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">1310732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">PBS</td>
			<td>KeyGen Biotech&#160;</td>
			<td style="width:166px;">KGB5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">pen/strep</td>
			<td style="width:158px;">Gibco</td>
			<td style="width:166px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Trypsin/EDTA&#160;</td>
			<td>KeyGen Biotech&#160;</td>
			<td style="width:166px;">KGM25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:158px;">Corning</td>
			<td style="width:166px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">24-well plate</td>
			<td style="width:158px;">Corning</td>
			<td style="width:166px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formation of human periodontal ligament cell spheroids on chitosan films

Las células del ligamento periodontal (PDL) son muy prometedoras para la regeneración del tejido periodontal. Convencionalmente, las células PDL se cultivan en sustratos bidimensionales (2D), como el poliestireno de cultivo tisular (TCPS). Sin embargo, se han observado cambios característicos de las células PDL durante el cultivo in vitro. Este fenómeno se debe probablemente a que el TCPS 2D difiere del microambiente tridimensional in vivo (3D). En comparación con las células cultivadas en sustratos 2D, las células cultivadas en un microambiente 3D presentan más similitudes con las células in vivo. Por lo tanto, los modelos de cultivo de celdas 3D proporcionan una alternativa prometedora para el cultivo de células monocapa 2D convencional. Para mejorar los modelos convencionales de cultivo celular PDL, recientemente hemos desarrollado un método de cultivo celular 3D, que se basa en la formación de esferoides de células PDL en películas de quitosana. Aquí, presentamos protocolos detallados de cultivo de esferoides celulares basados en películas de quitosano. El sistema de cultivo 3D de esferoides celulares PDL supera algunas de las limitaciones relacionadas con el cultivo celular monocapa 2D convencional, y por lo tanto puede ser adecuado para la producción de células PDL con una eficacia terapéutica mejorada para la regeneración futura del tejido periodontal.

Usando el protocolo actual, se formaron con éxito esferoides de células PDL viables. La Figura 1 mostró que las células suspendidas o esferoides en lugar de las células adheridas se observaron principalmente en películas de quitosano. Para la densidad de sembrado de 0,5 x 104 células/cm2,las células PDL conectadas se encontraron ocasionalmente en los días 1 y 3, y rara vez se observaron esferoides de células PDL. Por el contrar...

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Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films

Aquí, presentamos protocolos de cultivo de esferoides celulares del ligamento periodontal humano (PDL) por películas de quitosano. El cultivo de esferoides celulares tridimensionales (3D) proporciona una alternativa al sistema de cultivo de poliestireno (TCPS) de cultivo tisular convencional.

Formación de esferoides de células de ligamento periodontal humano en Chitosan Films

Periodontal ligament (PDL) cells hold great promise for periodontal tissue regeneration. Conventionally, PDL cells are cultured on two-dimensional (2D) ...

Este es un protocolo detallado de cultivo de esferoides de células de ligamentos periodontales por películas de quitosano. En comparación con el sistema de cultivo convencional, el sistema de cultivo de esferoides produce células de ligamentos periodontales con mayor capacidad de auto-renovación y diferenciación osteogénica. Para empezar, prepare una solución de quitosano de 1%peso a volumen como se indica en el manuscrito.Añadir 0,5 mililitros de solución de quitosano en cada pocódica de 24 pocillos de cultivo de tejido. Seque el plato en un horno a 60 grados centígrados durante 24 horas para formar películas de quitosano. Para neutralizar las películas de quitosano, añadir 0,5 mililitros de 0,5 hidróxido de sodio normal a cada pozo de la placa de 24 pozos e incubar a temperatura ambiente durante dos horas.A continuación, lave las películas de quitosano tres veces con agua doble destilada. Esterilice el plato de 24 pozos recubierto de quitosano en 70% de alcohol durante la noche a temperatura ambiente. Enjuague la placa tres veces con PBS y déjela bajo luz ultravioleta durante la noche.Antes de la siembra celular, medio de proliferación pre-cálido, solución PBS y solución EDTA de trippsa a 37 grados Celsius. Deseche el sobrenadante del matraz de cultivo celular y lave el ligamento periodontal confluente, o células PDL, con 10 mililitros de PBS. Deseche el PBS y agregue un mililitro de solución EDTA de trippsina al matraz.Incubar el matraz a 37 grados centígrados durante tres minutos y luego añadir tres mililitros de medio de proliferación para terminar la digestión de la trippsina. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros y luego centrifugarlo durante cinco minutos a 300 g. Desechar el sobrenadante y volver a suspender las células en 500 microlitros de medio de proliferación.Cuente las células con un hemocitoómetro y se las semilla en la placa a cinco, 10, 30 y 60 mil células por centímetro cuadrado. Cultivo de las células PDL en una incubadora a 37 grados Celsius en 5%dióxido de carbono y aire humidificado, cambiando el medio de cultivo dos veces por semana. Observar la morfología celular diariamente durante cinco días a través de un microscopio de contraste de fase inversa.Los esferoides de células PDL viables se forman con éxito utilizando este protocolo. Los esferoides rara vez se observan para la densidad de siembra inferior en los días uno y tres. Pero en las dos densidades más altas, varios tamaños de esferoides están presentes desde el primer día.La densidad óptima de siembra es de 30 mil células por centímetro cuadrado porque resulta en esferoides homogéneos. Después de cinco días de cultivo, se observan esferoides más grandes para todas las densidades de siembra. Un ensayo de viabilidad demuestra que la mayoría de las células PDL están vivas en los días uno, tres y seis, pero el número de células muertas aumenta en el sexto día.Una limitación de este protocolo es la disminución de la proliferación de células después de la formación de esferoides. Por lo tanto, se requieren más estudios para promover la proliferación de células después de la formación de esferoides.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Célula de ensayos de agregación para evaluar el atascamiento de la muesca de Drosophila con Trans-ligandos y su inhibición por Cis-ligandos

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

HUVEC Ensayo de formación de tubos para evaluar el impacto de los productos naturales en la angiogénesis

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Diferenciación eficiente de células madre pluripotentes humanas en células hepáticas

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Reprogramación hemogénica de fibroblastos humanos por expresión forzada de factores de transcripción

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...