Name: antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00
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Die Autoren danken Dr. Turja Kanti Debnath für seine Hilfe bei ChemDraw. Die Forschung im Xhemalé-Labor wird vom Department of Defense - Congressionally Directed Medical Research Program - Breast Cancer Breakthrough Award (W81XWH-16-1-0352), NIH Grant R01 GM127802 und Start-up-Fonds des Institute of Cellular and Molecular Biology and the College of Natural Sciences at the University of Texas at Austin, USA.

1. In-vitro-Transkription und Gelreinigung der Ziel-RNA
<ol><li>Klonen Sie die Abfolge des Interesses in Plasmiden, die T7- und/oder SP6-Promotoren enthalten, indem Sie etablierte molekulare Klontechniken12 oder Kits verwenden.</li>
	<li>Linearisieren der DNA-Vorlage für die In-vitro-Transkription
	<ol>
<li>Verstärken Sie die Interessensfolge durch PCR des Plasmids mit Primern, die den T7-Promotorbereich durch den Einsatz, +20-30 bp vor- und nachgelagert, wie zuvor beschrieben...

<ol>
	<li>Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+histones+to+RNA:+role+of+methylation+in+cancer.">From histones to RNA: role of methylation in cancer.</a> Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).</li><li>Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Who+Watches+the+Watchmen:+Roles+of+RNA+Modifications+in+the+RNA+Interference+Pathway.">Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).</li><li>Mauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+methylation+of+m(6)Am+in+the+5'+cap+controls+mRNA+stability.">Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability.</a> Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability.">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li><li>Pendleton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U6+snRNA+m(6)A+Methyltransferase+METTL16+Regulates+SAM+Synthetase+Intron+Retention.">The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention.</a> Cell. 169 (5), 824-835 (2017).</li><li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'+UTR+m(6)A+Promotes+Cap-Independent+Translation.">5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation.</a> Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(6)-methyladenosine+Modulates+Messenger+RNA+Translation+Efficiency.">N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency.</a> Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).</li><li>Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine+marks+primary+microRNAs+for+processing.">N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing.</a> Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).</li><li>Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RNA+methyltransferase+BCDIN3D+regulates+microRNA+processing.">Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing.</a> Cell. 151 (2), 278-288 (2012).</li><li>Jeronimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+the+protein+interaction+network+for+the+human+transcription+machinery+reveals+the+identity+of+the+7SK+capping+enzyme.">Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme.</a> Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brd4+and+JMJD6-associated+anti-pause+enhancers+in+regulation+of+transcriptional+pause+release.">Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release.</a> Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visual Experimentation. , (2019).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).</li><li>Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+strand+switching+by+T7+RNA+polymerase.">Template strand switching by T7 RNA polymerase.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+active+recombinant+T7+RNA+polymerase+from+E.+coli.">Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).</li><li>Shelton, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+RNA+Methylation+and+Histone-Binding+Activities+of+MePCE+Regulates+P-TEFb+Activation+on+Chromatin.">Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin.</a> Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).</li><li>Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+plasmids+for+producing+RNA+in+vitro+transcripts+with+homogeneous+ends.">General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends.</a> Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).</li><li>Blazer, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Suite+of+Biochemical+Assays+for+Screening+RNA+Methyltransferase+BCDIN3D.">A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D.</a> SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).</li><li>Arango, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+Promotes+Translation+Efficiency.">Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.</a> Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NAT10+is+an+ATP-dependent+RNA+acetyltransferase+responsible+for+N4-acetylcytidine+formation+in+18+S+ribosomal+RNA+(rRNA).">Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).</li></ol>

Hierwird wird eine einfache und robuste Methode zur In-vitro-Verifizierung der RNA-Methyltransferase-Aktivität in Richtung spezifischer Transkripte berichtet. Der Test nutzt die Tatsache aus, dass S-Adenosylmethionin auf den Methylgruppenspender tritiiert werden kann (Abbildung 1), so dass die methylierte RNA ohne den Einsatz von Antikörpern genau nachgewiesen werden kann. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass dieser Test nicht darauf hinweisen kann, welcher Rückstand oder welche chemis...

