Name: antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis at JoVE.com

ويود المؤلفان أن يشكرا الدكتور تورجا كانتي ديبناث على مساعدته في شركة ChemDraw. ويدعم البحوث في مختبر Xhemalçe من قبل وزارة الدفاع - برنامج البحوث الطبية الموجهة من الكونغرس - جائزة اختراق سرطان الثدي (W81XWH-16-1-0352)، NIH منحة R01 GM127802 والأموال الناشئة من معهد الخلوية والخلوية البيولوجيا الجزيئية وكلية العلوم الطبيعية في جامعة تكساس في أوستن، الولايات المتحدة الأمريكية.

1. في المختبر النسخ وتنقية هلام من RNA الهدف
<ol><li>استنساخ تسلسل الاهتمام في بلازميدات تحتوي على T7 و /أو SP6 المروجين باستخدام تقنيات الاستنساخ الجزيئي المعمول بها12 أو مجموعات.</li>
	<li>خطية قالب الحمض النووي للنسخ في المختبر
	<ol>
<li>تضخيم تسلسل الاهتمام من قبل PCR من بلازميد مع...

<ol>
	<li>Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+histones+to+RNA:+role+of+methylation+in+cancer.">From histones to RNA: role of methylation in cancer.</a> Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).</li><li>Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Who+Watches+the+Watchmen:+Roles+of+RNA+Modifications+in+the+RNA+Interference+Pathway.">Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).</li><li>Mauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+methylation+of+m(6)Am+in+the+5'+cap+controls+mRNA+stability.">Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability.</a> Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability.">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li><li>Pendleton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U6+snRNA+m(6)A+Methyltransferase+METTL16+Regulates+SAM+Synthetase+Intron+Retention.">The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention.</a> Cell. 169 (5), 824-835 (2017).</li><li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'+UTR+m(6)A+Promotes+Cap-Independent+Translation.">5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation.</a> Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(6)-methyladenosine+Modulates+Messenger+RNA+Translation+Efficiency.">N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency.</a> Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).</li><li>Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine+marks+primary+microRNAs+for+processing.">N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing.</a> Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).</li><li>Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RNA+methyltransferase+BCDIN3D+regulates+microRNA+processing.">Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing.</a> Cell. 151 (2), 278-288 (2012).</li><li>Jeronimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+the+protein+interaction+network+for+the+human+transcription+machinery+reveals+the+identity+of+the+7SK+capping+enzyme.">Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme.</a> Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brd4+and+JMJD6-associated+anti-pause+enhancers+in+regulation+of+transcriptional+pause+release.">Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release.</a> Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visual Experimentation. , (2019).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).</li><li>Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+strand+switching+by+T7+RNA+polymerase.">Template strand switching by T7 RNA polymerase.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+active+recombinant+T7+RNA+polymerase+from+E.+coli.">Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).</li><li>Shelton, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+RNA+Methylation+and+Histone-Binding+Activities+of+MePCE+Regulates+P-TEFb+Activation+on+Chromatin.">Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin.</a> Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).</li><li>Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+plasmids+for+producing+RNA+in+vitro+transcripts+with+homogeneous+ends.">General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends.</a> Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).</li><li>Blazer, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Suite+of+Biochemical+Assays+for+Screening+RNA+Methyltransferase+BCDIN3D.">A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D.</a> SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).</li><li>Arango, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+Promotes+Translation+Efficiency.">Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.</a> Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NAT10+is+an+ATP-dependent+RNA+acetyltransferase+responsible+for+N4-acetylcytidine+formation+in+18+S+ribosomal+RNA+(rRNA).">Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).</li></ol>

هنا، يتم الإبلاغ عن طريقة بسيطة وقوية للتحقق في المختبر من نشاط الحمض النووي الريبي ميثيل ترانسفيراز نحو نسخ محددة. ويستفيد الفحص من حقيقة أن الميثيونين S-adenosyl يمكن أن يكون tritiated على المانحة مجموعة الميثيل (الشكل1)،مما يسمح لRNA ميثيلات إلى الكشف بدقة دون استخدام الأجسام الم?...

