Name: antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00
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Les auteurs tient à remercier le Dr Turja Kanti Debnath pour son aide à ChemDraw. La recherche dans le laboratoire xhemalçe est soutenue par le ministère de la Défense - Congressionally Directed Medical Research Program - Breast Cancer Breakthrough Award (W81XWH-16-1-0352), NIH Grant R01 GM127802 et des fonds de démarrage de l'Institut de cellulaire et Molecular Biology et le College of Natural Sciences de l'Université du Texas à Austin, États-Unis.

1. Transcription in vitro et purification de gel de l'ARN cible
<ol><li>Clonez la séquence d'intérêt en plasmides contenant des promoteurs T7 et/ou SP6 en utilisant des techniques de clonage moléculaire établies12 ou des kits.</li>
	<li>La linéarisation du modèle d'ADN pour la transcription in vitro
	<ol>
<li>Amplifiez la séquence d'intérêt par PCR du plasmide avec des amorces conçues pour inclure la région de promoteur T7 par l'insertion, 20-30 bp en amont et en ava...

<ol>
	<li>Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+histones+to+RNA:+role+of+methylation+in+cancer.">From histones to RNA: role of methylation in cancer.</a> Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).</li><li>Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Who+Watches+the+Watchmen:+Roles+of+RNA+Modifications+in+the+RNA+Interference+Pathway.">Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).</li><li>Mauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+methylation+of+m(6)Am+in+the+5'+cap+controls+mRNA+stability.">Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability.</a> Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability.">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li><li>Pendleton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U6+snRNA+m(6)A+Methyltransferase+METTL16+Regulates+SAM+Synthetase+Intron+Retention.">The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention.</a> Cell. 169 (5), 824-835 (2017).</li><li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'+UTR+m(6)A+Promotes+Cap-Independent+Translation.">5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation.</a> Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(6)-methyladenosine+Modulates+Messenger+RNA+Translation+Efficiency.">N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency.</a> Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).</li><li>Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine+marks+primary+microRNAs+for+processing.">N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing.</a> Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).</li><li>Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RNA+methyltransferase+BCDIN3D+regulates+microRNA+processing.">Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing.</a> Cell. 151 (2), 278-288 (2012).</li><li>Jeronimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+the+protein+interaction+network+for+the+human+transcription+machinery+reveals+the+identity+of+the+7SK+capping+enzyme.">Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme.</a> Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brd4+and+JMJD6-associated+anti-pause+enhancers+in+regulation+of+transcriptional+pause+release.">Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release.</a> Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visual Experimentation. , (2019).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).</li><li>Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+strand+switching+by+T7+RNA+polymerase.">Template strand switching by T7 RNA polymerase.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+active+recombinant+T7+RNA+polymerase+from+E.+coli.">Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).</li><li>Shelton, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+RNA+Methylation+and+Histone-Binding+Activities+of+MePCE+Regulates+P-TEFb+Activation+on+Chromatin.">Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin.</a> Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).</li><li>Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+plasmids+for+producing+RNA+in+vitro+transcripts+with+homogeneous+ends.">General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends.</a> Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).</li><li>Blazer, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Suite+of+Biochemical+Assays+for+Screening+RNA+Methyltransferase+BCDIN3D.">A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D.</a> SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).</li><li>Arango, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+Promotes+Translation+Efficiency.">Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.</a> Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NAT10+is+an+ATP-dependent+RNA+acetyltransferase+responsible+for+N4-acetylcytidine+formation+in+18+S+ribosomal+RNA+(rRNA).">Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).</li></ol>

Ici, une méthode simple et robuste pour la vérification in vitro de l'activité de méthyltransferase d'ARN vers des transcriptions spécifiques est rapportée. L'analyse profite du fait que la méthionine de S-adenosyl peut être tritiaté sur le donneur de groupe méthyle (figure 1), permettant que l'ARN méthylé soit détecté avec précision sans l'utilisation d'anticorps. Cependant, il est important de noter que cet essai ne peut pas indiquer quel résidu ou groupe chimique est méth...

