Name: antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00
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लेखक ों को केमड्रा के साथ उनकी मदद के लिए डॉ. Xhemale प्रयोगशाला में अनुसंधान रक्षा विभाग द्वारा समर्थित है - कांग्रेस द्वारा निर्देशित चिकित्सा अनुसंधान कार्यक्रम - स्तन कैंसर निर्णायक पुरस्कार (W81XWH-16-1-0352), NIH अनुदान R01 GM127802 और सेलुलर संस्थान से शुरू धन और आणविक जीव विज्ञान और ऑस्टिन, संयुक्त राज्य अमेरिका में टेक्सास विश्वविद्यालय में प्राकृतिक विज्ञान के कॉलेज.

1. इन विट्रो प्रतिलेखन और लक्ष्य आरएनए के जेल शुद्धिकरण में
<ol><li>स्थापित आणविक क्लोनिंग तकनीक12 या किट का उपयोग कर T7 और/या SP6 प्रमोटरों युक्त प्लाज्मिड में ब्याज के अनुक्रम क्लोन.</li>
	<li>इन विट्रो ?...

<ol>
	<li>Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+histones+to+RNA:+role+of+methylation+in+cancer.">From histones to RNA: role of methylation in cancer.</a> Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).</li><li>Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Who+Watches+the+Watchmen:+Roles+of+RNA+Modifications+in+the+RNA+Interference+Pathway.">Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).</li><li>Mauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+methylation+of+m(6)Am+in+the+5'+cap+controls+mRNA+stability.">Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability.</a> Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability.">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li><li>Pendleton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U6+snRNA+m(6)A+Methyltransferase+METTL16+Regulates+SAM+Synthetase+Intron+Retention.">The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention.</a> Cell. 169 (5), 824-835 (2017).</li><li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'+UTR+m(6)A+Promotes+Cap-Independent+Translation.">5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation.</a> Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(6)-methyladenosine+Modulates+Messenger+RNA+Translation+Efficiency.">N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency.</a> Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).</li><li>Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine+marks+primary+microRNAs+for+processing.">N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing.</a> Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).</li><li>Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RNA+methyltransferase+BCDIN3D+regulates+microRNA+processing.">Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing.</a> Cell. 151 (2), 278-288 (2012).</li><li>Jeronimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+the+protein+interaction+network+for+the+human+transcription+machinery+reveals+the+identity+of+the+7SK+capping+enzyme.">Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme.</a> Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brd4+and+JMJD6-associated+anti-pause+enhancers+in+regulation+of+transcriptional+pause+release.">Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release.</a> Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visual Experimentation. , (2019).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).</li><li>Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+strand+switching+by+T7+RNA+polymerase.">Template strand switching by T7 RNA polymerase.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+active+recombinant+T7+RNA+polymerase+from+E.+coli.">Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).</li><li>Shelton, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+RNA+Methylation+and+Histone-Binding+Activities+of+MePCE+Regulates+P-TEFb+Activation+on+Chromatin.">Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin.</a> Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).</li><li>Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+plasmids+for+producing+RNA+in+vitro+transcripts+with+homogeneous+ends.">General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends.</a> Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).</li><li>Blazer, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Suite+of+Biochemical+Assays+for+Screening+RNA+Methyltransferase+BCDIN3D.">A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D.</a> SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).</li><li>Arango, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+Promotes+Translation+Efficiency.">Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.</a> Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NAT10+is+an+ATP-dependent+RNA+acetyltransferase+responsible+for+N4-acetylcytidine+formation+in+18+S+ribosomal+RNA+(rRNA).">Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).</li></ol>

यहाँ, विशिष्ट प्रतिलिपियों की ओर आरएनए मिथाइलट्रांसफरेज गतिविधि के इन विट्रो सत्यापन के लिए एक सरल और मजबूत विधि की सूचना दी गई है। परख इस तथ्य का लाभ उठाती है कि एस-एडेनोसिल मेथियोनीन को मिथाइल समूह द?...

