Name: antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לד ר טורג'ה קאנטי דבנאת על עזרתו בכמקולף. מחקר במעבדה xhemalçe הצ נתמך על ידי משרד הביטחון-Congressionally ביים תוכנית מחקר רפואי-סרטן השד פריצת דרך הפרס (W81XWH-16-1-0352), NIH גרנט R01 GM127802 והתחל כספים מהמכון לסלולר ו ביולוגיה מולקולרית והמכללה למדעי הטבע באוניברסיטת טקסס באוסטין, ארה ב.

1. בתמלול והפריה חוץ גופית של ה-RNA של היעד
<ol><li>שיבוט רצף העניין לפלמידים המכילים T7 ו/או SP6 באמצעות שכפול מולקולרי של טכניקות12 או ערכות.</li>
	<li>שורה על תבנית הדי. אנ. איי. לתמלול שעתוק מחוץ לחומרים
	<ol>
<li>להגביר את רצף העניין על ידי ה-PCR של הפלביניים עם התחל שנועד לכלול את אז?...

<ol>
	<li>Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+histones+to+RNA:+role+of+methylation+in+cancer.">From histones to RNA: role of methylation in cancer.</a> Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).</li><li>Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Who+Watches+the+Watchmen:+Roles+of+RNA+Modifications+in+the+RNA+Interference+Pathway.">Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).</li><li>Mauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+methylation+of+m(6)Am+in+the+5'+cap+controls+mRNA+stability.">Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability.</a> Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability.">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li><li>Pendleton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U6+snRNA+m(6)A+Methyltransferase+METTL16+Regulates+SAM+Synthetase+Intron+Retention.">The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention.</a> Cell. 169 (5), 824-835 (2017).</li><li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'+UTR+m(6)A+Promotes+Cap-Independent+Translation.">5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation.</a> Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(6)-methyladenosine+Modulates+Messenger+RNA+Translation+Efficiency.">N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency.</a> Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).</li><li>Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine+marks+primary+microRNAs+for+processing.">N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing.</a> Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).</li><li>Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RNA+methyltransferase+BCDIN3D+regulates+microRNA+processing.">Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing.</a> Cell. 151 (2), 278-288 (2012).</li><li>Jeronimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+the+protein+interaction+network+for+the+human+transcription+machinery+reveals+the+identity+of+the+7SK+capping+enzyme.">Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme.</a> Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brd4+and+JMJD6-associated+anti-pause+enhancers+in+regulation+of+transcriptional+pause+release.">Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release.</a> Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visual Experimentation. , (2019).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).</li><li>Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+strand+switching+by+T7+RNA+polymerase.">Template strand switching by T7 RNA polymerase.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+active+recombinant+T7+RNA+polymerase+from+E.+coli.">Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).</li><li>Shelton, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+RNA+Methylation+and+Histone-Binding+Activities+of+MePCE+Regulates+P-TEFb+Activation+on+Chromatin.">Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin.</a> Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).</li><li>Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+plasmids+for+producing+RNA+in+vitro+transcripts+with+homogeneous+ends.">General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends.</a> Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).</li><li>Blazer, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Suite+of+Biochemical+Assays+for+Screening+RNA+Methyltransferase+BCDIN3D.">A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D.</a> SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).</li><li>Arango, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+Promotes+Translation+Efficiency.">Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.</a> Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NAT10+is+an+ATP-dependent+RNA+acetyltransferase+responsible+for+N4-acetylcytidine+formation+in+18+S+ribosomal+RNA+(rRNA).">Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).</li></ol>

כאן, שיטה פשוטה ואיתנה עבור אימות מחוץ לחוק של RNA מmethyltransferase פעילות כלפי התעתיקים הספציפיים מדווחים. הצורך מנצל את העובדה כי S-אדנוסיל מתיונין יכול להיות מטרימת על התורם קבוצת מתיל (איור 1), המאפשר RNA מתילאז להיות מזוהה במדויק ללא שימוש של נוגדנים. עם זאת, חשוב לציין שאין אפשרו...