L'ADN, l'ARN et les protéines sont sujets à des modifications qui régulent étroitement l'expression des gènes1. Parmi ces modifications, les méthylations se produisent sur les trois biopolymères. L'ADN et les protéines méthylations ont été très bien étudiés au cours des trois dernières décennies. En revanche, l'intérêt pour la méthylation de l'ARN n'a été relancé que récemment à la lumière des rôles importants que les protéines qui écrivent, effacent ou lient les méthylations de l'ARN jouent dans le développement et la maladie2. En plus de fonctions mieux connues dans l'abondante ribosomal et le transfert RNAs, voies de méthylation ARN réguler la stabilité spécifique de l'ARN messager3,4, épissage5 et traduction6,7, traitement miRNA8,9 et pause transcriptionnelle et la libération10,11.
Ici, une méthode simple et robuste pour la vérification in vitro de l'activité de méthyltransferase d'ARN dans le cadre d'un laboratoire de biologie moléculaire est rapportée (résumée dans la figure 1). Beaucoup d'études évaluent l'activité d'un méthyltransferase d'ARN par le point-blot avec un anticorps contre la modification d'ARN de l'intérêt. Cependant, point-blot ne vérifie pas l'intégrité de l'ARN lors de l'incubation avec le méthyltransferase d'ARN. Ceci est important parce que même les contaminations mineures des protéines recombinantes avec des nucléases peuvent conduire à une dégradation partielle de l'ARN et des résultats confondants. En outre, même les anticorps très spécifiques de modification d'ARN peuvent reconnaître les ARN non modifiés avec des séquences ou des structures spécifiques. L'analyse in vitro de méthyltransferase d'ARN rapportée ici tire parti du fait que la méthionine de S-adenosyl peut être tritiated sur le donneur de groupe méthyle (figure 1), permettant que l'ARN méthylé soit détecté avec précision sans l'utilisation des anticorps . Des instructions sont fournies pour la transcription in vitro et la purification d'une transcription d'intérêt et de l'essai de la méthylation de ladite transcription par l'enzyme d'intérêt. Cette méthode est flexible et robuste, et peut être ajustée en fonction des besoins de n'importe quel projet donné. Par exemple, les ARN transcrits et purifiés in vitro, les ARN synthétisés chimiquement, mais aussi les ARN cellulaires peuvent être utilisés. Cet essai fournit l'information quantitative sous forme de compte de scintillation, aussi bien que l'information qualitative en montrant où exactement l'ARN méthylé fonctionne sur un gel. Cela peut fournir un aperçu unique de la fonction d'un ARN méthyltransferase, en particulier lors de l'utilisation des ARN cellulaires comme substrat, car il fournit une méthode pour observer directement la taille de l'ARN ou des ARN qui sont ciblés pour la méthylation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="851">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10821-015</td>
			<td style="width:353px;">10 bp DNA Ladder kit.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10% Ammonium Persulfate (APS)&#160;</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 &#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">10X TBE Buffer</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22&#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">10X TBS</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">BP1408-1</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H])</td>
			<td style="width:121px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:161px;">NET155V250UC</td>
			<td style="width:353px;">For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= 
			(1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 &#181;M.&#160;&#160; Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4&#176;C, make 20 &#181;L aliquots, and freeze them at -30&#176;C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">RPN11649</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amersham Hyperfilm MP</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">28906846</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beckman Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS6500</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704466</td>
			<td style="width:353px;">Mini Horizontal Electrophoresis System.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:121px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:161px;">4693159001</td>
			<td style="width:353px;">For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion Cell</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">345-9902</td>
			<td>RNase free empty cassette for polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion empty Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1656001</td>
			<td>Vertical midi-format electrophoresis cell.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer</td>
			<td style="width:121px;">DeNovix</td>
			<td style="width:161px;">DS-11-S</td>
			<td style="width:353px;">Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ecoscint Original</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td style="width:161px;">LS-271</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">03-337-1</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer</td>
			<td style="width:121px;">RPI CORP</td>
			<td style="width:161px;">112600</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel pretreatment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel dryer</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1651745</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Gel Loading Buffer II</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM8547</td>
			<td style="width:353px;">For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneCatcher disposable gel excision tips</td>
			<td style="width:121px;">Gel Company</td>
			<td style="width:161px;">NC9431993</td>
			<td>For removing bands from agarose and polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Megascript Kit</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM1333</td>
			<td>For in vitro transcription with T7 RNA polymerase.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Perfectwestern Extralarge Container</td>
			<td style="width:121px;">Genhunter Corporation</td>
			<td style="width:161px;">NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black)</td>
			<td>Gel staining box.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pRZ</td>
			<td style="width:121px;">Addgene</td>
			<td style="width:161px;">#27663</td>
			<td style="width:353px;">Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">74204</td>
			<td style="width:353px;">For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">28704</td>
			<td style="width:353px;">Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Saran Premium Plastic Wrap</td>
			<td style="width:121px;">Saran Wrap</td>
			<td style="width:161px;">Amazon</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Gold</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S11494</td>
			<td>Ultra sensitive nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TE</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">93283-100ML</td>
			<td>10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TEMED</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">110-18-9</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5382000023/5361000038</td>
			<td style="width:353px;">For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td style="width:121px;">life technologies</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:353px;">Kits for fast cloning of Taq polymerase&#8211;amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TURBO DNase (2 U&#8260;&#181;L)</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM2238</td>
			<td>For DNA removal from in vitro transcription reactions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">51456-500G</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Whatman 3MM paper</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">3030-154</td>
			<td style="width:353px;">Chromatography paper for drying gel.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis

Il y a plus de 100 modifications chimiquement distinctes de l'ARN, dont les deux tiers se composent de méthylations. L'intérêt pour les modifications de l'ARN, et en particulier les méthylations, est réapparu en raison des rôles importants joués par les enzymes qui les écrivent et les effacent dans les processus biologiques pertinents à la maladie et au cancer. Ici, un analyse in vitro sensible pour l'analyse précise de l'activité d'auteur de méthylation d'ARN sur les ARN transcrits synthétiques ou in vitro est fourni. Cet exemple utilise une forme tritiée de S-adenosyl-méthionine, résultant en l'étiquetage direct de l'ARN méthylé avec du tritium. La faible énergie du rayonnement tritium rend la méthode sûre, et les méthodes préexistantes d'amplification du signal de tritium, permettent de quantifier et de visualiser l'ARN méthylé sans l'utilisation d'anticorps, qui sont généralement sujettes aux artefacts. Bien que cette méthode soit écrite pour la méthylation de l'ARN, peu de réglages le rendent applicable à l'étude d'autres modifications de l'ARN qui peuvent être étiquetées radioactivement, comme l'acétylation d'ARN avec 14C coenzyme acétyle A. Dans l'ensemble, cet essai permet d'évaluer rapidement l'ARN conditions de méthylation, l'inhibition avec les inhibiteurs de petites molécules, ou l'effet de l'ARN ou des mutants enzymatiques, et fournit un outil puissant pour valider et élargir les résultats obtenus dans les cellules.

Réaction de transcription in vitro Figure 2 A représente une course typique d'une réaction de transcription in vitro avec la polymérase d'ARN T7 du snRNA 7SK, qui est un ARN relativement court (331 nt) et très structuré. Comme le montre cette image brute, il existe plusieurs bandes indésirables, à la fois plus courtes et plus longues que 7SK, résultant probablement d'événements aléatoires d'initiation transcriptionnelle ou de terminaison. Pour...

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Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

Ici, un analyse in vitro sans anticorps pour l'analyse directe de l'activité de méthyltransferase sur l'ARN synthétique ou in vitro transcrit est décrit.

Analyse d'activité sans anticorps pour l'analyse de l'activité de méthyltransferase d'ARN

