Name: formation of human periodontal ligament cell spheroids on chitosan films
Uploaded: 2019-06-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films at JoVE.com

Bu çalışmada Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (NSFC 81700978), orta üniversiteler için temel araştırma fonları (1504219050), Şangay doğal Bilim Vakfı (17ZR1432800) ve Şangay Medikal keşif projesi ( 17411972600).

Çalışma protokolü, Tongji Üniversitesi, okul ve Stomatoloji Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Tüm hastalar yazılı bilgilendirilmiş onay sağladı.
1. PDL hücre yalıtımı
<ol><li>PDL hücrelerinin kültürü için proliferasyon ortamı yapın: α-MEM orta% 10 FCS ve 100 U/mL kalem/strep ile desteklenmektedir.</li>
	<li>İzole üçüncü Molars aktarmak için buz ile bir kap hazırlayın.</li>
	<li>Cerrahi aletleri otoklav kullanarak sterilize edin.</li>
	<li>Ok...

<ol>
	<li>Albandar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+of+periodontal+diseases.">Epidemiology and risk factors of periodontal diseases.</a> Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).</li><li>Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering:+a+new+paradigm+for+periodontal+regeneration+based+on+molecular+and+cell+biology.">Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology.</a> Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).</li><li>Chen, F. M., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodontal+tissue+engineering+and+regeneration:+current+approaches+and+expanding+opportunities.">Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities.</a> Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).</li><li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+periodontal+tissue+regeneration+by+periodontal+cell+implantation.">Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation.</a> Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).</li><li>Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Based+Approaches+in+Periodontal+Regeneration:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Periodontal+Defect+Models+in+Animal+Experimental+Work.">Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work.</a> Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).</li><li>Itaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+changes+of+periodontal+ligament-derived+cells+during+passage.">Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage.</a> Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).</li><li>Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+engineered+tendon+matrix+in+the+stemness+of+tendon+stem+cells+in+vitro+and+the+promotion+of+tendon-like+tissue+formation+in+vivo.">The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo.</a> Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).</li><li>Elliott, N. T., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+three-dimensional+in+vitro+tissue+models+for+drug+discovery+and+transport+studies.">A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).</li><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities.">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li><li>Yeh, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+with+injectable+cell+sheet+fragments+of+human+amniotic+fluid+stem+cells+in+an+immune-suppressed+rat+model.">Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model.</a> Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).</li><li>Kabiri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+mesenchymal+stem/stromal+cell+osteogenesis+and+autocrine+signalling.">3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).</li><li>Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Duration+Three-Dimensional+Spheroid+Culture+Promotes+Angiogenic.">Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic.</a> Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules &amp; therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).</li><li>Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+formation+and+stemness+preservation+of+human+periodontal+ligament+cells+on+chitosan+films.">Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films.</a> Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).</li><li>Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+a+three-dimensional,+microarray+environment+on+human+Cell+culture+in+drug+screening+systems.">Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems.</a> Biomaterials. , (2012).</li><li>LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors.">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).</li><li>Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compaction,+fusion,+and+functional+activation+of+three-dimensional+human+mesenchymal+stem+cell+aggregate.">Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate.</a> Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).</li><li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 9176357 (2016).</li><li>Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+spheroid+culture+to+human+hepatocytes+and+maintenance+of+their+differentiation.">Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation.</a> Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).</li><li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+injectable+spherically+symmetric+cell+aggregates+self-assembled+in+a+thermo-responsive+hydrogel+for+enhanced+cell+transplantation.">The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation.</a> Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).</li><li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential.">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+spheroid+culture+system+on+micropatterned+substrates+for+improved+differentiation+efficiency+of+multipotent+mesenchymal+stem+cells.">3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).</li><li>Miyagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfabricated+scaffold+induces+the+spheroid+formation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+progenitor+cells+and+promotes+efficient+adipogenic+differentiation.">A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).</li><li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties.">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li><li>Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+culture+of+mesenchymal+stem+cell+spheroids+in+suspension+preserves+multilineage+potential.">Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential.</a> Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).</li><li>Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan+as+antimicrobial+agent:+applications+and+mode+of+action.">Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action.</a> Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).</li></ol>