DNA, RNA und Proteine unterliegen Modifikationen, die die Genexpression1streng regulieren. Unter diesen Modifikationen treten Methylierungen auf allen drei Biopolymeren auf. DNA- und Proteinmethylierungen wurden in den letzten drei Jahrzehnten sehr gut untersucht. Im Gegensatz dazu wurde das Interesse an der RNA-Methylierung erst vor kurzem angesichts der wichtigen Rolle neu entfacht, die Proteine, die RNA-Methylierungen schreiben, löschen oder binden, in Entwicklung und Krankheit2spielen. Neben bekannteren Funktionen in den reichlich ribosomalen und Transfer-RNAs regulieren RNA-Methylierungswege die spezifische Boten-RNA-Stabilität3,4, spleißen5 und Translation6,7, miRNA-Verarbeitung8,9 und Transkriptionspausimierung und Freigabe10,11.
Hier wird eine einfache und robuste Methode zur In-vitro-Verifizierung der RNA-Methyltransferase-Aktivität bei der Einstellung eines molekularbiologischen Labors berichtet (zusammengefasst in Abbildung 1). Viele Studien bewerten die Aktivität einer RNA-Methyltransferase durch Dot-Blot mit einem Antikörper gegen die RNA-Modifikation von Interesse. Dot-Blot überprüft jedoch nicht die Integrität der RNA bei der Inkubation mit der RNA-Methyltransferase. Dies ist wichtig, da schon geringfügige Kontaminationen rekombinanter Proteine mit Nukleasen zu einem partiellen RNA-Abbau und verwirrenden Ergebnissen führen können. Darüber hinaus können selbst hochspezifische RNA-Modifikationsantikörper unveränderte RNAs mit spezifischen Sequenzen oder Strukturen erkennen. Der hier berichtete In-vitro-RNA-Methyltransferase-Assay nutzt die Tatsache aus, dass das S-Adenosylmethionin auf den Methylgruppenspender tritiiert werden kann (Abbildung 1), so dass die methylierte RNA ohne den Einsatz von Antikörpern genau nachgewiesen werden kann. . Es werden Anweisungen für die In-vitro-Transkription und die Reinigung einer Voninteresses-Transkription und die Prüfung der Methylierung dieser Transkription durch das Enzym von Interesse bereitgestellt. Diese Methode ist flexibel und robust und kann an die Bedürfnisse eines bestimmten Projekts angepasst werden. Zum Beispiel können in vitro transkribierte und gereinigte RNAs, chemisch synthetisierte RNAs, aber auch zelluläre RNAs verwendet werden. Dieser Assay liefert quantitative Informationen in Form von Szintillationszahlen sowie qualitative Informationen, indem er zeigt, wo genau die methylierte RNA auf einem Gel läuft. Dies kann einen einzigartigen Einblick in die Funktion einer RNA-Methyltransferase bieten, insbesondere bei verwendung von zellulären RNAs als Substrat, da es eine Methode bietet, um die Größe der RNA oder RNAs, die für die Methylierung bestimmt sind, direkt zu beobachten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="851">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10821-015</td>
			<td style="width:353px;">10 bp DNA Ladder kit.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10% Ammonium Persulfate (APS)&#160;</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 &#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">10X TBE Buffer</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22&#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">10X TBS</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">BP1408-1</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H])</td>
			<td style="width:121px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:161px;">NET155V250UC</td>
			<td style="width:353px;">For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= 
			(1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 &#181;M.&#160;&#160; Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4&#176;C, make 20 &#181;L aliquots, and freeze them at -30&#176;C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">RPN11649</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amersham Hyperfilm MP</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">28906846</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beckman Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS6500</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704466</td>
			<td style="width:353px;">Mini Horizontal Electrophoresis System.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:121px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:161px;">4693159001</td>
			<td style="width:353px;">For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion Cell</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">345-9902</td>
			<td>RNase free empty cassette for polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion empty Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1656001</td>
			<td>Vertical midi-format electrophoresis cell.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer</td>
			<td style="width:121px;">DeNovix</td>
			<td style="width:161px;">DS-11-S</td>
			<td style="width:353px;">Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ecoscint Original</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td style="width:161px;">LS-271</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">03-337-1</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer</td>
			<td style="width:121px;">RPI CORP</td>
			<td style="width:161px;">112600</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel pretreatment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel dryer</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1651745</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Gel Loading Buffer II</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM8547</td>
			<td style="width:353px;">For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneCatcher disposable gel excision tips</td>
			<td style="width:121px;">Gel Company</td>
			<td style="width:161px;">NC9431993</td>
			<td>For removing bands from agarose and polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Megascript Kit</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM1333</td>
			<td>For in vitro transcription with T7 RNA polymerase.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Perfectwestern Extralarge Container</td>
			<td style="width:121px;">Genhunter Corporation</td>
			<td style="width:161px;">NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black)</td>
			<td>Gel staining box.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pRZ</td>
			<td style="width:121px;">Addgene</td>
			<td style="width:161px;">#27663</td>
			<td style="width:353px;">Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">74204</td>
			<td style="width:353px;">For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">28704</td>
			<td style="width:353px;">Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Saran Premium Plastic Wrap</td>
			<td style="width:121px;">Saran Wrap</td>
			<td style="width:161px;">Amazon</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Gold</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S11494</td>
			<td>Ultra sensitive nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TE</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">93283-100ML</td>
			<td>10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TEMED</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">110-18-9</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5382000023/5361000038</td>
			<td style="width:353px;">For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td style="width:121px;">life technologies</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:353px;">Kits for fast cloning of Taq polymerase&#8211;amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TURBO DNase (2 U&#8260;&#181;L)</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM2238</td>
			<td>For DNA removal from in vitro transcription reactions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">51456-500G</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Whatman 3MM paper</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">3030-154</td>
			<td style="width:353px;">Chromatography paper for drying gel.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis

Es gibt mehr als 100 chemisch unterschiedliche Modifikationen der RNA, von denen zwei Drittel aus Methylierungen bestehen. Das Interesse an RNA-Modifikationen, insbesondere Methylierungen, ist aufgrund der wichtigen Rolle der Enzyme, die sie schreiben und löschen, in biologischen Prozessen, die für Krankheiten und Krebs relevant sind, wieder aufgetaucht. Hierbei wird ein empfindlicher In-vitro-Assay zur genauen Analyse der RNA-Methylierungs-Writer-Aktivität an synthetischen oder in vitro transkribierten RNAs bereitgestellt. Dieser Test verwendet eine tritiated Form von S-Adenosyl-Methionin, was zu einer direkten Etikettierung von methylierter RNA mit Tritium führt. Die geringe Energie der Tritiumstrahlung macht die Methode sicher, und bereits bestehende Methoden der Tritiumsignalverstärkung ermöglichen es, die methylierte RNA ohne den Einsatz von Antikörpern, die häufig anfällig für Artefakte sind, zu quantifizieren und zu visualisieren. Während diese Methode für die RNA-Methylierung geschrieben ist, machen wenige Optimierungen es für die Untersuchung anderer RNA-Modifikationen anwendbar, die radioaktiv markiert werden können, wie z. B. RNA-Acetylierung mit 14C Acetyl-Coenzym A. Insgesamt ermöglicht dieser Assay eine schnelle Bewertung der RNA Methylierungsbedingungen, Hemmung mit kleinen Molekülinhibitoren oder die Wirkung von RNA- oder Enzymmutanten und bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die in Zellen erhaltenen Ergebnisse zu validieren und zu erweitern.

In-vitro-Transkriptionsreaktion Abbildung 2 A stellt einen typischen Lauf einer In-vitro-Transkriptionsreaktion mit der T7-RNA-Polymerase der 7SK snRNA dar, die eine relativ kurze (331 nt) und hochstrukturierte RNA ist. Wie auf diesem Rohbild gezeigt, gibt es mehrere unerwünschte Bänder, sowohl kürzer als auch länger als 7SK, wahrscheinlich als Ergebnis zufälliger transkriptionsiellen Initiierungs- oder Beendigungsereignisse. Aus diesem Grund ist die...

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Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

Hierwird wird ein antikörperfreier In-vitro-Assay zur direkten Analyse der Methyltransferase-Aktivität an synthetischer oder in vitro transkribierter RNA beschrieben.

