Name: formation of human periodontal ligament cell spheroids on chitosan films
Uploaded: 2019-06-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films at JoVE.com

Denna studie sponsrades av National Natural Science Foundation i Kina (NSFC 81700978), grundläggande forsknings fonder för de centrala universiteten (1504219050), Natural Science Foundation i Shanghai (17ZR1432800), och Shanghai Medical prospektering Project ( 17411972600).

Studie protokollet godkändes av etik kommittén för skolan och sjukhuset i stomatologi, Tongji University. Alla patienter gav skriftligt informerat samtycke.
1. PDL-cellisolering
<ol><li>Gör spridnings mediet för odling av PDL-celler: α-MEM medium kompletterat med 10% FCS och 100 U/mL penna/STREP.</li>
	<li>Förbered en behållare med is för att överföra isolerade tredje molarer.</li>
	<li>Sterilisera kirurgiska instrument genom att använda en autoklav.</li>
	<li>Extrahera normala m...

<ol>
	<li>Albandar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+of+periodontal+diseases.">Epidemiology and risk factors of periodontal diseases.</a> Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).</li><li>Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering:+a+new+paradigm+for+periodontal+regeneration+based+on+molecular+and+cell+biology.">Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology.</a> Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).</li><li>Chen, F. M., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodontal+tissue+engineering+and+regeneration:+current+approaches+and+expanding+opportunities.">Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities.</a> Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).</li><li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+periodontal+tissue+regeneration+by+periodontal+cell+implantation.">Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation.</a> Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).</li><li>Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Based+Approaches+in+Periodontal+Regeneration:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Periodontal+Defect+Models+in+Animal+Experimental+Work.">Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work.</a> Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).</li><li>Itaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+changes+of+periodontal+ligament-derived+cells+during+passage.">Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage.</a> Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).</li><li>Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+engineered+tendon+matrix+in+the+stemness+of+tendon+stem+cells+in+vitro+and+the+promotion+of+tendon-like+tissue+formation+in+vivo.">The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo.</a> Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).</li><li>Elliott, N. T., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+three-dimensional+in+vitro+tissue+models+for+drug+discovery+and+transport+studies.">A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).</li><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities.">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li><li>Yeh, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+with+injectable+cell+sheet+fragments+of+human+amniotic+fluid+stem+cells+in+an+immune-suppressed+rat+model.">Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model.</a> Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).</li><li>Kabiri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+mesenchymal+stem/stromal+cell+osteogenesis+and+autocrine+signalling.">3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).</li><li>Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Duration+Three-Dimensional+Spheroid+Culture+Promotes+Angiogenic.">Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic.</a> Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules &amp; therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).</li><li>Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+formation+and+stemness+preservation+of+human+periodontal+ligament+cells+on+chitosan+films.">Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films.</a> Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).</li><li>Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+a+three-dimensional,+microarray+environment+on+human+Cell+culture+in+drug+screening+systems.">Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems.</a> Biomaterials. , (2012).</li><li>LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors.">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).</li><li>Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compaction,+fusion,+and+functional+activation+of+three-dimensional+human+mesenchymal+stem+cell+aggregate.">Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate.</a> Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).</li><li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 9176357 (2016).</li><li>Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+spheroid+culture+to+human+hepatocytes+and+maintenance+of+their+differentiation.">Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation.</a> Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).</li><li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+injectable+spherically+symmetric+cell+aggregates+self-assembled+in+a+thermo-responsive+hydrogel+for+enhanced+cell+transplantation.">The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation.</a> Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).</li><li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential.">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+spheroid+culture+system+on+micropatterned+substrates+for+improved+differentiation+efficiency+of+multipotent+mesenchymal+stem+cells.">3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).</li><li>Miyagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfabricated+scaffold+induces+the+spheroid+formation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+progenitor+cells+and+promotes+efficient+adipogenic+differentiation.">A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).</li><li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties.">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li><li>Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+culture+of+mesenchymal+stem+cell+spheroids+in+suspension+preserves+multilineage+potential.">Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential.</a> Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).</li><li>Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan+as+antimicrobial+agent:+applications+and+mode+of+action.">Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action.</a> Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).</li></ol>

I den här studien infördes en 3D cell kultur system för att övervinna vissa begränsningar i samband med konventionella 2D enskiktslager cell kultur. Enligt protokollet, PDL cellulära sfäroider framgångs rikt bildades genom odling av celler på Chitosan filmer. Vår tidigare studie rapporterade att sfäroid bildandet ökade själv förnyelse och osteogena differentiering kapacitet PDL celler14. Istället för att använda ett enzym för att skörda celler från TCPS, PDL cell sfäroider kun...