Bu çalışmada, geleneksel 2D Tek tabakalı hücre kültürü ile ilgili bazı sınırlamalar aşmak için bir 3D hücre kültür sistemi tanıttı. Protokole göre PDL hücresel kürüler, kitosan filmlerinde kültür hücreleri tarafından başarıyla oluşturuldu. Önceki çalışmamızda, küresel oluşumunun PDL hücrelerinin Self-yenilenme ve osteogenik farklılaşma kapasitelerinin artması bildirildi14. TCPs gelen hücreler hasat için bir enzim kullanmak yerine, PDL hücre küreler sadec...

Periodontitis, esas olarak dental plak1ile başlatılan, periodontal bağ (PDL), alveoler kemik ve Periodontitis için mevcut tedaviler genellikle aktif hastalığın ilerlemesini önlemede başarılı olmaktadır, ancak kayıp periodontal dokularda rejenerasyon klinik bir zorluk olarak kalır. Son zamanlarda, periodontal doku rejenerasyonu için hücre tabanlı yaklaşımlar mevcut tedaviler2,3,4dezavantajları aşmak için önemli ilerleme yapılmıştır.
Önceki sistematik incelememiz, PDL hücrelerinin periodontal rejenerasyon için büyük bir potansiyel gösterdiğini göstermiştir5. Geleneksel olarak, PDL hücreleri doku kültürü Polistiren (TCPS) gibi iki boyutlu (2D) substratlar üzerinde kültürlü. Ancak, In vitro Culture6sırasında PDL hücrelerinin karakteristik değişiklikleri gözlenmiştir. Bu fenomen muhtemelen 2D TCPs in vivo üç boyutlu (3D) mikro7farklıdır çünkü. 2B substratlar üzerinde kültürlü hücrelere kıyasla, bir 3D mikroortamda yetiştirilen hücreler in vivo hücrelere daha fazla benzerlik sergiler8. Bu nedenle, 3D hücre kültürü modelleri geleneksel 2D Tek tabakalı hücre kültürü için umut verici bir alternatif sağlar.
Konvansiyonel 3D kültür yöntemi hücreleri 3D Biyomalzemeler kapsüller. 3D biyomalzemelerde kapsüllenmiş hücreler ile karşılaştırıldığında, hücresel küreler daha yakından In vivo durumu taklit, çünkü kürüler yabancı maddelerin ücretsiz büyüyen hücrelerin toplamları vardır9,10,11, 12. hücresel KÜRLERIN msc biyofaaliyetlerini fibronektin ve laminin13dahil olmak üzere, ekstrasellüler matriks (ECM) bileşenlerinin korunması yoluyla tanıtılmasıdır. Geleneksel PDL hücre kültürü modellerini geliştirmek için, son zamanlarda kitosan filmler14PDL hücrelerinin küroid oluşumuna dayalı BIR 3D PDL hücre kültürü yöntemi geliştirdik. Küroid oluşumu PDL hücrelerinin Self-yenilenme ve osteogenik farklılaşma kapasitelerini artırmıştır14. Burada, kitosan filmlerine dayanan ayrıntılı PDL hücre kürü kültür protokolleri sunuyoruz. PDL hücresel kürenin 3D kültür sistemi, geleneksel TCPS hücre kültürüyle ilgili eksikliklerin bazılarını aşmak ve böylece gelecekteki periodontal doku rejenerasyonu için gelişmiş bir terapötik etkinliğine sahip PDL hücrelerini üretmek için uygun olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:718px;" width="718">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">&#945;-MEM</td>
			<td style="width:158px;">Gibco</td>
			<td style="width:166px;">11900-073</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">acetic acid&#160;</td>
			<td style="width:158px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">64197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell culture flask 25 cm2</td>
			<td style="width:158px;">Corning</td>
			<td style="width:166px;">430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell culture flask 75 cm2</td>
			<td style="width:158px;">Corning</td>
			<td style="width:166px;">430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:223px;">Chitosan</td>
			<td style="width:158px;">Heppe Medical&#160;Chitosan GmbH</td>
			<td style="width:166px;">/</td>
			<td>molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FCS</td>
			<td style="width:158px;">Gibco</td>
			<td style="width:166px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td style="width:158px;">Molecular&#160;Probes</td>
			<td style="width:166px;">L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaOH</td>
			<td style="width:158px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">1310732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">PBS</td>
			<td>KeyGen Biotech&#160;</td>
			<td style="width:166px;">KGB5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">pen/strep</td>
			<td style="width:158px;">Gibco</td>
			<td style="width:166px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Trypsin/EDTA&#160;</td>
			<td>KeyGen Biotech&#160;</td>
			<td style="width:166px;">KGM25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:158px;">Corning</td>
			<td style="width:166px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">24-well plate</td>
			<td style="width:158px;">Corning</td>
			<td style="width:166px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formation of human periodontal ligament cell spheroids on chitosan films