DNA, RNA ו חלבונים כפופים שינויים כי בחוזקה לווסת ביטוי גנים1. בין השינויים הללו מתרחשים הbiopolymers בכל שלוש הפעמים. . בשלושת העשורים האחרונים לעומת זאת, העניין ב-RNA מתילציה הוצת רק לאחרונה לאור התפקידים החשובים שחלבונים הכותבים, מוחקים או מאגד את מחלות ה-RNA של המשחק בפיתוח ובמחלות2. בנוסף לפונקציות ידועות יותר בריבוזומיום שופע והעברת rnas, RNA מתילציה מסלולים להסדיר שליח ספציפי RNA יציבות3,4, החדרת5 ותרגום6,7, מירנה עיבוד8,9 ו הפסקה ושחרור10,11.
כאן, שיטה פשוטה ואיתנה עבור אימות מחוץ לחוק של RNA מתיליראז ' פעילות בהגדרה של מעבדת ביולוגיה מולקולרית מדווחת (מסוכם באיור 1). מחקרים רבים להעריך את הפעילות של RNA מmethyltransferase באמצעות נקודה בכתם עם נוגדן נגד RNA שינוי של עניין. עם זאת, נקודה בכתם אינו מאמת את היושרה של RNA על הדגירה עם ה-RNA מmethyltransferase. זה חשוב כי אפילו זהום קטין של חלבונים רקומביננטי עם נוקלאוסים יכול להוביל חלקי RNA השפלה ותוצאות מייסדים. יתר על כן, אפילו מאוד ספציפי שינוי RNA נוגדנים יכול לזהות RNAs שאינם מוגדרים עם רצפים או מבנים ספציפיים. ה-RNA מתיל מתילאז שדווח כאן מנצל את העובדה כי מתיונין S-אדנוסיל יכול להיות מטרימת על התורם קבוצת מתיל (איור 1), המאפשר RNA מתילמת להיות מזוהה במדויק ללא שימוש בנוגדנים . הוראות מסופקות לתמלול ולטיהור של תעתיק של עניין ובדיקות של מתילציה של התמליל האמור על ידי אנזים הריבית. שיטה זו גמישה ואיתנה, וניתן להתאימו בהתאם לצרכיו של כל פרוייקט נתון. לדוגמה, בתוך מבחנה ומטוהרים RNAs, מסונתז כימית RNAs, אבל גם RNAs הסלולר ניתן להשתמש. הדבר מספק מידע כמותי בצורה של ספירות שניות, כמו גם מידע איכותני על-ידי הצגת היכן בדיוק ה-RNA המתיל פועל על ג'ל. זה יכול לספק תובנה ייחודית לתפקוד של RNA מmethyltransferase, במיוחד בעת שימוש RNAs הסלולר כמו מצע, כפי שהוא מספק שיטה ישירות להתבונן בגודל של RNA או RNAs כי הם מיועדים מתילציה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="851">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10821-015</td>
			<td style="width:353px;">10 bp DNA Ladder kit.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10% Ammonium Persulfate (APS)&#160;</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 &#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">10X TBE Buffer</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22&#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">10X TBS</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">BP1408-1</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H])</td>
			<td style="width:121px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:161px;">NET155V250UC</td>
			<td style="width:353px;">For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= 
			(1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 &#181;M.&#160;&#160; Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4&#176;C, make 20 &#181;L aliquots, and freeze them at -30&#176;C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">RPN11649</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amersham Hyperfilm MP</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">28906846</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beckman Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS6500</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704466</td>
			<td style="width:353px;">Mini Horizontal Electrophoresis System.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:121px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:161px;">4693159001</td>
			<td style="width:353px;">For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion Cell</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">345-9902</td>
			<td>RNase free empty cassette for polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion empty Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1656001</td>
			<td>Vertical midi-format electrophoresis cell.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer</td>
			<td style="width:121px;">DeNovix</td>
			<td style="width:161px;">DS-11-S</td>
			<td style="width:353px;">Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ecoscint Original</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td style="width:161px;">LS-271</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">03-337-1</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer</td>
			<td style="width:121px;">RPI CORP</td>
			<td style="width:161px;">112600</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel pretreatment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel dryer</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1651745</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Gel Loading Buffer II</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM8547</td>
			<td style="width:353px;">For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneCatcher disposable gel excision tips</td>
			<td style="width:121px;">Gel Company</td>
			<td style="width:161px;">NC9431993</td>
			<td>For removing bands from agarose and polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Megascript Kit</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM1333</td>
			<td>For in vitro transcription with T7 RNA polymerase.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Perfectwestern Extralarge Container</td>
			<td style="width:121px;">Genhunter Corporation</td>
			<td style="width:161px;">NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black)</td>
			<td>Gel staining box.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pRZ</td>
			<td style="width:121px;">Addgene</td>
			<td style="width:161px;">#27663</td>
			<td style="width:353px;">Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">74204</td>
			<td style="width:353px;">For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">28704</td>
			<td style="width:353px;">Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Saran Premium Plastic Wrap</td>
			<td style="width:121px;">Saran Wrap</td>
			<td style="width:161px;">Amazon</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Gold</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S11494</td>
			<td>Ultra sensitive nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TE</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">93283-100ML</td>
			<td>10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TEMED</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">110-18-9</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5382000023/5361000038</td>
			<td style="width:353px;">For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td style="width:121px;">life technologies</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:353px;">Kits for fast cloning of Taq polymerase&#8211;amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TURBO DNase (2 U&#8260;&#181;L)</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM2238</td>
			<td>For DNA removal from in vitro transcription reactions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">51456-500G</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Whatman 3MM paper</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">3030-154</td>
			<td style="width:353px;">Chromatography paper for drying gel.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis

ישנם יותר מ 100 שינויים כימיים ברורים של RNA, שני שלישים מהם מורכבים של מתיכי. עניין בשינויים RNA, ובעיקר מתיכי, התפתחה מחדש בשל התפקידים החשובים ששיחקו אנזימים הכותבים ומוחקים אותם בתהליכים ביולוגיים הרלוונטיים למחלות ולסרטן. כאן, רגיש בתוך שיטת החוץ הגופית לניתוח מדויק של פעילות כותב RNA מתילציה על סינתטי או בתוך מבחנה מלאכותית RNAs מסופק. שיטת הפעולה משתמשת בצורה מלאכותית של S-אדנוסיל-מתיונין, וכתוצאה מכך תיוג ישיר של RNA מתיל עם טריציום. האנרגיה הנמוכה של קרינת טריטיום עושה את השיטה בטוחה, ושיטות הקיימות מראש של טריציום הגברה האות, לאפשר לכמת ולהמחיש את רנ א מתיליום ללא שימוש של נוגדנים, אשר נוטים בדרך כלל חפצים. בעוד שיטה זו נכתבת עבור RNA מתילציה, מנופך מעטים לעשות את זה רלוונטי למחקר של שינויים אחרים RNA שיכול להיות מתויג רדיואקטיבית, כגון מרחרחון RNA עם 14C מרחלן מסוג A. בסך הכל, שיטת זה מאפשרת להעריך במהירות RNA מתילציה תנאים, עיכוב עם מעכבי מולקולה קטנה, או את ההשפעה של RNA או מוטציות אנזים, ומספק כלי רב עוצמה כדי לאמת ולהרחיב את התוצאות המתקבלות בתאים.

תגובת שעתוק מחוץ לגופית איור 2 A מייצגת הפעלה טיפוסית מתוך תגובת שעתוק מבחנה עם T7 RNA פולימראז של 7Sk snrna, שהוא קצר יחסית (331 nt) ו-RNA מובנה מאוד. כפי שמוצג על התמונה הגולמית, ישנן מספר להקות לא רצויות, הן קצרות יותר ויותר מ-7SK, ככל הנראה כתוצאה מאירוע חניכה או הפסק...

Watch this Scientific Journal Video about Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis at JoVE.com

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

כאן, אנטי נוגדן בתוך שימוש בלתי מתורבת לניתוח ישיר של פעילות מmethyltransferase על סינתטי או בתוך מבחנה מלאכותית המועתק RNA מתואר.