डीएनए, आरएनए और प्रोटीन संशोधन है कि कसकर जीन अभिव्यक्ति1को विनियमित करने के अधीन हैं. इन संशोधनों में, मिथाइलेशन सभी तीन जैवबहुलकों पर पाए जाते हैं। पिछले तीन दशकों के दौरान डीएनए और प्रोटीन मिथाइलेशन का बहुत अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है। इसके विपरीत, आरएनए मिथाइलेशन में रुचि हाल ही में महत्वपूर्ण भूमिकाओं के प्रकाश में राज ित की गई है कि प्रोटीन जो विकास और रोग2में आरएनए मेथिलेशन लिखते हैं, मिटाते हैं या बांधते हैं। प्रचुर मात्रा में राइबोसोमल और स्थानांतरण आरएनए में बेहतर ज्ञात कार्यों के अलावा, आरएनए मिथाइलेशन रास्ते विशिष्ट दूत आरएनए स्थिरता को विनियमित3,4, जोड़5 और अनुवाद6,7, मिर्ना प्रसंस्करण8,9 और प्रतिलेखन ीय ठहराव और रिलीज10,11.
यहाँ, आण्विक जीव विज्ञान प्रयोगशाला की स्थापना में आरएनए मिथाइलट्रांसफरेज गतिविधि के इन विट्रो सत्यापन के लिए एक सरल और मजबूत विधि की सूचना दी गई है (चित्र 1में संक्षिप्त)। कई अध्ययन ब्याज के आरएनए संशोधन के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ डॉट-ब्लॉट के माध्यम से एक आरएनए मिथाइलट्रांसफर्स की गतिविधि का आकलन करते हैं। तथापि, डॉट ब्लॉट आरएनए मिथाइलट्रांसफर्स के साथ ऊष्मायन पर आरएनए की अखंडता की पुष्टि नहीं करता है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि nucleases के साथ रिकॉमबिनेंट प्रोटीन की भी मामूली संदूषण आंशिक आरएनए गिरावट और confounding परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, यहां तक कि अत्यधिक विशिष्ट आरएनए संशोधन एंटीबॉडी विशिष्ट दृश्यों या संरचनाओं के साथ असंशोधित आरएनए को पहचान सकते हैं। इन विट्रो आरएनए मेथिलट्रांसफरेज परख यहाँ रिपोर्ट इस तथ्य का लाभ लेता है कि एस-एडेनोसिल मेथियोनीन को मिथाइल समूह दाता पर tritiated किया जा सकता है (चित्र 1), मेथिलेटेड आरएनए के लिए एंटीबॉडी के उपयोग के बिना सही तरीके से पता लगाया जा सकता है . निर्देश इन विट्रो प्रतिलेखन और ब्याज की एक प्रतिलिपि के शुद्धि और ब्याज के एंजाइम द्वारा कहा प्रतिलिपि के मिथाइलेशन के परीक्षण के लिए प्रदान की जाती हैं. इस विधि लचीला और मजबूत है, और किसी भी परियोजना की जरूरतों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, इन विट्रो लिखित और शुद्ध आरएनए, रासायनिक संश्लेषित आरएनए, लेकिन सेलुलर आरएनए का भी उपयोग किया जा सकता है। इस परख scintillation मायने रखता है के रूप में मात्रात्मक जानकारी प्रदान करता है, साथ ही गुणात्मक जानकारी दिखा रहा है, जहां वास्तव में methylated आरएनए एक जेल पर चलाता है. यह एक आरएनए methyltransferase के समारोह में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, विशेष रूप से जब एक सब्सट्रेट के रूप में सेलुलर आरएनए का उपयोग कर, के रूप में यह सीधे आरएनए या आरएनए कि मिथाइल के लिए लक्षित कर रहे हैं के आकार का निरीक्षण करने के लिए एक विधि प्रदान करता है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="851">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10821-015</td>
			<td style="width:353px;">10 bp DNA Ladder kit.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10% Ammonium Persulfate (APS)&#160;</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 &#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">10X TBE Buffer</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22&#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">10X TBS</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">BP1408-1</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H])</td>
			<td style="width:121px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:161px;">NET155V250UC</td>
			<td style="width:353px;">For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= 
			(1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 &#181;M.&#160;&#160; Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4&#176;C, make 20 &#181;L aliquots, and freeze them at -30&#176;C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">RPN11649</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amersham Hyperfilm MP</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">28906846</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beckman Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS6500</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704466</td>
			<td style="width:353px;">Mini Horizontal Electrophoresis System.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:121px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:161px;">4693159001</td>
			<td style="width:353px;">For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion Cell</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">345-9902</td>
			<td>RNase free empty cassette for polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion empty Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1656001</td>
			<td>Vertical midi-format electrophoresis cell.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer</td>
			<td style="width:121px;">DeNovix</td>
			<td style="width:161px;">DS-11-S</td>
			<td style="width:353px;">Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ecoscint Original</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td style="width:161px;">LS-271</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">03-337-1</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer</td>
			<td style="width:121px;">RPI CORP</td>
			<td style="width:161px;">112600</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel pretreatment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel dryer</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1651745</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Gel Loading Buffer II</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM8547</td>
			<td style="width:353px;">For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneCatcher disposable gel excision tips</td>
			<td style="width:121px;">Gel Company</td>
			<td style="width:161px;">NC9431993</td>
			<td>For removing bands from agarose and polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Megascript Kit</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM1333</td>
			<td>For in vitro transcription with T7 RNA polymerase.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Perfectwestern Extralarge Container</td>
			<td style="width:121px;">Genhunter Corporation</td>
			<td style="width:161px;">NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black)</td>
			<td>Gel staining box.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pRZ</td>
			<td style="width:121px;">Addgene</td>
			<td style="width:161px;">#27663</td>
			<td style="width:353px;">Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">74204</td>
			<td style="width:353px;">For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">28704</td>
			<td style="width:353px;">Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Saran Premium Plastic Wrap</td>
			<td style="width:121px;">Saran Wrap</td>
			<td style="width:161px;">Amazon</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Gold</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S11494</td>
			<td>Ultra sensitive nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TE</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">93283-100ML</td>
			<td>10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TEMED</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">110-18-9</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5382000023/5361000038</td>
			<td style="width:353px;">For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td style="width:121px;">life technologies</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:353px;">Kits for fast cloning of Taq polymerase&#8211;amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TURBO DNase (2 U&#8260;&#181;L)</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM2238</td>
			<td>For DNA removal from in vitro transcription reactions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">51456-500G</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Whatman 3MM paper</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">3030-154</td>
			<td style="width:353px;">Chromatography paper for drying gel.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis

आरएनए के 100 से अधिक रासायनिक रूप से अलग संशोधन हैं, जिनमें से दो तिहाई मेथिलेशन से मिलकर बनता है। आरएनए संशोधनों में रुचि, और विशेष रूप से मिथाइलेशन, एंजाइमों कि लिखने और उन्हें रोग और कैंसर के लिए प्रासंगिक जैविक प्रक्रियाओं में मिटा द्वारा निभाई महत्वपूर्ण भूमिकाओं के कारण फिर से उभर गया है. यहाँ, सिंथेटिक या इन इन विट्रो लिखित आरएनए पर आरएनए मिथाइलेशन लेखक गतिविधि के सटीक विश्लेषण के लिए इन विट्रो परख प्रदान की गई है। इस परख एस-एडेनोसिल-मेथियोनीन के एक tritiated रूप का उपयोग करता है, जिसके परिणामस्वरूप ट्राइटियम के साथ मेथिलेटेड आरएनए की सीधी लेबलिंग होती है। ट्राइटियम विकिरण की कम ऊर्जा विधि को सुरक्षित बनाती है, और ट्राइटियम संकेत प्रवर्धन के पूर्व-मौजूदा तरीकों, यह संभव मात्रा निर्धारित करने के लिए और एंटीबॉडी के उपयोग के बिना methylated आरएनए कल्पना करने के लिए, जो आमतौर पर कलाकृतियों के लिए प्रवण हैं बनाते हैं। हालांकि इस विधि आरएनए मिथाइलेशन के लिए लिखा गया है, कुछ tweaks यह अन्य आरएनए संशोधनों कि रेडियोधर्मी लेबल किया जा सकता है के अध्ययन के लिए लागू करते हैं, जैसे आरएनए एसिटाइलेशन के साथ 14सी एसिटाइल कोएंजाइम ए कुल मिलाकर, इस परख जल्दी आरएनए का आकलन करने के लिए अनुमति देता है methylation शर्तों, छोटे अणु inhibitors, या आरएनए या एंजाइम उत्परिवर्ती के प्रभाव के साथ निषेध, और सत्यापित करने और कोशिकाओं में प्राप्त परिणामों का विस्तार करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है.

