Name: antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis at JoVE.com

De auteurs willen Dr. Turja Kanti Debnath bedanken voor zijn hulp bij ChemDraw. Onderzoek in de Xhemalçe Lab wordt ondersteund door het ministerie van defensie-Congressionally gerichte medisch onderzoekprogramma-Breast Cancer Breakthrough Award (W81XWH-16-1-0352), NIH subsidie R01 GM127802 en start-up fondsen van het Institute of Cellular en Moleculaire biologie en het College voor natuurwetenschappen aan de Universiteit van Texas in Austin, USA.

1. in vitro transcriptie en gel zuivering van het doelwit RNA
<ol><li>Kloon de volgorde van belangstelling in plasmiden met T7 en/of SP6 promoters met behulp van gevestigde moleculaire kloontechnieken12 of Kits.</li>
	<li>Linearisatie van de DNA-template voor in vitro transcriptie
	<ol>
<li>Vergroot de volgorde van belangstelling per PCR van het plasmide met primers die zijn ontworpen om de T7 Promoter regio op te nemen via de insert, + 20-30 BP stroomopwaarts en stroomafwaarts ...

<ol>
	<li>Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+histones+to+RNA:+role+of+methylation+in+cancer.">From histones to RNA: role of methylation in cancer.</a> Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).</li><li>Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Who+Watches+the+Watchmen:+Roles+of+RNA+Modifications+in+the+RNA+Interference+Pathway.">Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).</li><li>Mauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+methylation+of+m(6)Am+in+the+5'+cap+controls+mRNA+stability.">Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability.</a> Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability.">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li><li>Pendleton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U6+snRNA+m(6)A+Methyltransferase+METTL16+Regulates+SAM+Synthetase+Intron+Retention.">The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention.</a> Cell. 169 (5), 824-835 (2017).</li><li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'+UTR+m(6)A+Promotes+Cap-Independent+Translation.">5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation.</a> Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(6)-methyladenosine+Modulates+Messenger+RNA+Translation+Efficiency.">N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency.</a> Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).</li><li>Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine+marks+primary+microRNAs+for+processing.">N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing.</a> Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).</li><li>Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RNA+methyltransferase+BCDIN3D+regulates+microRNA+processing.">Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing.</a> Cell. 151 (2), 278-288 (2012).</li><li>Jeronimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+the+protein+interaction+network+for+the+human+transcription+machinery+reveals+the+identity+of+the+7SK+capping+enzyme.">Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme.</a> Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brd4+and+JMJD6-associated+anti-pause+enhancers+in+regulation+of+transcriptional+pause+release.">Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release.</a> Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visual Experimentation. , (2019).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).</li><li>Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+strand+switching+by+T7+RNA+polymerase.">Template strand switching by T7 RNA polymerase.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+active+recombinant+T7+RNA+polymerase+from+E.+coli.">Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).</li><li>Shelton, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+RNA+Methylation+and+Histone-Binding+Activities+of+MePCE+Regulates+P-TEFb+Activation+on+Chromatin.">Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin.</a> Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).</li><li>Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+plasmids+for+producing+RNA+in+vitro+transcripts+with+homogeneous+ends.">General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends.</a> Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).</li><li>Blazer, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Suite+of+Biochemical+Assays+for+Screening+RNA+Methyltransferase+BCDIN3D.">A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D.</a> SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).</li><li>Arango, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+Promotes+Translation+Efficiency.">Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.</a> Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NAT10+is+an+ATP-dependent+RNA+acetyltransferase+responsible+for+N4-acetylcytidine+formation+in+18+S+ribosomal+RNA+(rRNA).">Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).</li></ol>

Hier wordt een eenvoudige en robuuste methode voor in-vitro verificatie van RNA-methyltransferase activiteit naar specifieke transcripten gerapporteerd. De assay maakt gebruik van het feit dat S-adenosyl methionine kan worden getritiseerd op de methylgroep donor (Figuur 1), waardoor het gemethyleerd RNA nauwkeurig wordt gedetecteerd zonder het gebruik van antilichamen. Het is echter belangrijk op te merken dat deze bepaling niet kan aangeven welke residu of chemische groep door het enzym wor...