Antikörperfreier Assay für rna-Methyltransferase-Aktivitätsanalyse

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Es gibt mehr als 100 verschiedene Modifikationen der RNA, von denen zwei Drittel Methylierungen sind. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur sensiblen und genauen Analyse der RNA-Methylierungs-Schreiberaktivität. Diese einfach zu bedienende Technik ermöglicht es uns, methylierte RNA ohne den Einsatz von Antikörpern zu quantifizieren und zu visualisieren, die häufig anfällig für Artefakte sind.Das Verfahren demonstriert Samantha Shelton, eine Studentin aus meinem Labor. Um dieses Verfahren zu beginnen, richten Sie den 100-Mikroliter-RNA-Methyltransferase-Assay in einer 1,5-Milliliter-Röhre auf Eis ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Wirbeln Sie das Rohr gründlich zu mischen, und Zentrifuge bei 200 mal g für fünf Sekunden, um die Lösung an der Unterseite des Rohres zu sammeln.Inkubieren Sie die Röhre bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Reinigen Sie dann die Reaktion mithilfe der Spaltenreinigung, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Flüssigkeitsszintillationsanzahl durchzuführen, richten Sie das Szintillations-Zählgestell mit einer Durchstechflasche pro Probe, einer Durchstechflasche für eine Hintergrundmessung und einer Durchstechflasche für den Wischtest ein.Füllen Sie die Durchstechflaschen mit fünf Milliliterszuptupationszähllösung. Fügen Sie 10 Mikroliter jeder eluierten radioaktiven RNA-Probe in eine Durchstechflasche. Ziehen Sie den Deckel fest und mischen Sie ihn sanft.Um die Wischtest-Fläschchen vorzubereiten, reiben Sie Baumwollabstriche gründlich auf alle Oberflächen und Geräte, die während des Verfahrens verwendet werden. Fügen Sie diese Tupfer zu den Fläschchen mit Szintillationslösung gefüllt, und ziehen Sie den Deckel. Um die Proben auf dem Szintillationszähler auszuführen, öffnen Sie die Zählerhaube, legen Sie das Rack in die Maschine ein und schließen Sie die Haube.Wählen Sie Count Single Rack. Wählen Sie Benutzerprogramm auswählen aus. Wählen oder erstellen Sie ein Programm, das Tritium für 60 Sekunden misst, und drücken Sie Count Rack.Wiederholen Sie die Szintillationsanzahl dreimal. Danach ein Harnstoff-denaturierendes Polyacrylamid-Gel, wie im Textprotokoll beschrieben, vorbereiten und erneut ausführen. Übertragen Sie 20 Mikroliter radioaktives RNA-Material in eine neue 1,5-Milliliter-Röhre mit 20 Mikroliter2X-Gel-Ladepuffer.Nach der Vorbereitung der Leiter, inkubieren Sie die Proben bei 70 Grad Celsius für 15 Minuten. Waschen Sie die Brunnen des Gels noch einmal unmittelbar vor dem Probenladen durch Pipettierpuffer aus den Geltanks hinunter in die Brunnen des Gels. Dann 20 Mikroliter der vorbereiteten Leiter, 20 Mikroliter der Proben und 20 Mikroliter 1X Gel-Ladepuffer in die Bahnen des Gels laden.Führen Sie das Gel bei 100 Volt für 60 bis 180 Minuten, abhängig vom Polyacrylamid-Prozentsatz. Sobald das Gel fertig ist, entfernen Sie das Gel aus der Kassette und legen Sie es in eine Box mit 50 Milliliter 1X TBE Puffer mit fünf Mikroliter ultraempfindlichen Nukleinsäure-Gel-Färbung. Inkubieren Sie auf einer Wippe für fünf Minuten, um die RNA zu färben.Nehmen Sie danach das Gel vorsichtig aus der Box und legen Sie es auf den UV-Transilluminator des Gelbildgebungssystems mit den Brunnen nach oben und der Leiter auf der linken Seite. Fokussieren Sie die Kamera auf das Gel, schalten Sie das UV-Licht ein und nehmen Sie ein Bild des Gels auf. Deaktivieren Sie dann die UV-Bestrahlung, und speichern Sie das Bild als TIFF-Datei.Legen Sie das Gel wieder in die Box, entfernen Sie den TBE und fixieren Sie das Gel mit 50 Milliliter Befestigungslösung auf einer Wippe bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Als nächstes bewegen Sie das Gel vorsichtig in eine frische Blackbox mit 25 Millilitern der autoradiographischen Verbesserungslösung. 