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Il y a plus de 100 modifications distinctes de l’ARN, dont deux tiers sont des méthylations. Ce protocole fournit une méthode pour l’analyse sensible et précise de l’activité d’auteur de méthylation d’ARN. Cette technique facile à utiliser nous permet de quantifier et de visualiser l’ARN méthylé sans l’utilisation d’anticorps, qui sont généralement sujets aux artefacts.Samantha Shelton, une étudiante diplômée de mon labo, démontrera la procédure. Pour commencer cette procédure, installez l’essai de méthyltransferase d’ARN de 100 microlitres dans un tube de glace de 1,5 millilitre, tel que décrit dans le protocole de texte. Vortex le tube pour bien mélanger, et centrifugeuse à 200 fois g pendant cinq secondes pour recueillir la solution au fond du tube.Incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, nettoyez la réaction à l’aide de la purification de la colonne, tel que décrit dans le protocole de texte. Pour effectuer le compte de scintillation liquide, configurez le rack de comptage de scintillation avec un flacon par échantillon, un flacon pour une mesure de fond, et un flacon pour le test de balayage.Remplissez les flacons de cinq millilitres de solution de comptage de scintillation. Ajouter 10 microlitres de chaque échantillon d’ARN radioactif élut dans un flacon. Serrer le couvercle et mélanger délicatement.Pour préparer les flacons d’essai de balayage, frottez soigneusement les cotons-tiges sur toutes les surfaces et équipements utilisés pendant la procédure. Ajoutez ces écouvillons aux flacons remplis de solution de scintillation et serrez le couvercle. Pour faire fonctionner les échantillons sur le comptoir de scintillation, ouvrez le capot du comptoir, insérez le support dans la machine et fermez le capot.Sélectionnez Count Single Rack. Choisissez select user program. Sélectionnez ou créez un programme qui mesure le tritium pendant 60 secondes et frappez Count Rack.Répétez le compte de scintillation trois fois. Après cela, préparez et réexédez un gel de polyacrylamide dénaturant l’urée, tel que décrit dans le protocole de texte. Transférer 20 microlitres de matière radioactive ARN dans un nouveau tube de 1,5 millilitre contenant 20 microlitres de tampon de chargement de gel 2X.Après avoir préparé l’échelle, incuber les échantillons à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes. Lavez les puits du gel une fois de plus immédiatement avant le chargement de l’échantillon par tampon de pipetting des réservoirs de gel vers le bas dans les puits du gel. Ensuite, chargez 20 microlitres de l’échelle préparée, 20 microlitres des échantillons et 20 microlitres de tampon de chargement de gel 1X dans les voies du gel.Faire fonctionner le gel à 100 volts pendant 60 à 180 minutes, selon le pourcentage de polyacrylamide. Une fois le gel terminé, retirez le gel de la cassette et placez-le dans une boîte contenant 50 millilitres de tampon 1X TBE avec cinq microlitres de tache de gel nucléique ultrasensible. Incuber sur un rocker pendant cinq minutes pour tacher l’ARN.Après cela, prenez soigneusement le gel hors de la boîte, et placez-le sur le transilluminateur UV du système d’imagerie par gel avec les puits vers le haut et l’échelle sur la gauche. Concentrez la caméra sur le gel, allumez la lumière UV et prenez une image du gel. Ensuite, éteignez l’exposition aux UV et enregistrez l’image sous forme de fichier TIFF.Remettre le gel dans la boîte, retirer le TBE et fixer le gel avec 50 millilitres de solution de fixation sur un rocker à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, déplacez doucement le gel vers une boîte noire fraîche contenant 25 millilitres de la solution d’amélioration de l’autoradiographie. Incuber sur le rocker à température ambiante pendant 30 minutes.Soulevez doucement le gel et placez-le face contre terre sur une feuille de pellicule plastique avec les puits en place et l’échelle sur le côté droit. Placez deux feuilles de papier chromatographie sur le dos du gel et retournez toute la pile. Préchauffer le séchoir à gel à 80 degrés Celsius.Déplacez le couvercle en plastique sur le séchoir à gel. Insérez toute la pile sous le couvercle en plastique et déplacez le couvercle en plastique vers le bas pour créer un joint. Séchez le gel à 80 degrés Celsius pendant une heure.Ensuite, éteignez la sécheuse à gel et retirez doucement la pile. Retirer l’enveloppement et le deuxième papier chromatographie. Tapez le reste du papier chromatographie avec le gel séché dans une cassette autoradiogramme.Dans une pièce sombre, ajouter une feuille de film autoradiographie. Rangez la cassette à 80 degrés Celsius négatif et développez le film au moment opportun, selon l’intensité du signal. Une fois que le film est développé, placez-le sur le dessus de la cassette et utilisez un marqueur de laboratoire pour marquer soigneusement les quatre bords du gel, chaque puits, et la position des dyes XC et BB.Numérisez le film à une résolution de 300 ou 600 pixels par pouce, et enregistrez l’image sous forme de fichier TIFF. Dans cette étude, un essai anticorps-libre est démontré pour analyser l’activité de méthyltransferase d’ARN. Une course typique d’une réaction in vitro de transcription avec le polymésase d’ARN T7 du petit ARN nucléaire de 7SK montre l’ARN relativement court et fortement structuré.Il existe plusieurs bandes indésirables, à la fois plus courtes et plus longues que 7SK, probablement résultant d’événements d’initiation transcriptionnelle aléatoire ou de terminaison. Pour cette raison, la purification du gel après la réaction de transcription in vitro est importante pour obtenir un échantillon d’ARN propre. À ce stade, l’ARN d’intérêt peut être identifié par son emplacement par rapport à l’échelle et purifié par la purification du gel.Un essai représentatif de méthyltransferase d’ARN utilisant la limite inférieure des concentrations recommandées d’ARN et de protéine est montré ici. Cet essai permet à la fois des résultats quantitatifs des comptes de scintillation, ainsi que des résultats qualitatifs de l’autoradiogramme. Ici, un méthyltransferase ARN connu sous le méthylate 7SK est montré pour être en mesure de méthyliquer U6. En outre, comme récemment montré pour 7SK, la liaison de l’histone H4 à MePCE inhibe également la méthylation U6.Ceci peut être observé dans le compte de scintillation et l’autoradiogramme, montrant la robustesse de ce protocole. L’ARN est susceptible d’être dégradation, alors assurez-vous d’utiliser des reagents sans RNase et de nettoyer soigneusement toutes les surfaces et tout l’équipement. L’ARN étiqueté radioactivement obtenu à partir de cet essai de méthyltransferase peut être directement utilisé pour évaluer l’activité de déméthylase de l’ARN ou l’activité liant l’ARN par essai électrophoretic de décalage de mobilité, par exemple.Cette méthode permet aux chercheurs de tester l’effet de différents facteurs sur l’activité de méthyltransferase arn, y compris les mutations ponctuelles et les traitements inhibiteurs de petites molécules. Cette méthode utilise des matières radioactives, alors assurez-vous de porter l’EPI approprié, et soyez prudent lors de la manipulation et l’élimination des matières radioactives.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Cartographie des interactions ARN-ARN à l&#39;échelle mondiale à l&#39;aide de psoralène biotinylé

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