טיפול ללא נוגדנים עבור RNA מתילטרנספראז ניתוח פעילות

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

ישנם יותר מ -100 שינויים שונים של RNA, שני שליש מהם מתילציות. פרוטוקול זה מספק שיטה לניתוח רגיש ומדויק של פעילות כותב מתילציה RNA. טכניקה קלה לשימוש זו מאפשרת לנו לכמת ולהדמיין RNA מתילציה ללא שימוש בנוגדנים, אשר נוטים בדרך כלל חפצים.הפגנת ההליך תהיה סמנתה שלטון, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך זה, הגדר את הבדיקה RNA 100 מיקרוליטר מתילטרנספראז בצינור 1.5 מיליליטר על קרח, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. Vortex הצינור לערבב ביסודיות, צנטריפוגה ב 200 פעמים g במשך חמש שניות כדי לאסוף את הפתרון בתחתית הצינור.דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לאחר מכן, נקה את התגובה באמצעות טיהור עמודות, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לבצע את ספירת ההטיה הנוזלית, הגדר את ארון התקשורת של ספירת ההיתוך עם בקבוקון אחד לכל דגימה, בקבוקון אחד למדידת רקע ובקבוקון אחד לבדיקת ההחלקה.מלאו את הבקבוקונים בחמישה מיליליטר של פתרון ספירת תבליט. הוסף 10 מיקרוליטרים של כל דגימת RNA רדיואקטיבית אלוט לתוך בקבוקון אחד. מהדקים את המכסה ומערבבים בעדינות.כדי להכין את בקבוקוני מבחן ההחלקה, יש לשפשף ביסודיות צמר גפן על כל המשטחים והציוד המשמשים במהלך ההליך. מוסיפים את המטילים האלה לבקבוקונים המלאים בתתווית תוסף, ומהדקים את המכסה. כדי להפעיל את הדגימות על מונה ההצטיינים, פתח את מכסה המנוע של המונה, הכנס את ארון התקשורת למכונה וסגור את מכסה המנוע.בחר ספירת ארון תקשורת בודד. בחר בחר תוכנית משתמש. בחר או צור תוכנית המודדת טיטוריום למשך 60 שניות והתן ללחץ על ארון תקשורת של Count.חזור על ספירת ההטיה שלוש פעמים. לאחר מכן, להכין ולהפעיל מחדש ג'ל פוליאקרילמיד urea denaturing, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. העבר 20 מיקרוליטרים של חומר RNA רדיואקטיבי לצינור חדש של 1.5 מיליליטר המכיל 20 מיקרוליטרים של חיץ טעינת ג'ל 2X.לאחר הכנת הסולם, הדגירה את הדגימות ב 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לשטוף את בארות של הג'ל פעם נוספת מיד לפני הטעינה מדגם על ידי חיץ pipetting ממיכלי ג'ל למטה לתוך בארות של הג'ל. לאחר מכן, לטעון 20 microliters של הסולם מוכן, 20 microliters של הדגימות, ו 20 microliters של חיץ 1X ג'ל טעינה לתוך הנתיבים של הג'ל.הפעל את הג'ל ב 100 וולט במשך 60 עד 180 דקות, בהתאם לאחוז פוליאקרילמיד. לאחר שהג'ל סיים לפעול, הסר את הג'ל מהקלטת והצב אותו בקופסה המכילה 50 מיליליטר של חיץ TBE 1X עם חמישה מיקרוליטרים של כתם ג'ל חומצת גרעין רגיש במיוחד. דגירה על נדנדה במשך חמש דקות כדי להכתים את RNA.לאחר מכן, מוציאים בזהירות את הג'ל מהתיבה, ומ מניחים אותו על טרנסילומינטור UV של מערכת ההדמיה ג'ל עם הבאר למעלה ואת הסולם בצד שמאל. למקד את המצלמה על הג'ל, להפעיל את אור UV, ולצלם את הג'ל. לאחר מכן, כבה את חשיפת UV ושמור את התמונה כקובץ TIFF.מניחים את הג'ל בחזרה לתוך התיבה, להסיר את TBE, ולתקן את הג'ל עם 50 מיליליטר של פתרון תיקון על נדנדה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר מכן, בעדינות להעביר את הג'ל לקופסה שחורה טרייה המכילה 25 מיליליטר של פתרון שיפור האוטוביוגרפיה. דגירה על הנדנדה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.