30 Minuten lang auf die Wippe bei Raumtemperatur inkubieren.Heben Sie das Gel vorsichtig an und legen Sie es mit den Brunnen nach oben und der Leiter auf der rechten Seite nach unten auf eine Plastikfolie. Legen Sie zwei Blätter Chromatographiepapier auf die Rückseite des Gels, und drehen Sie den gesamten Stapel. Den Geltrockner auf 80 Grad Celsius vorheizen.Bewegen Sie die Kunststoffabdeckung auf dem Geltrockner zurück. Legen Sie den gesamten Stapel unter die Kunststoffabdeckung und bewegen Sie die Kunststoffabdeckung wieder nach unten, um eine Dichtung zu erstellen. Trocknen Sie das Gel bei 80 Grad Celsius für eine Stunde.Schalten Sie dann den Geltrockner aus, und entfernen Sie den Stapel vorsichtig. Entfernen Sie das Wickel- und zweites Chromatographiepapier. Das restliche Chromatographiepapier mit dem getrockneten Gel in einer Autoradiogrammkassette aufkleben.Fügen Sie in einem dunklen Raum ein Blatt Autoradiographiefilm hinzu. Bewahren Sie die Kassette bei negativen 80 Grad Celsius auf und entwickeln Sie den Film zur richtigen Zeit, abhängig von der Signalintensität. Sobald der Film entwickelt ist, legen Sie ihn auf die Kassette und verwenden Sie einen Labormarker, um die vier Kanten des Gels, jeden Brunnen, und die Position der XC- und BB-Farbstoffe sorgfältig zu markieren.Scannen Sie den Film mit einer Auflösung von 300 oder 600 Pixeln pro Zoll, und speichern Sie das Bild als TIFF-Datei. In dieser Studie wird ein antikörperfreier Test zur Analyse der RNA-Methyltransferase-Aktivität gezeigt. Ein typischer Lauf aus einer In-vitro-Transkriptionsreaktion mit der T7-RNA-Polymerase der 7SK-Kleinkern-RNA zeigt relativ kurze und hochstrukturierte RNA.Es gibt mehrere unerwünschte Bänder, sowohl kürzer als auch länger als 7SK, wahrscheinlich aufgrund zufälliger Transkriptionsinitiierungs- oder Beendigungsereignisse. Aus diesem Grund ist die Gelreinigung nach der In-vitro-Transkriptionsreaktion wichtig, um eine saubere RNA-Probe zu erhalten. An diesem Punkt kann die RNA von Interesse durch ihre Position relativ zur Leiter identifiziert und durch Gelreinigung gereinigt werden.Hier wird ein repräsentativer RNA-Methyltransferase-Assay mit der unteren Grenze der empfohlenen RNA- und Proteinkonzentrationen gezeigt. Dieser Test ermöglicht sowohl quantitative Ergebnisse aus den Szintillationszahlen als auch qualitative Ergebnisse aus dem Autoradiogramm. Hierbei zeigt sich, dass eine methylatierte RNA-Methyltransferase auch U6 methylieren kann. Darüber hinaus hemmt die Bindung des Histones H4 an MePCE, wie kürzlich für 7SK gezeigt, auch die U6-Methylierung.Dies kann sowohl in der Szintillationsanzahl als auch im Autoradiogramm beobachtet werden, was die Robustheit dieses Protokolls zeigt. RNA ist anfällig für Degradation, also stellen Sie bitte sicher, RNase-freie Reagenzien zu verwenden und alle Oberflächen und Geräte gründlich zu reinigen. Die radioaktiv markierte RNA, die aus diesem Methyltransferase-Assay gewonnen wird, kann beispielsweise direkt zur Beurteilung der RNA-Demethylase-Aktivität oder der RNA-Bindungsaktivität durch elektrophoretische Mobilitätsverschiebungs-Assay verwendet werden.Diese Methode ermöglicht es Forschern, die Wirkung verschiedener Faktoren auf die RNA-Methyltransferase-Aktivität zu testen, einschließlich Punktmutationen und Behandlungen mit kleinen Molekülinhibitoren. Bei dieser Methode wird radioaktives Material verwendet, also achten Sie darauf, die entsprechende PSA zu tragen, und seien Sie vorsichtig bei der Handhabung und Entsorgung radioaktiver Stoffe.

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Zuordnung von RNA-RNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von biotinyliertem Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Forschung

Genetik

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transkriptom-Analyse von<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA Sequenzierung Daten durch die Tuxedo Suite auf dem Galaxy-Projekt

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA-Pulldown-Verfahren, RNA-Ziele eine lange nicht-kodierende RNA zu identifizieren

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Beschriftung mit 4-Thiouracil und Quantifizierung der metabolischen synthetisiert neu mRNA als Proxy für RNA-Polymerase II Aktivität

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR Guide RNA Klonen für Säugetier-Systeme

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Künstliche RNA-Polymerase II-Dehnungskomplexe zur Sezieren von co-transkriptionellen RNA-Verarbeitungsereignissen

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...