DNA, RNA en eiwitten zijn onderhevig aan modificaties die genexpressie1strak reguleren. Onder deze wijzigingen, en optreden op alle drie biopolymeren. DNA-en eiwithoudende methylaties zijn in de afgelopen drie decennia zeer goed bestudeerd. Daarentegen is de interesse in RNA-methylatie pas recentelijk geregend in het licht van de belangrijke rollen die eiwitten die het schrijven, wissen of binden van RNA-methylaties spelen in ontwikkeling en ziekte2. Naast beter bekende functies in de overvloedige ribosomale en overdracht RNAS, reguleren RNA methylatietrajecten specifieke boodschapper RNA stabiliteit3,4, splicing5 en vertaling6,7, Mirna verwerkt8,9 en transcriptionele onderbreken en vrijgeven10,11.
Hier wordt een eenvoudige en robuuste methode voor in-vitro verificatie van RNA-methyltransferase activiteit in de setting van een moleculair biologie laboratorium gerapporteerd (samengevat in Figuur 1). Veel studies beoordelen de activiteit van een RNA-methyltransferase door middel van dot-Blot met een antilichaam tegen de RNA-modificatie van belang. Dot-Blot controleert echter niet de integriteit van het RNA na incubatie met het RNA-methyltransferase. Dit is belangrijk omdat zelfs kleine verontreinigingen van recombinant eiwit met nucleasen kunnen leiden tot gedeeltelijke RNA afbraak en verstorende resultaten. Bovendien kunnen zelfs zeer specifieke RNA modificatie antilichamen ongemodificeerde Rna's herkennen met specifieke sequenties of structuren. De in vitro RNA-methyltransferase assay die hier wordt gerapporteerd, maakt gebruik van het feit dat de S-adenosyl methionine kan worden getritiseerd op de methylgroep donor (Figuur 1), waardoor het gemethyleerd RNA nauwkeurig wordt gedetecteerd zonder het gebruik van antilichamen . Instructies zijn voorzien voor in vitro transcriptie en zuivering van een transcriptie van belang en het testen van de methylatieanalyse van deze transcriptie door het enzym van de belangstelling. Deze methode is flexibel en robuust, en kan worden aangepast aan de behoeften van een bepaald project. Zo kunnen in vitro getranscribeerde en gezuiverde Rna's, chemisch samengestelde rna's, maar ook cellulaire Rna's worden gebruikt. Deze test verschaft kwantitatieve informatie in de vorm van scintillatie tellingen, evenals kwalitatieve informatie door te laten zien waar precies het gemethyleerd RNA op een gel draait. Dit kan een uniek inzicht bieden in de functie van een RNA-methyltransferase, vooral bij het gebruik van cellulaire Rna's als substraat, omdat het een methode biedt om direct de grootte van het RNA of Rna's te observeren die gericht zijn op methylatie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="851">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10821-015</td>
			<td style="width:353px;">10 bp DNA Ladder kit.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10% Ammonium Persulfate (APS)&#160;</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 &#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">10X TBE Buffer</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22&#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">10X TBS</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">BP1408-1</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H])</td>
			<td style="width:121px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:161px;">NET155V250UC</td>
			<td style="width:353px;">For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= 
			(1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 &#181;M.&#160;&#160; Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4&#176;C, make 20 &#181;L aliquots, and freeze them at -30&#176;C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">RPN11649</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amersham Hyperfilm MP</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">28906846</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beckman Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS6500</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704466</td>
			<td style="width:353px;">Mini Horizontal Electrophoresis System.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:121px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:161px;">4693159001</td>
			<td style="width:353px;">For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion Cell</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">345-9902</td>
			<td>RNase free empty cassette for polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion empty Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1656001</td>
			<td>Vertical midi-format electrophoresis cell.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer</td>
			<td style="width:121px;">DeNovix</td>
			<td style="width:161px;">DS-11-S</td>
			<td style="width:353px;">Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ecoscint Original</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td style="width:161px;">LS-271</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">03-337-1</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer</td>
			<td style="width:121px;">RPI CORP</td>
			<td style="width:161px;">112600</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel pretreatment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel dryer</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1651745</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Gel Loading Buffer II</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM8547</td>
			<td style="width:353px;">For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneCatcher disposable gel excision tips</td>
			<td style="width:121px;">Gel Company</td>
			<td style="width:161px;">NC9431993</td>
			<td>For removing bands from agarose and polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Megascript Kit</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM1333</td>
			<td>For in vitro transcription with T7 RNA polymerase.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Perfectwestern Extralarge Container</td>
			<td style="width:121px;">Genhunter Corporation</td>
			<td style="width:161px;">NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black)</td>
			<td>Gel staining box.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pRZ</td>
			<td style="width:121px;">Addgene</td>
			<td style="width:161px;">#27663</td>
			<td style="width:353px;">Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">74204</td>
			<td style="width:353px;">For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">28704</td>
			<td style="width:353px;">Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Saran Premium Plastic Wrap</td>
			<td style="width:121px;">Saran Wrap</td>
			<td style="width:161px;">Amazon</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Gold</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S11494</td>
			<td>Ultra sensitive nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TE</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">93283-100ML</td>
			<td>10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TEMED</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">110-18-9</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5382000023/5361000038</td>
			<td style="width:353px;">For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td style="width:121px;">life technologies</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:353px;">Kits for fast cloning of Taq polymerase&#8211;amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TURBO DNase (2 U&#8260;&#181;L)</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM2238</td>
			<td>For DNA removal from in vitro transcription reactions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">51456-500G</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Whatman 3MM paper</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">3030-154</td>
			<td style="width:353px;">Chromatography paper for drying gel.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis

Er zijn meer dan 100 chemisch verschillende modificaties van RNA, waarvan tweederde bestaat uit methylaties. Belangstelling voor RNA-modificaties, en vooral methylaties, is opnieuw ontstaan als gevolg van de belangrijke rollen die worden gespeeld door de enzymen die ze schrijven en verwijderen in biologische processen die relevant zijn voor ziekte en kanker. Hier wordt een gevoelige in vitro assay voor een accurate analyse van RNA methylatieanalyse Writer activiteit op synthetische of in vitro getranscribeerde rna's verstrekt. Deze test maakt gebruik van een tritiumhoudend vorm van S-adenosyl-methionine, resulterend in directe etikettering van gemethyleerd RNA met tritium. De lage energie van tritium straling maakt de methode veilig, en reeds bestaande methoden van tritium signaalversterking, maken het mogelijk om te kwantificeren en het gemethyleerd RNA visualiseren zonder het gebruik van antilichamen, die vaak vatbaar zijn voor artefacten. Hoewel deze methode is geschreven voor RNA-methylering, maken enkele tweaks het toepasbaar op de studie van andere RNA-modificaties die radioactief gelabeld kunnen worden, zoals RNA acetylering met 14C acetyl coenzym A. over het algemeen maakt deze assay het mogelijk om snel te beoordelen RNA methylatieaandoeningen, remming met kleine molecuul remmers, of het effect van RNA-of enzym mutanten, en biedt een krachtig hulpmiddel om de in cellen verkregen resultaten te valideren en uit te breiden.

In vitro transcriptie reactie Figuur 2 A vertegenwoordigt een typische run van een in vitro transcriptie reactie met de T7 RNA polymerase van het 7Sk snrna, wat een relatief korte (331 NT) en sterk gestructureerd RNA is. Zoals weergegeven op die RAW-afbeelding, zijn er meerdere ongewenste bands, zowel korter als langer dan 7SK, waarschijnlijk als gevolg van willekeurige transcriptionele initiatie-of beëindigings gebeurtenissen. Hierdoor is gel-zuivering ...

Watch this Scientific Journal Video about Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis at JoVE.com

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

Hier wordt een antilichaam-vrije in-vitro test voor directe analyse van methyltransferase activiteit op synthetische of in vitro getranscribeerde RNA beschreven.