מרימים בעדינות את הג'ל, ומ מניחים אותו עם הפנים כלפי מטה על גיליון של ניילון נצמד עם בארות למעלה ואת הסולם בצד ימין. מניחים שני גיליונות של נייר כרומטוגרפיה על גב הג'ל, ולהפוך את הערימה כולה. מחממים מראש את מייבש הג'ל ל-80 מעלות.מזיזים את כיסוי הפלסטיק על מייבש הג'ל לאחור. הכנס את הערימה כולה מתחת לכיסוי הפלסטיק, והזז את כיסוי הפלסטיק בחזרה למטה כדי ליצור חותם. יבש את הג'ל ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לאחר מכן, לכבות את מייבש ג'ל, בעדינות להסיר את הערימה. הסר את נייר העטיפה והכרומטוגרפיה השני. מקליטים את נייר הכרומטוגרפיה הנותר עם הג'ל המיובש בקלטת אוטוביוגרפיה.בחדר חשוך, הוסף גיליון אחד של סרט אוטוביוגרפיה. אחסן את הקלטת ב 80 מעלות צלזיוס שליליות, ולפתח את הסרט בזמן המתאים, בהתאם לעוצמת האות. לאחר שהסרט מפותח, מניחים אותו על גבי הקלטת ולהשתמש סמן מעבדה כדי לסמן בזהירות את ארבעת הקצוות של הג'ל, כל באר, ואת המיקום של XC ו BB צבעים.סרוק את הסרט ברזולוציה של 300 או 600 פיקסלים לאינץ', ושמור את התמונה כקובץ TIFF. במחקר זה, בדיקת נוגדנים ללא הוכח לנתח פעילות RNA מתילטרנספראז. ריצה טיפוסית מתגובת שעתוק במבחנה עם פולימראז T7 RNA של RNA גרעיני קטן 7SK מראה RNA קצר יחסית מובנה מאוד.ישנן להקות לא רצויות מרובות, קצרות ואותר מ- 7SK, ככל הנראה כתוצאה מאירועי אתחול או סיום אקראיים של שעתוק. בגלל זה, טיהור ג'ל בעקבות תגובת שעתוק במבחנה חשוב להשיג מדגם RNA נקי. בשלב זה, RNA של עניין יכול להיות מזוהה על ידי מיקומו יחסית לסולם ומטוהר על ידי טיהור ג'ל.RNA ייצוגי methyltransferase לבדוק באמצעות הגבול התחתון של RNA מומלץ ריכוזי חלבון מוצג כאן. בדיקה זו מאפשרת הן תוצאות כמותיות מספירת ההטיה, והן תוצאות איכותיות מההתדרדרות האוטו-רדיום. כאן, מתילרנספראז RNA ידוע מתילאט 7SK מוצג להיות מסוגל גם מתילאט U6. יתר על כן, כפי שהוצג לאחרונה עבור 7SK, מחייב של היסטון H4 כדי MePCE גם מעכב מתילציה U6.ניתן לראות זאת הן בספירת הנצנוץ והן ב autoradiogram, מראה את החוסן של פרוטוקול זה. RNA רגיש להשפלה, לכן הקפד להשתמש ריאגנטים ללא RNase ולנקות ביסודיות את כל המשטחים והציוד. RNA שכותרתו רדיואקטיבית המתקבלת מהערכה זו methyltransferase ניתן להשתמש ישירות כדי להעריך פעילות RNA demethylase או פעילות מחייבת RNA על ידי מסמן שינוי ניידות אלקטרופורטית, למשל.שיטה זו מאפשרת לחוקרים לבדוק את ההשפעה של גורמים שונים על פעילות RNA מתילטרנספראז, כולל מוטציות נקודתיות וטיפולי מעכבי מולקולות קטנות. שיטה זו משתמשת בחומר רדיואקטיבי, כדי להיות בטוח ללבוש את PPE המתאים, ולהיות זהיר במהלך טיפול סילוק של חומרים רדיואקטיביים.

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic ניתוח<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA רצף נתונים באמצעות Suite טוקסידו על פרויקט גלקסי

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

גילוי הכמותיים למחצה של RNA תלוית RNA פולימראז פעילות החלבון רוורס טרנסקריפטאז טלומראז אנושי

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

הליך RNA הנפתח כדי לזהות מטרות RNA לונג ללא קידוד RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR מדריך ה-RNA שיבוט בתרבית של מערכות

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

RNA מלאכותי פולימראז השני מכלולי התארכות לניתוח אירועים בעיבוד RNA

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...