Parodontit, initieras främst av dental plack1, kännetecknas av skador av parodontala vävnader inklusive parodontala ligament (PDL), alveolära ben, och cementum. Nuvarande behandlingar för parodontit är oftast framgångs rika i att förhindra utvecklingen av den aktiva sjukdomen, men regenerering av förlorade periodontala vävnader förblir en klinisk utmaning. Nyligen har viktiga framsteg gjorts i cellbaserade metoder för tandlossning vävnad förnyelse för att övervinna nack delarna med nuvarande behandlingar2,3,4.
Vår tidigare systematiska granskning visade att PDL-celler visade stor potential för parodontala förnyelse5. Konventionellt, PDL celler odlas på tvådimensionella (2D) substrat såsom vävnad kultur polystyren (TCPS). Emellertid har karakteristiska förändringar av PDL-celler observerats under in vitro-kultur6. Detta fenomen beror antagligen på att 2D TCPS skiljer sig från in vivo tredimensionell (3D) mikromiljö7. Jämfört med celler odlade på 2D-substrat, celler som odlas i en 3D-mikromiljö uppvisar fler likheter med in vivo-celler8. Därför, 3D cell kulturer modeller ger ett lovande alternativ för konventionell 2D enskiktslager cell kultur.
Konventionell 3D-kulturmetod är inkapsling celler i 3D biomaterial. Jämfört med celler inkapslade i 3D biomaterial, cellulära sfäroider efterlikna in vivo situationen närmare eftersom sfäroider är aggregat av celler som växer fritt från främmande material9,10,11, 12. det rapporteras att cellulära sfäroider främjas MSC bioverksamhet via bevarandet av extracellulär matrix (ECM) komponenter inklusive Fibronektin och laminin13. För att förbättra konventionella PDL cell kultur modeller, har vi nyligen utvecklat en 3D PDL cell kultur metod, som bygger på sfäroid bildandet av PDL celler på Chitosan filmer14. Sfäroid bildandet ökade själv förnyelse och osteogena differentiering kapacitet PDL-celler14. Här presenterar vi detaljerade PDL cell sfäroiden kultur protokoll baserade på Chitosan filmer. 3D-kulturen systemet av PDL cellulära sfäroider övervinna några av bristerna i samband med konventionella TCPS cell kultur, och därmed kan vara lämplig för att producera PDL celler med en förbättrad terapeutisk effekt för framtida tandlossning vävnad förnyelse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:718px;" width="718">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">&#945;-MEM</td>
			<td style="width:158px;">Gibco</td>
			<td style="width:166px;">11900-073</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">acetic acid&#160;</td>
			<td style="width:158px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">64197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell culture flask 25 cm2</td>
			<td style="width:158px;">Corning</td>
			<td style="width:166px;">430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell culture flask 75 cm2</td>
			<td style="width:158px;">Corning</td>
			<td style="width:166px;">430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:223px;">Chitosan</td>
			<td style="width:158px;">Heppe Medical&#160;Chitosan GmbH</td>
			<td style="width:166px;">/</td>
			<td>molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FCS</td>
			<td style="width:158px;">Gibco</td>
			<td style="width:166px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td style="width:158px;">Molecular&#160;Probes</td>
			<td style="width:166px;">L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaOH</td>
			<td style="width:158px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">1310732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">PBS</td>
			<td>KeyGen Biotech&#160;</td>
			<td style="width:166px;">KGB5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">pen/strep</td>
			<td style="width:158px;">Gibco</td>
			<td style="width:166px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Trypsin/EDTA&#160;</td>
			<td>KeyGen Biotech&#160;</td>
			<td style="width:166px;">KGM25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:158px;">Corning</td>
			<td style="width:166px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">24-well plate</td>
			<td style="width:158px;">Corning</td>
			<td style="width:166px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formation of human periodontal ligament cell spheroids on chitosan films

Parodontala ligament (PDL) celler hålla stort löfte för parodontala vävnad förnyelse. Konventionellt, PDL celler odlas på tvådimensionella (2D) substrat såsom vävnad kultur polystyren (TCPS). Emellertid har karakteristiska förändringar av PDL-celler observerats under in vitro-kulturen. Detta fenomen beror antagligen på att 2D TCPS skiljer sig från in vivo tredimensionell (3D) mikromiljö. Jämfört med celler odlade på 2D-substrat, celler som odlas i en 3D-mikromiljö uppvisar fler likheter med in vivo-celler. Därför, 3D cell kulturer modeller ger ett lovande alternativ för konventionell 2D enskiktslager cell kultur. För att förbättra konventionella PDL cell kultur modeller, har vi nyligen utvecklat en 3D-cell kultur metod, som bygger på sfäroid bildandet av PDL celler på Chitosan filmer. Här presenterar vi detaljerade cell sfäroid kultur protokoll baserade på Chitosan filmer. 3D-kulturen systemet av PDL cellulära sfäroider övervinna några av de begränsningar som rör konventionella 2D enskiktslager cell kultur, och därmed kan vara lämpliga för att producera PDL celler med en förbättrad terapeutisk effekt för framtida tandlossning vävnad förnyelse.

Med hjälp av det nuvarande protokollet, livskraftiga PDL cell sfäroider bildades framgångs rikt. Figur 1 visade att suspenderade celler eller sfäroider i stället för bifogade celler observerades främst på Chitosan filmer. För sådd tätheten av 0,5 x 104 celler/cm2, bifogade PDL celler hittades ibland på dag 1 och 3, och PDL cell sfäroider observerades sällan. Tvärtom, för sådd densiteter av 3 x 104 och 6 x 10<s...