Antilichamen-vrije assay voor analyse van RNA-methyltransferase activiteit

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Er zijn meer dan 100 verschillende wijzigingen van RNA, waarvan twee derde methylaties zijn. Dit protocol biedt een methode voor een gevoelige en nauwkeurige analyse van RNA methylatie schrijver activiteit. Deze gebruiksvriendelijke techniek stelt ons in staat om gemethyleerd RNA te kwantificeren en te visualiseren zonder het gebruik van antilichamen, die vaak gevoelig zijn voor artefacten.Het aantonen van de procedure zal Samantha Shelton zijn, een studente van mijn lab. Om met deze procedure te beginnen, stel je de 100-microliter RNA methyltransferase test in een 1,5-milliliter buis op ijs, zoals beschreven in het tekstprotocol. Vortex de buis om grondig te mengen, en centrifuge op 200 keer g gedurende vijf seconden om de oplossing te verzamelen aan de onderkant van de buis.Broed de buis twee uur lang in op 37 graden Celsius. Reinig vervolgens de reactie met behulp van kolomzuivering, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om het aantal vloeibare scintillatie uit te voeren, stelt u het scintillatietellingsrek in met één flacon per monster, één flacon voor een achtergrondmeting en één flesje voor de veegtest.Vul de flacons met vijf milliliter scintillatie teloplossing. Voeg 10 microliter van elk geëuterd radioactief RNA monster in een flacon. Draai het deksel vast en meng voorzichtig.Om de veegtestflozen voor te bereiden, wrijf je wattenstaafjes grondig op alle oppervlakken en apparatuur die tijdens de procedure wordt gebruikt. Voeg deze wattenstaafjes toe aan de flesjes gevuld met scintillatieoplossing en draai het deksel aan. Om de monsters op de scintillatieteller uit te voeren, opent u de tegenkap, plaatst u het rek in de machine en sluit u de kap.Selecteer Enkel aantal tellen. Kies Gebruikersprogramma selecteren. Selecteer of maak een programma dat tritium gedurende 60 seconden meet en druk op Telrack.Herhaal het scintillatietelling drie keer. Daarna moet u een ureum deaturering van polyacrylamidegel voorbereiden en opnieuw uitvoeren, zoals beschreven in het tekstprotocol. Breng 20 microliter radioactief RNA-materiaal over in een nieuwe buis van 1,5 milliliter met 20 microliter 2x gelbelastingeringsbuffer.Na het voorbereiden van de ladder, incubeer de monsters op 70 graden Celsius gedurende 15 minuten. Was de putten van de gel nog een keer vlak voor het monster laden door pipetten buffer van de gel tanks naar beneden in de putten van de gel. Laad vervolgens 20 microliter van de geprepareerde ladder, 20 microliter van de monsters en 20 microliter 1x gelbelastingbuffer in de rijstroken van de gel.Voer de gel op 100 volt gedurende 60 tot 180 minuten, afhankelijk van de polyacrylamide percentage. Zodra de gel klaar is met draaien, verwijder de gel uit de cassette en plaats deze in een doos met 50 milliliter 1X TBE-buffer met vijf microliters ultragevoelige nucleïnezuurgelvlek. Broed vijf minuten op een rocker om het RNA te bevlekken.Neem hierna voorzichtig de gel uit de doos en plaats deze op de UV-transilluminator van het gelbeeldvormingssysteem met de putten omhoog en de ladder aan de linkerkant. Richt de camera op de gel, zet het UV-licht aan en maak een afbeelding van de gel. Schakel vervolgens de UV-belichting uit en sla de afbeelding op als een TIFF-bestand.Plaats de gel terug in de doos, verwijder de TBE, en bevestig de gel met 50 milliliter bevestiging oplossing op een tuimelschakelaar bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Verplaats vervolgens voorzichtig de gel naar een verse zwarte doos met 25 milliliter van de autoradiografieverbeterende oplossing. Incubeer op de rocker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.Til de gel voorzichtig op en leg deze met het gezicht naar beneden op een vel plastic folie met de putten omhoog en de ladder aan de rechterkant. Plaats twee vellen chromatografie papier op de achterkant van de gel, en flip de hele stapel. Verwarm de geldroger voor op 80 graden Celsius.Verplaats de plastic deksel op de geldroger terug. Steek de hele stapel onder de plastic deksel, en beweeg de plastic deksel terug naar beneden om een afdichting te creëren. Droog de gel een