Periodontal bağ (PDL) hücreleri periodontal doku rejenerasyonu için büyük söz tutun. Geleneksel olarak, PDL hücreleri doku kültürü Polistiren (TCPS) gibi iki boyutlu (2D) substratlar üzerinde kültürlü. Ancak, In vitro kültürü sırasında PDL hücrelerinin karakteristik değişiklikleri gözlenmiştir. Bu fenomen muhtemelen 2D TCPS in vivo üç boyutlu (3D) mikroortamdan farklıdır çünkü. 2B substratlar üzerinde kültürlü hücrelere kıyasla, bir 3D mikroortamda yetiştirilen hücreler in vivo hücrelere daha fazla benzerlik sergiler. Bu nedenle, 3D hücre kültürü modelleri geleneksel 2D Tek tabakalı hücre kültürü için umut verici bir alternatif sağlar. Geleneksel PDL hücre kültürü modellerini geliştirmek için, son zamanlarda kitosan filmleri üzerinde PDL hücrelerinin küroid oluşumuna dayanan bir 3D hücre kültürü yöntemi geliştirdik. Burada, kitosan filmlerine dayanan detaylı hücre kürü kültürü protokolleri sunuyoruz. PDL hücresel kürenin 3D kültür sistemi, geleneksel 2D Tek tabakalı hücre kültürüyle ilgili bazı sınırlamaların üstesinden gelmekte ve böylece gelecekteki periodontal doku rejenerasyonu için gelişmiş bir terapötik etkinliğine sahip PDL hücrelerini üretmek için uygun olabilir.

Mevcut protokol kullanılarak, uygulanabilir PDL hücre kürleri başarıyla oluşturuldu. Şekil 1 , bağlı hücreler yerine askıya alınan hücrelerin veya kürlerin çoğunlukla kitosan filmlerinde gözlemlendiği görülmüştür. 0,5 x 104 hücreli/cm2' nin tohumlama yoğunluğu için, ekli PDL hücreleri bazen 1 ve 3 gün bulundu ve PDL hücre kürleri nadiren gözlenen. Aksine, 3 x 104 ve 6 x 104 hücreli/c...

Watch this Scientific Journal Video about Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films at JoVE.com

Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films

Burada, insan periodontal bağ (PDL) hücre kürleri tarafından kitosan filmleri ile ilgili protokoller sunuyoruz. Üç boyutlu (3D) hücresel küreler kültürü geleneksel doku kültürü Polistiren (TCPS) kültür sistemine bir alternatif sağlar.

Kitosan filmlerde ınsan periodontal ligament hücre kürleri oluşumu

Periodontal ligament (PDL) cells hold great promise for periodontal tissue regeneration. Conventionally, PDL cells are cultured on two-dimensional (2D) ...