इन विट्रो प्रतिलेखन अभिक्रिया चित्र 2 ए 7SK SnRNA के T7 आरएनए पॉलिमरेज के साथ एक इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया से एक ठेठ चलाने का प्रतिनिधित्व करता है, जो एक अपेक्षाकृत कम है (331 nt) और ?...

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Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

यहाँ, सिंथेटिक या इन इन इन इन विट्रो लिखित आरएनए पर मिथाइलट्रांसफरेज गतिविधि के प्रत्यक्ष विश्लेषण के लिए इन विट्रो परख में एक एंटीबॉडी मुक्त वर्णित है।

आरएनए मिथाइलट्रांसफरेज गतिविधि विश्लेषण के लिए एंटीबॉडी मुक्त परख

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

आरएनए के 100 से अधिक अलग-अलग संशोधन हैं, जिनमें से दो तिहाई मिथाइलेशन हैं। यह प्रोटोकॉल आरएनए मिथाइलेशन लेखक गतिविधि के संवेदनशील और सटीक विश्लेषण के लिए एक विधि प्रदान करता है। यह आसान उपयोग तकनीक हमें एंटीबॉडी के उपयोग के बिना मेथिलेटेड आरएनए की मात्रा निर्धारित करने और कल्पना करने की अनुमति देती है, जो आमतौर पर कलाकृतियों से ग्रस्त होते हैं।प्रक्रिया का प्रदर्शन सामंथा शेल्टन, मेरी प्रयोगशाला से एक स्नातक छात्र होगा । इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, 100-माइक्रोलीटर आरएनए मिथाइलट्रांसफरेज परख को बर्फ पर 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थापित करें, जैसा कि टेक्स्ट प्रोटोकॉल में उल्लिखित है। भंवर ट्यूब अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए, और ट्यूब के नीचे समाधान इकट्ठा करने के लिए पांच सेकंड के लिए 200 बार जी पर अपकेंद्रित्र।दो घंटे तक ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर, पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित कॉलम शुद्धि का उपयोग करके प्रतिक्रिया को साफ करें। तरल प्रस्फुटन गिनती करने के लिए, प्रति नमूना एक शीशी के साथ प्रस्फुटन गिनती रैक स्थापित करें, एक पृष्ठभूमि माप के लिए एक शीशी, और स्वाइप परीक्षण के लिए एक शीशी।प्रस्फुटन गिनती समाधान के पांच मिलीलीटर के साथ शीशियों को भरें। प्रत्येक eluted रेडियोधर्मी आरएनए नमूने के 10 माइक्रोलीटर एक शीशी में जोड़ें । ढक्कन को कस लें, और धीरे-धीरे मिलाएं।स्वाइप टेस्ट शीशियों को तैयार करने के लिए, प्रक्रिया के दौरान उपयोग की जाने वाली सभी सतहों और उपकरणों पर कपास झाड़ू को अच्छी तरह से रगड़ें। इन झाड़ू को प्रस्फुटन समाधान से भरी शीशियों में जोड़ें, और ढक्कन को कस लें। प्रस्फुटन काउंटर पर नमूनों को चलाने के लिए, काउंटर हुड खोलें, रैक को मशीन में डालें, और हुड को बंद करें।गिनती एकल रैक का चयन करें। चुनिंदा यूजर प्रोग्राम चुनें। चुनें या एक प्रोग्राम है कि 60 सेकंड के लिए ट्राइटियम उपाय बनाने के लिए, और गिनती रैक मारा.प्रस्फुटन गिनती को तीन बार दोहराएं। इसके बाद, टेक्स्ट प्रोटोकॉल में उल्लिखित यूरिया डेन्चरिंग पॉलीएक्रायमाइड जेल तैयार करें और फिर से चलाएं। रेडियोधर्मी आरएनए सामग्री के 20 माइक्रोलीटर को एक नई 1.5-मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 2X जेल-लोडिंग बफर के 20 माइक्रोलीटर होते हैं।सीढ़ी तैयार करने के बाद 15 मिनट तक 70 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें। जेल के कुओं में नीचे जेल टैंक से बफर पाइपिंग द्वारा नमूना लोडिंग से पहले एक बार और तुरंत जेल के कुओं को धोएं। फिर, तैयार सीढ़ी के 20 माइक्रोलीटर, नमूनों के 20 माइक्रोलीटर, और 1X जेल-लोडिंग बफर के 20 माइक्रोलीटर को जेल की गलियों में लोड करें।पॉलीएक्रेलैमाइड प्रतिशत के आधार पर 60 से 180 मिनट के लिए 100 वोल्ट पर जेल चलाएं। एक बार जेल चल रहा है, कैसेट से जेल को हटा दें और इसे अल्ट्रासेंसिटिव न्यूक्लिक एसिड जेल दाग के पांच माइक्रोलीटर के साथ 1X TBE बफर के 50 मिलीलीटर वाले बॉक्स में रखें। आरएनए को दाग देने के लिए पांच मिनट तक एक घुमाव पर इनक्यूबेट ।इसके बाद, जेल को बॉक्स से बाहर निकालें, और इसे कुआं और बाईं ओर सीढ़ी के साथ जेल इमेजिंग सिस्टम के यूवी ट्रांसिल्यूमिनेटर पर रखें। जेल पर कैमरे को फोकस करें, यूवी लाइट चालू करें, और जेल की छवि लें। फिर, यूवी एक्सपोजर बंद करें, और इमेज को झगड़ा फ़ाइल के रूप में सहेजें।