uur lang op 80 graden Celsius.Zet vervolgens de geldroger uit en verwijder de stapel voorzichtig. Verwijder de wrap en tweede chromatografie papier. Plak het resterende chromatografiepapier vast met de gedroogde gel in een autoradiogramcassette.In een donkere kamer, voeg een vel autoradiografie film. Bewaar de cassette op een negatieve 80 graden Celsius en ontwikkel de film op het juiste moment, afhankelijk van de signaalintensiteit. Zodra de film is ontwikkeld, plaats deze op de cassette en gebruik een labmarker om zorgvuldig de vier randen van de gel, elk goed, en de positie van de XC en BB-kleurstoffen te markeren.Scan de film met een resolutie van 300 of 600 pixels per inch en sla de afbeelding op als een TIFF-bestand. In deze studie wordt een antilichaamvrije test aangetoond om de activiteit van RNA methyltransferase te analyseren. Een typische looppas van een in vitro transcriptiereactie met T7 RNA polymerase van 7SK klein kernRNA toont vrij kort en hoogst gestructureerd RNA.Er zijn meerdere ongewenste banden, zowel korter als langer dan 7SK, waarschijnlijk als gevolg van willekeurige transcriptie-initiatie- of beëindigingsgebeurtenissen. Daarom is gelzuivering na de in vitro transcriptiereactie belangrijk om een schoon RNA-monster te verkrijgen. Op dit punt, het RNA van belang kan worden geïdentificeerd door de locatie ten opzichte van de ladder en gezuiverd door gel zuivering.Hier wordt een representatieve RNA methyltransferasetest weergegeven met behulp van de ondergrens van de aanbevolen RNA- en eiwitconcentraties. Deze test zorgt voor zowel kwantitatieve resultaten van de scintillatie telt, evenals kwalitatieve resultaten van het autoradiogram. Hier wordt aangetoond dat een RNA methyltransferase die bekend is bij methylaat 7SK ook U6 kan methylalaat. Bovendien, zoals onlangs aangetoond voor 7SK, binding van histone H4 aan MePCE remt ook U6 methylatie.Dit kan worden waargenomen in zowel de scintillatie telling en het autoradiogram, waaruit de robuustheid van dit protocol. RNA is gevoelig voor afbraak, dus zorg ervoor dat rnase-vrije reagentia te gebruiken en om grondig schoon alle oppervlakken en apparatuur. Het radioactief gelabelde RNA dat uit deze methyltransferasetest is verkregen, kan rechtstreeks worden gebruikt om de RNA-demethylaseactiviteit of RNA-bindingsactiviteit te beoordelen door bijvoorbeeld elektroforetische mobiliteitsverschuivingstest.Deze methode stelt onderzoekers in staat om het effect van verschillende factoren op RNA methyltransferase activiteit te testen, met inbegrip van puntmutaties en kleine molecuulremmer behandelingen. Deze methode maakt gebruik van radioactief materiaal, dus zorg ervoor dat u de juiste BESCHERMINGSMIDDELEN draagt en wees voorzichtig bij het hanteren en verwijderen van radioactieve stoffen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptoom analyse<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA Sequencing gegevens via de Tuxedo Suite op de Galaxy Project

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-kwantitatieve opsporing van RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van menselijke Telomerase Reverse-Transcriptase eiwit

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA Pull-down te identificeren van RNA doelen van een lang niet-coderende RNA Procedure

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Zeldzame gebeurtenis detectie met behulp van fout-gecorrigeerd DNA en RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kwantitatieve analyse van alternatieve Pre-mRNA-Splicing in muis hersenen secties met behulp van RNA In Situ hybridisatie Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabole labelen met 4-thiouracil en de kwantificering van gesynthetiseerd mRNA nieuw als een Proxy voor RNA Polymerase II activiteit

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR gids RNA klonen voor zoogdieren systemen

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Kunstmatige RNA polymerase II-rek complexen voor het ontleden van co-transcriptionele RNA-verwerkings gebeurtenissen

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Een test voor het kwantificeren van eiwit-RNA-binding bij bacteriën

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...