Watch this Scientific Journal Video about Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films at JoVE.com

Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films

Här presenterar vi protokoll för odling av mänskliga periodontala ligament (PDL) cell sfäroider av Chitosan filmer. Kulturen av tredimensionell (3D) cellulära sfäroider ger ett alternativ till konventionella vävnad kultur polystyren (TCPS) kultur system.

Bildandet av mänskliga parodontala ligament cell Sfäroider på Chitosan Films

Periodontal ligament (PDL) cells hold great promise for periodontal tissue regeneration. Conventionally, PDL cells are cultured on two-dimensional (2D) ...

Detta är ett detaljerat protokoll av odling parodontala ligament cell sfäroider av chitosan filmer. Jämfört med det konventionella kultursystemet producerar sfäroidodlingssystemet parodontala ligamentceller med ökad självförnyelse och osteogena differentieringsförmågor. Till att börja, förbereda 1%vikt-till-volym chitosan lösning enligt anvisningarna i manuskriptet.Tillsätt 0,5 milliliter chitosanlösning i varje brunn av en 24-brunns vävnadskultur polystyrenplatta. Torka plattan i en ugn vid 60 grader Celsius i 24 timmar för att bilda chitosan filmer. För att neutralisera chitosanfilmerna, tillsätt 0,5 milliliter 0,5 normal natriumhydroxid till varje brunn av 24-brunnsplattan och inkubera vid rumstemperatur i två timmar.Sedan tvätta chitosan filmer tre gånger med dubbeldestillerat vatten. Sterilisera den chitosanbelagda 24-brunnsplattan i 70%alkohol över natten vid rumstemperatur. Skölj plattan tre gånger med PBS sedan lämna den under ultraviolett ljus över natten.Före cellsådd, pre-warm proliferation medium, PBS-lösning, och trypsin EDTA lösning till 37 grader Celsius. Kassera supernatanten från cellodlingskolven och tvätta det konfluenta parodontala ligamentet, eller PDL-cellerna, med 10 milliliter PBS. Kassera PBS och tillsätt en milliliter trypsin EDTA-lösning till kolven.Inkubera kolven vid 37 grader Celsius i tre minuter och tillsätt sedan tre milliliter proliferationsmedium för att avsluta trypsin matsmältningen. Överför cellupphängningen till ett koniskt rör på 15 milliliter och centrifug det sedan i fem minuter vid 300 gånger g. Kassera supernatanten och suspendera cellerna på 500 mikroliter av proliferationsmedium.Räkna cellerna med en hemocytometer och så dem på plattan vid fem, 10, 30 och 60 tusen celler per kvadratcentimeter. Odla PDL-cellerna i en inkubator vid 37 grader Celsius i 5%koldioxid och befuktad luft, ändra odlingsmediet två gånger per vecka. Observera cellmorfologi dagligen under fem dagar via ett inverst faskontrastmikroskop.Livskraftiga PDL cell sfäroider är framgångsrikt bildas med hjälp av detta protokoll. Sfäroider observeras sällan för lägre-seeding densitet på dag ett och tre. Men vid de två högre tätheterna är olika storlekar av sfäroider närvarande från dag ett.Den optimala sådddensiteten är 30 tusen celler per centimeter i kvadrat eftersom den resulterar i homogena sfäroider. Efter fem dagar av kultur observeras större sfäroider för alla sådddensiteter. En lönsamhet analys visar att majoriteten av PDL celler lever på dag ett, tre och sex, men antalet döda celler ökar på dag sex.En begränsning av detta protokoll är den minskade spridningen av celler efter sfäroidbildning. Så ytterligare studier för att främja spridningen av celler efter sfäroidbildning krävs.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolering och Kvantitativ Immuncytokemiska karakterisering av primära myogena celler och fibroblaster från Human skelettmuskulatur

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differentiering av en mänsklig Neural Stem Cell Line den Tredimensionell kulturer, Analys av MicroRNA och Förmodade målgenerna

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

A Novel Kultur Modell för Human pluripotenta stamceller Förökning på Gelatin i Placenta konditionerade Media

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Generation av genetiskt modifierade Organotypiska Skin kulturer Använda devitaliserad Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Odling av humana pluripotenta och neurala stamceller i en sluten cellodlingssystem för Basic och preklinisk forskning

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

En RANKL-baserade Osteoclast kultur analys av mus benmärgen att undersöka betydelsen av mTORC1 Osteoclast bildandet

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation analyser att utvärdera bindningen av Drosophila skåran med Trans-ligander och dess hämning av Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

HUVEC rör-bildande analys för att utvärdera effekterna av naturliga produkter på angiogenes

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effektiv differentiering av humana pluripotenta stamceller till leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Hemogena omprogrammering av humana fibroblaster genom påtvingat uttryck av transkriptionsfaktorer

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...