जेल को बॉक्स में वापस रखें, TBE को हटा दें, और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक घुमाव पर समाधान फिक्सिंग के 50 मिलीलीटर के साथ जेल को ठीक करें। इसके बाद, धीरे-धीरे जेल को एक ताजा ब्लैक बॉक्स में ले जाएं जिसमें ऑटोरेडियोग्राफी बढ़ाने वाले समाधान के 25 मिलीलीटर होते हैं। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर घुमाव पर इनक्यूबेट।धीरे से जेल उठा, और यह चेहरा नीचे कुओं के साथ प्लास्टिक की चादर की एक चादर पर और दाहिने हाथ की ओर सीढ़ी पर जगह है । जेल के पीछे क्रोमेटोग्राफी पेपर की दो शीट रखें, और पूरे स्टैक को फ्लिप करें। जेल ड्रायर को 80 डिग्री सेल्सियस तक प्री-हीट करें।प्लास्टिक कवर को जेल ड्रायर पर वापस ले जाएं। प्लास्टिक कवर के नीचे पूरे ढेर डालें, और एक सील बनाने के लिए प्लास्टिक कवर को वापस नीचे ले जाएं। एक घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर जेल सूखी।फिर, जेल ड्रायर बंद करें, और धीरे-धीरे स्टैक को हटा दें। रैप और दूसरा क्रोमेटोग्राफी पेपर निकालें। एक ऑटोरेडियोग्राम कैसेट में सूखे जेल के साथ शेष क्रोमेटोग्राफी पेपर को टेप करें।एक अंधेरे कमरे में, ऑटोरेडियोग्राफी फिल्म की एक चादर जोड़ें। नकारात्मक 80 डिग्री सेल्सियस पर कैसेट स्टोर करें, और सिग्नल तीव्रता के आधार पर उचित समय पर फिल्म विकसित करें। एक बार जब फिल्म विकसित हो जाती है, तो इसे कैसेट के शीर्ष पर रखें और जेल के चार किनारों, प्रत्येक अच्छी तरह से, और एक्ससी और बीबी रंगों की स्थिति को ध्यान से चिह्नित करने के लिए एक प्रयोगशाला मार्कर का उपयोग करें।फिल्म को या तो 300 या 600 पिक्सल प्रति इंच के रेजोल्यूशन पर स्कैन करें और इमेज को टिफ फाइल के तौर पर सेव करें। इस अध्ययन में, आरएनए मिथाइलट्रांसफेरेज गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए एक एंटीबॉडी-मुक्त परख का प्रदर्शन किया जाता है। 7SK छोटे परमाणु आरएनए के T7 आरएनए पॉलीमरेज के साथ एक इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया से एक विशिष्ट रन अपेक्षाकृत कम और अत्यधिक संरचित आरएनए दिखाता है।7SK से कम और लंबे समय तक कई अवांछित बैंड हैं, शायद यादृच्छिक ट्रांसक्रिप्शनल दीक्षा या समाप्ति की घटनाओं के परिणामस्वरूप। इस वजह से, इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया के बाद जेल शुद्धिकरण एक साफ आरएनए नमूना प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस बिंदु पर, ब्याज की आरएनए को सीढ़ी के सापेक्ष इसके स्थान से पहचाना जा सकता है और जेल शुद्धि द्वारा शुद्ध किया जा सकता है।अनुशंसित आरएनए और प्रोटीन सांद्रता की निचली सीमा का उपयोग करके एक प्रतिनिधि आरएनए मिथाइलट्रांसफेरेज परख यहां दिखाई जाती है। यह परख प्रस्फुटन गिनती से दोनों मात्रात्मक परिणामों के साथ-साथ ऑटोरेडियोग्राम से गुणात्मक परिणामों के लिए अनुमति देती है। यहां, मेथिलेट 7SK के लिए जाना जाने वाला आरएनए मिथाइलट्रांसफरेज भी मेथिलेट U6 में सक्षम होना दिखाया गया है। इसके अलावा, जैसा कि हाल ही में 7SK के लिए दिखाया गया है, हिप्थेन एच 4 को मेपीसीई के लिए बाध्यकारी भी U6 मिथाइलेशन को रोकता है।यह इस प्रोटोकॉल की मजबूती को दिखाते हुए प्रस्फुटन गिनती और ऑटोरेडियोग्राम दोनों में देखा जा सकता है। आरएनए गिरावट के लिए अतिसंवेदनशील है, इसलिए कृपया RNase-मुक्त अभिकर् में उपयोग करना सुनिश्चित करें और सभी सतहों और उपकरणों को अच्छी तरह से साफ करें। इस मिथाइलट्रांसफेरेज परख से प्राप्त रेडियोधर्मी लेबल आरएनए का उपयोग सीधे आरएनए डेमेथाइलेज गतिविधि या इलेक्ट्रोफोरेटिक मोबिलिटी शिफ्ट परख द्वारा आरएनए बाध्यकारी गतिविधि का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए।यह विधि शोधकर्ताओं को आरएनए मिथाइलट्रांसफरेज गतिविधि पर विभिन्न कारकों के प्रभाव का परीक्षण करने की अनुमति देती है, जिसमें बिंदु उत्परिवर्तन और छोटे अणु अवरोधक उपचार शामिल हैं। यह विधि रेडियोधर्मी सामग्री का उपयोग करती है, इसलिए उपयुक्त पीपीई पहनना सुनिश्चित करें, और रेडियोधर्मी सामग्रियों से निपटने और निपटान के दौरान सावधान रहें।