Bu, chitosan filmlerinin periodontal ligament hücre sferoidlerinin kültürlenmesinin ayrıntılı bir protokolüdür. Konvansiyonel kültür sistemi ile karşılaştırıldığında, küresel kültür sistemi artmış kendini yenileme ve osteojenik farklılaşma yetenekleri ile periodontal ligament hücreleri üretir. Başlamak için, el yazmasında belirtildiği gibi %1 ağırlık-to-volume chitosan çözeltisi hazırlayın.24 kuyulu doku kültürü polistiren plakanın her kuyuya 0,5 mililitre chitosan çözeltisi ekleyin. Chitosan filmleri oluşturmak için plakayı 60 derecede 24 saat boyunca fırında kurutun. Chitosan filmlerini nötralize etmek için, 24 kuyulu plakanın her kuyusuna 0,5 mililitre normal sodyum hidroksit ekleyin ve iki saat boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.Daha sonra chitosan filmlerini üç kez çift distile suyla yıkayın. Chitosan kaplı 24 kuyulu tabağı oda sıcaklığında bir gecede %70 alkolle sterilize edin. Plakayı PBS ile üç kez durulayın ve bir gecede ultraviyole ışık altında bırakın.Hücre tohumlama önce, pre-Sıcak proliferasyon orta, PBS çözeltisi, ve 37 santigrat derece trypsin EDTA çözeltisi. Hücre kültürü şişesinden supernatant atın ve pbs 10 mililitre ile, confluent periodontal ligament veya PDL hücreleri yıkayın. PBS atın ve şişeye bir mililitre tripsin EDTA çözeltisi ekleyin.Şişeyi 37 santigrat derecede üç dakika kuluçkaya yatırın ve tripsin sindirimini sonlandırmak için üç mililitre proliferasyon ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonuna 15 mililitrelik konik bir tüp aktarın ve sonra 300 kez g beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve çoğalma orta 500 mikrolitre hücreleri yeniden askıya.Bir hemositometre ile hücreleri saymak ve santimetre kare başına beş, 10, 30 ve 60 bin hücre plaka üzerine tohum. Kültür pdl hücreleri bir kuvöz de 37 santigrat santigrat 5% karbondioksit ve nemlendirilmiş hava, haftada iki kez kültür ortamı değişen. Ters faz kontrast mikroskobu ile beş gün boyunca günlük hücre morfolojisini gözlemleyin.Canlı PDL hücre spheroidleri bu protokol kullanılarak başarıyla oluşturulur. Spheroidler nadiren birinci ve üçüncü günlerde alt tohumlama yoğunluğu için gözlenir. Ama iki yüksek yoğunlukta, ilk günden itibaren çeşitli boyutlarda küresel ler bulunur.Homojen küresel balıklarla sonuçlandığı için en uygun tohumlama yoğunluğu santimetre karebaşına 30 bin hücredir. Kültür beş gün sonra, büyük küresel ler tüm tohumlama yoğunlukları için gözlenmektedir. Canlılık telbette, PDL hücrelerinin çoğunun birinci, üçüncü ve altıncı günlerde canlı olduğunu gösterir, ancak ölü hücre sayısı altıncı günde artar.Bu protokolün bir sınırlama küresel oluşumu ndan sonra hücrelerin çoğalması azalmış olmasıdır. Bu nedenle, küresel oluşumdan sonra hücrelerin çoğalmasını teşvik etmek için daha ileri çalışmalar yapılması gerekmektedir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Üç Boyutlu Kültürleri, mıkroRNA Analizi ve Putatif Hedef Genler üzerinde bir İnsan Sinir Kök Hücre Hattı Farklılaşma

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

A Novel Kültür Modeli İnsan Pluripotent için Plasenta klimalı Medyada Jelatin üzerinde hücre çoğalma Kök

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Temel ve Klinik öncesi Araştırma bir Kapalı Hücre Kültürü Sistemi İnsan Pluripotent ve Sinir Kök Hücre Kültürleme

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Bir RANKL tabanlı Osteoklast kültür tahlil, fare mTORC1 Osteoklast oluşumunda rol araştırmak için ilik

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

HUVEC tüp-formasyon assay doğal ürünlerin anjiyogenezi üzerinde etkisini değerlendirmek için

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Insan pluripotent kök hücrelerinin karaciğer hücrelerine verimli farklılaşma

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Transkripsiyon Faktörlerinin Zorunlu İfadesi Ile İnsan Fibroblastlarının Hemojenik Yeniden Programlanması

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...