الحمض النووي، الحمض النووي الريبي والبروتينات تخضع للتعديلات التي تنظم بإحكام التعبير الجيني1. ومن بين هذه التعديلات، تحدث المثيلة على جميع البوليمرات الحيوية الثلاثة. وقد تم دراسة الحمض النووي والبروتين الميثيل بشكل جيد جدا خلال العقود الثلاثة الماضية. وعلى النقيض من ذلك، لم يتجدد الاهتمام بمثيلة الحمض النووي الريبي إلا مؤخراً في ضوءالأدوار الهامة التي تلعبها البروتينات التي تكتب أو تمحو أو تربط المثيلة في التنمية والمرض 2. بالإضافة إلى وظائف معروفة في ribosomal وفيرة ونقل RNAs، مسارات مثيلة RNA تنظيم محددة رسول RNA الاستقرار3،4، الربط5 والترجمة6،7، ميرنامعالجة 8،9 والتوقف النسخي والإفراج 10،11.
هنا، يتم الإبلاغ عن طريقة بسيطة وقوية للتحقق في المختبر من نشاط الحمض النووي الريبي ميثيل ترانسفيراز في إعداد مختبر البيولوجيا الجزيئية (ملخصة في الشكل1). كثير دراسات يقيّم النشاط من [رنا] [مثلترانسفيرس] كلّيّا [دوت-بلووت] مع جسم مضادّ ضدّ ال [رنا] تعديل الفائدة. ومع ذلك، لا تحقق نقطة وصمة عار من سلامة الحمض النووي الريبي عند الحضانة مع الحمض النووي الريبي methyltransferase. وهذا أمر مهم لأنه حتى التلوث الطفيف للبروتينات المؤتلفة مع النوكلورات يمكن أن يؤدي إلى تدهور جزئي للRNA ونتائج مربكة. وعلاوة على ذلك، حتى الأجسام المضادة تعديل RNA محددة للغاية يمكن التعرف على RNAs غير معدلة مع تسلسلات محددة أو هياكل. في المختبر الحمض النووي الريبي ميثيل ترانسفيراز الفحص ذكرت هنا يستفيد من حقيقة أن الميثيونين S-adenosyl يمكن أن تكون tritiated على المانحة مجموعة الميثيل (الشكل1)،مما يسمح لRNA ميثيلات إلى الكشف بدقة دون استخدام الأجسام المضادة . يتم توفير التعليمات للنسخ في المختبر وتنقية نسخة من الاهتمام واختبار مثيلة من النص المذكور من قبل إنزيم الفائدة. هذه الطريقة مرنة وقوية، ويمكن تعديلها وفقا لاحتياجات أي مشروع معين. على سبيل المثال، في المختبر منقولة ونقية RNAs، توليفها كيميائيا RNAs، ولكن أيضا RNAs الخلوية يمكن استخدامها. يوفر هذا التحليل معلومات كمية في شكل حساب التلألؤ، فضلا عن المعلومات النوعية من خلال إظهار المكان الذي يعمل فيه الحمض النووي الريبي المثيلي على هلام. وهذا يمكن أن يوفر رؤية فريدة من نوعها في وظيفة ميثيل ترانسفيراز RNA، لا سيما عند استخدام RNAs الخلوية كالركيزة، كما أنه يوفر طريقة لمراقبة مباشرة حجم RNA أو RNAs التي تستهدف الميثيل.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="851">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10821-015</td>
			<td style="width:353px;">10 bp DNA Ladder kit.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10% Ammonium Persulfate (APS)&#160;</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 &#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">10X TBE Buffer</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22&#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">10X TBS</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">BP1408-1</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H])</td>
			<td style="width:121px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:161px;">NET155V250UC</td>
			<td style="width:353px;">For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= 
			(1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 &#181;M.&#160;&#160; Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4&#176;C, make 20 &#181;L aliquots, and freeze them at -30&#176;C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">RPN11649</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amersham Hyperfilm MP</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">28906846</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beckman Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS6500</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704466</td>
			<td style="width:353px;">Mini Horizontal Electrophoresis System.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:121px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:161px;">4693159001</td>
			<td style="width:353px;">For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion Cell</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">345-9902</td>
			<td>RNase free empty cassette for polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion empty Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1656001</td>
			<td>Vertical midi-format electrophoresis cell.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer</td>
			<td style="width:121px;">DeNovix</td>
			<td style="width:161px;">DS-11-S</td>
			<td style="width:353px;">Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ecoscint Original</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td style="width:161px;">LS-271</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">03-337-1</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer</td>
			<td style="width:121px;">RPI CORP</td>
			<td style="width:161px;">112600</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel pretreatment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel dryer</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1651745</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Gel Loading Buffer II</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM8547</td>
			<td style="width:353px;">For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneCatcher disposable gel excision tips</td>
			<td style="width:121px;">Gel Company</td>
			<td style="width:161px;">NC9431993</td>
			<td>For removing bands from agarose and polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Megascript Kit</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM1333</td>
			<td>For in vitro transcription with T7 RNA polymerase.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Perfectwestern Extralarge Container</td>
			<td style="width:121px;">Genhunter Corporation</td>
			<td style="width:161px;">NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black)</td>
			<td>Gel staining box.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pRZ</td>
			<td style="width:121px;">Addgene</td>
			<td style="width:161px;">#27663</td>
			<td style="width:353px;">Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">74204</td>
			<td style="width:353px;">For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">28704</td>
			<td style="width:353px;">Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Saran Premium Plastic Wrap</td>
			<td style="width:121px;">Saran Wrap</td>
			<td style="width:161px;">Amazon</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Gold</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S11494</td>
			<td>Ultra sensitive nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TE</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">93283-100ML</td>
			<td>10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TEMED</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">110-18-9</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5382000023/5361000038</td>
			<td style="width:353px;">For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td style="width:121px;">life technologies</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:353px;">Kits for fast cloning of Taq polymerase&#8211;amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TURBO DNase (2 U&#8260;&#181;L)</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM2238</td>
			<td>For DNA removal from in vitro transcription reactions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">51456-500G</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Whatman 3MM paper</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">3030-154</td>
			<td style="width:353px;">Chromatography paper for drying gel.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis

هناك أكثر من 100 تعديلات متميزة كيميائيا من الحمض النووي الريبي، ثلثيها تتكون من ميثيلات. وقد ظهر الاهتمام بتعديلات الحمض النووي الريبي، وخاصة المثيلية، مرة أخرى بسبب الأدوار الهامة التي تقوم بها الإنزيمات التي تكتب وتمحوها في العمليات البيولوجية ذات الصلة بالمرض والسرطان. هنا، يتم توفير تحليل حساس في المختبر لتحليل دقيق لنشاط كاتب مثيلالحمض النووي الريبي على RNAs الاصطناعية أو في المختبر المنقولة. يستخدم هذا الاختبار شكل ثلاثي الجوانب من S-adenosyl-methionine، مما يؤدي إلى وضع العلامات المباشرة على الحمض النووي الريبي الميثيلي مع التريتيوم. الطاقة المنخفضة من إشعاع التريتيوم يجعل الأسلوب آمن، والأساليب الموجودة من قبل من تضخيم إشارة التريتيوم، تجعل من الممكن لتحديد وتصور الحمض النووي الريبي الميثيلي دون استخدام الأجسام المضادة، والتي هي عادة عرضة للقطع الأثرية. في حين أن هذه الطريقة مكتوبة لمثيلة الحمض النووي الريبي، عدد قليل من القرص جعله ينطبق على دراسة التعديلات الحمض النووي الريبي الأخرى التي يمكن وصفها إشعاعيا، مثل أسيتيل الحمض النووي الريبي مع 14C أسيتيل الإنزيم A. عموما، وهذا الفحص يسمح لتقييم بسرعة RNA شروط المثيلة، تثبيط مع مثبطات جزيء صغير، أو تأثير RNA أو متحولة الإنزيم، ويوفر أداة قوية للتحقق من صحة وتوسيع النتائج التي تم الحصول عليها في الخلايا.

رد فعل النسخ في المختبر الشكل 2 يمثّل [ا] شوط نموذجيّة من [إينترو فيترو] نسخ ردّ فعل مع ال [ت7] [رنا] [بولمرس] من ال [7سك] [سنرنا], أيّ يكون نسبيّا قصيرة (331 [نت]) وجدّا ينظّم [رنا]. كما هو مبين في تلك الصورة الخام، هناك العديد من العصابات غير المرغوب فيها، على حد سو?...

Watch this Scientific Journal Video about Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis at JoVE.com

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

هنا، يتم وصف فحص الأجسام المضادة الخالية في المختبر للتحليل المباشر لنشاط ميثيل ترانسفيراز على الحمض النووي الريبي الاصطناعية أو في المختبر.