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

वैश्विक बायोटिनिलेटेड Psoralen का उपयोग आरएनए-आरएनए अंतरण मैपिंग

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

की transcriptomic विश्लेषण<em&gt; स</em&gt;।<em&gt; एलिगेंस</emआकाशगंगा परियोजना पर टक्सेडो सूट के माध्यम से&gt; शाही सेना अनुक्रमण डाटा

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

मानव टेलोमिरेज रिवर्स Transcriptase प्रोटीन की आरएनए-निर्भर आरएनए पोलीमरेज़ गतिविधि का अर्द्ध मात्रात्मक पता लगाना

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

आरएनए Pull-डाउन प्रक्रिया एक लंबी गैर-कोडिंग आरएनए के आरएनए लक्ष्यों की पहचान करने के लिए

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

त्रुटि-सही डीएनए और आरएनए अनुक्रमण का उपयोग कर दुर्लभ घटना का पता लगाने

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

वैकल्पिक पूर्व का मात्रात्मक विश्लेषण माउस मस्तिष्क वर्गों में mRNA ब्याह सीटू संकरण परख में आरएनए का उपयोग

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil और आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय गतिविधि के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में नव संश्लेषित mRNA के ठहराव के साथ चयापचय लेबलिंग

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

स्तनधारी सिस्टम्स के लिए CRISPR गाइड आरएनए क्लोनिंग

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

कृत्रिम आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय विस्तार परिसर को-ट्रांसक्रिप्शनल आरएनए प्रोसेसिंग इवेंट्स को अलग करने के लिए

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

बैक्टीरिया में प्रोटीन-आरएनए बाइंडिंग की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक परख

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...