فحص الأجسام المضادة الحرة لتحليل نشاط الحمض النووي الريبي ميثيل ترانسفيراز

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

هناك أكثر من 100 تعديل متميز للرنا، ثلثاها ميثيلات. يوفر هذا البروتوكول طريقة لتحليل حساس ودقيق لنشاط كاتب الميثيل RNA. هذه التقنية سهلة الاستخدام تسمح لنا بتحديد وقياس الحمض النووي الريبي الميثيلي دون استخدام الأجسام المضادة، التي عادة ما تكون عرضة للتحف.(إنّها ستُظهر الإجراء ستكون (سامانثا شيلتون طالبة خرّج من مختبري لبدء هذا الإجراء، قم بإعداد مقايسة RNA ميثيلtransferase ذات 100 ميكرولتر في أنبوب 1.5 ملليلتر على الجليد، كما هو مبين في بروتوكول النص. دوامة أنبوب لخلط دقيق، والطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة خمس ثوان لجمع الحل في الجزء السفلي من الأنبوب.احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. ثم، قم بتنظيف التفاعل باستخدام تنقية العمود، كما هو موضح في بروتوكول النص. لإجراء عدد التلألؤ السائل، قم بإعداد رف العد المتألق مع قارورة واحدة لكل عينة، وقارورة واحدة لقياس الخلفية، وقارورة واحدة لاختبار السحب.ملء قوارير مع خمسة ملليلتر من التلألؤ عد الحل. إضافة 10 ميكرولترات من كل عينة الحمض النووي الريبي المشعة في قارورة واحدة. شد الغطاء، واخلطه بلطف.لتحضير قارورة الاختبار، فرك مسحات القطن بدقة على جميع الأسطح والمعدات المستخدمة أثناء الإجراء. إضافة هذه المسحات إلى قوارير مليئة حل التلألؤ، وتشديد الغطاء. لتشغيل العينات على عداد التلألؤ، افتح غطاء مضادة، أدخل الحامل في الجهاز، واغلق غطاء المحرك.حدد عد حامل مفرد. اختر تحديد برنامج المستخدم. حدد أو أنشئ برنامجًا يقيس التريتيوم لمدة 60 ثانية، واضرب رف العد.كرر العد التلألؤ ثلاث مرات. بعد ذلك، أعد وإعادة تشغيل هلام بولي أكريلاميد اليوريا، كما هو مبين في بروتوكول النص. نقل 20 ميكرولترات من مادة الحمض النووي الريبي المشعة إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر يحتوي على 20 ميكرولترات من 2X هلام تحميل العازلة.بعد إعداد السلم، احتضان العينات في 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. غسل آبار هلام مرة أخرى على الفور قبل تحميل العينة عن طريق الأنابيب العازلة من خزانات هلام إلى أسفل في آبار الجل. ثم، تحميل 20 ميكرولترات من سلم المعدة، 20 ميكرولترات من العينات، و 20 ميكرولترات من 1X هلام تحميل العازلة في الممرات من هلام.تشغيل الجل في 100 فولت لمدة 60 إلى 180 دقيقة، اعتمادا على نسبة البولي أكريلاميد. بمجرد الانتهاء من تشغيل الجل ، قم بإزالة الجل من الكاسيت وضعه في صندوق يحتوي على 50 ملليلتر من 1X TBE buffer مع خمسة ميكرولترات من وصمة هلام حمض نووي شديدة الحساسية. احتضان على الروك لمدة خمس دقائق لطخة الجيش الملكي النيبالي.بعد هذا، بعناية تأخذ هلام من منطقة الجزاء، ووضعها على transilluminator الأشعة فوق البنفسجية من هلام التصوير مع الآبار صعودا وسلم على اليسار. ركّز الكاميرا على الجل، واشعل ضوء الأشعة فوق البنفسجية، واصطُل صورة للهلام. ثم، إيقاف التعرض للأشعة فوق البنفسجية، وحفظ الصورة كملف TIFF.وضع هلام مرة أخرى في منطقة الجزاء، وإزالة TBE، وإصلاح هلام مع 50 ملليلتر من حل إصلاح على الروك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بتحريك الجل بلطف إلى صندوق أسود جديد يحتوي على 25 ملليلتر من محلول تعزيز التصوير التلقائي. احتضان على الروك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.رفع بلطف هلام، ووضعها وجها إلى أسفل على ورقة من البلاستيك التفاف مع الآبار صعودا وسلم على الجانب الأيمن. ضع ورقتين من ورق الكروماتوغرافيا على الجزء الخلفي من الجل، وقلب المكدس بأكمله. قبل تسخين مجفف هلام إلى 80 درجة مئوية.نقل الغطاء البلاستيكي على مجفف هلام مرة أخرى. إدراج المكدس بأكمله تحت الغطاء البلاستيكي، ونقل الغطاء البلاستيكي إلى أسفل لإنشاء ختم. جفف الجل عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.ثم، إيقاف المجفف هلام، وإزالة المكدس بلطف. قم بإزالة ورق اللتفاف وورق اللوني الثاني. الشريط ورقة الكروماتوغرافيا المتبقية مع هلام المجففة في شريط فيديو تلقائي.في غرفة مظلمة، إضافة ورقة واحدة من فيلم التصوير الذاتي. تخزين الكاسيت في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية، وتطوير الفيلم في الوقت المناسب، اعتمادا على كثافة الإشارة. بمجرد تطوير الفيلم، وضعه على رأس الكاسيت واستخدام علامة مختبر لوضع علامة بعناية على أربعة حواف من هلام، كل بئر، وموقف الأصباغ XC وBB.مسح الفيلم بدقة 300 أو 600 بكسل في البوصة، وحفظ الصورة كملف TIFF. في هذه الدراسة، هو واضح فحص خالية من الأجسام المضادة لتحليل نشاط الحمض النووي الريبي ميثيلtransferase. وهناك تشغيل نموذجي من رد فعل النسخ في المختبر مع البوليميراز T7 RNA من 7SK الحمض النووي الصغير يظهر الجيش الملكي النيبالي قصيرة نسبيا وعالية الهيكلة.هناك عدة نطاقات غير مرغوب فيها، سواء أقصر أو أطول من 7SK، ربما ينتج عن بدء النسخ أو إنهاء الأحداث العشوائية. وبسبب هذا، تنقية هلام بعد رد فعل النسخ في المختبر المهم للحصول على عينة RNA نظيفة. عند هذه النقطة، يمكن تحديد الجيش الملكي النيبالي من الفائدة من موقعها بالنسبة إلى سلم وتنقيتها تنقية هلام.يظهر هنا تحليل ميثيل ترانسفيراز RNA ممثل باستخدام الحد الأدنى من الحمض النووي الريبي الموصى به وتركيزات البروتين. هذا الفحص يسمح لكل من النتائج الكمية من التهم التلألؤ، فضلا عن النتائج النوعية من autoradiogram. هنا، يظهر ميثيل RNA ميثيل ترانسفيراز المعروف لميثيلات 7SK لتكون قادرة على ميثيلات U6 أيضا. وعلاوة على ذلك، كما هو مبين مؤخرا ل7SK، ربط هيستون H4 إلى MePCE يمنع أيضا ميثيل U6.ويمكن ملاحظة ذلك في كل من عدد التلألؤ وraradiogram، مما يدل على قوة هذا البروتوكول. رنا عرضة للتدهور، لذا يرجى التأكد من استخدام الكواشف الخالية من RNase وتنظيف جميع الأسطح والمعدات بشكل شامل. يمكن استخدام الحمض النووي الريبي المسمى بالإشعاع الذي تم الحصول عليه من مقايسة الميثيل ترانسفيراز هذه مباشرة لتقييم نشاط الحمض النووي الريبي أو نشاط الربط الحمض النووي الريبي بواسطة مقايسة تحول الحركة الكهربائية، على سبيل المثال.هذه الطريقة تسمح للباحثين لاختبار تأثير عوامل مختلفة على نشاط الحمض النووي الريبي ميثيلtransferase، بما في ذلك الطفرات نقطة وعلاجات مثبطات الجزيء الصغيرة. وتستخدم هذه الطريقة مواد مشعة، لذا تأكد من ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، وأن تكون حذراً أثناء مناولة المواد المشعة والتخلص منها.

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

رسم الخرائط التفاعلات رنا-رنا على الصعيد العالمي باستخدام السورالين البيروكسيديز

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

تحليل Transcriptomic من<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; ايليجانس</em&gt; RNA تسلسل البيانات من خلال جناح سهرة على مشروع غالاكسي

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

كشف شبه كمي النشاط المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الحمض النووي الريبي للبروتين البشري Telomerase المنتسخة العكسية

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

الجيش الملكي النيبالي المنسدلة الإجراء لتحديد أهداف الجيش الملكي النيبالي للجيش الملكي النيبالي منذ فترة طويلة غير الترميز

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

الكشف عن حالة نادرة باستخدام الحمض النووي لتصحيح الخطأ وتسلسل الحمض النووي الريبي

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

التحليل الكمي للربط مرناً قبل البديلة في أقسام الدماغ الماوس باستخدام الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين المقايسة

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae الأيضية وسم مع 4-ثيوراسيل والتحديد الكمي حديثا توليفها مرناً كوكيل للنشاط الثاني رنا بوليميراز

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

كريسبر دليل الحمض النووي الريبي استنساخ الثدييات بالأنظمة

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

الاصطناعي RNA بولميراز الثاني استطالة المجمعات لتشريح شارك في النسخ RNA معالجة الأحداث

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

اختبار لتحديد كمية البروتين-RNA الربط في البكتيريا

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...