Name: antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00
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著者たちは、ChemDrawに対する彼の助けに対して、トゥルジャ・カンティ・デブナート博士に感謝したいと思います。Xhemalçeラボでの研究は、国防総省によってサポートされています - 議会指向医学研究プログラム - 乳癌ブレークスルー賞(W81XWH-16-1-0352)、NIHグラントR01 GM127802および細胞研究所からのスタートアップ資金と米国オースティンのテキサス大学の分子生物学と自然科学のカレッジ。

1. 標的RNAのインビトロ転写およびゲル精製
<ol><li>確立された分子クローニング技術12またはキットを使用してT7および/またはSP6プロモーターを含むプラスミドに目的の配列をクローンする。</li>
	<li>インビトロ転写のためのDNAテンプレートの線形化
	<ol>
<li>プラスミドのPCRによる関心の配列を、インサートを介してT7プロモーター領域を含むように設計されたプ?...

<ol>
	<li>Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+histones+to+RNA:+role+of+methylation+in+cancer.">From histones to RNA: role of methylation in cancer.</a> Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).</li><li>Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Who+Watches+the+Watchmen:+Roles+of+RNA+Modifications+in+the+RNA+Interference+Pathway.">Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).</li><li>Mauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+methylation+of+m(6)Am+in+the+5'+cap+controls+mRNA+stability.">Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability.</a> Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability.">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li><li>Pendleton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U6+snRNA+m(6)A+Methyltransferase+METTL16+Regulates+SAM+Synthetase+Intron+Retention.">The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention.</a> Cell. 169 (5), 824-835 (2017).</li><li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'+UTR+m(6)A+Promotes+Cap-Independent+Translation.">5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation.</a> Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(6)-methyladenosine+Modulates+Messenger+RNA+Translation+Efficiency.">N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency.</a> Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).</li><li>Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine+marks+primary+microRNAs+for+processing.">N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing.</a> Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).</li><li>Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RNA+methyltransferase+BCDIN3D+regulates+microRNA+processing.">Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing.</a> Cell. 151 (2), 278-288 (2012).</li><li>Jeronimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+the+protein+interaction+network+for+the+human+transcription+machinery+reveals+the+identity+of+the+7SK+capping+enzyme.">Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme.</a> Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brd4+and+JMJD6-associated+anti-pause+enhancers+in+regulation+of+transcriptional+pause+release.">Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release.</a> Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visual Experimentation. , (2019).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).</li><li>Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+strand+switching+by+T7+RNA+polymerase.">Template strand switching by T7 RNA polymerase.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+active+recombinant+T7+RNA+polymerase+from+E.+coli.">Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).</li><li>Shelton, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+RNA+Methylation+and+Histone-Binding+Activities+of+MePCE+Regulates+P-TEFb+Activation+on+Chromatin.">Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin.</a> Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).</li><li>Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+plasmids+for+producing+RNA+in+vitro+transcripts+with+homogeneous+ends.">General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends.</a> Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).</li><li>Blazer, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Suite+of+Biochemical+Assays+for+Screening+RNA+Methyltransferase+BCDIN3D.">A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D.</a> SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).</li><li>Arango, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+Promotes+Translation+Efficiency.">Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.</a> Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NAT10+is+an+ATP-dependent+RNA+acetyltransferase+responsible+for+N4-acetylcytidine+formation+in+18+S+ribosomal+RNA+(rRNA).">Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).</li></ol>

ここで、特定の転写物に向けたRNAメチルトランスフェラーゼ活性のインビトロ検証のための簡素かつ堅牢な方法が報告されている。このアッセイは、S-アデノシルメチオニンをメチル基ドナー(図1)でトリチレートできるという事実を利用して、メチル化RNAを抗体を使用せずに正確に検出することができます。しかし、このアッセイは、どの残基または化学基が酵素によ?...

DNA、RNAおよびタンパク質は、遺伝子発現1を厳密に調節する修飾の対象となる。これらの修飾の中で、メチル化は3つの生体高分子すべてに起こる。DNAとタンパク質のメチル化は、過去30年間に非常によく研究されています。対照的に、RNAメチル化への関心は、RNAメチル化を書き込み、消去、または結合するタンパク質が発達および疾患2において果たす重要な役割に照らして、最近再燃したばかりである。豊富なリボソームおよび転写RNAにおけるよりよく知られた機能に加えて、RNAメチル化経路は、特異的メッセンジャーRNA安定性3、4、スプライシング5および翻訳6、7を調節する。miRNA処理8、9および転写休止および放出10、11.
ここで、分子生物学研究室の設定におけるRNAメチルトランスフェラーゼ活性のインビトロ検証のための簡素かつ堅牢な方法が報告されている(図1に要約)。多くの研究は、目的のRNA修飾に対する抗体を有するドットブロットを介してRNAメチルトランスフェラーゼの活性を評価する。しかしながら、ドットブロットは、RNAメチルトランスフェラーゼとのインキュベーション時にRNAの完全性を検証しない。ヌクレアーゼを用いた組換えタンパク質のわずかな汚染でさえ、部分的なRNA分解と交絡の結果につながる可能性があるため、これは重要です。さらに、非常に特異的なRNA修飾抗体でさえ、特定の配列または構造を持つ未修飾RNAを認識することができます。ここで報告されるインビトロRNAメチルトランスフェラーゼアッセイは、S-アデノシルメチオニンをメチル基ドナー上でトリチレートできるという事実を利用し(図1)、メチル化されたRNAを抗体を使用せずに正確に検出できるようにする.インビトロ転写および目的の酵素による前記転写のメチル化の試験の転写および精製のための指示が提供される。この方法は柔軟で堅牢であり、特定のプロジェクトのニーズに応じて調整できます。例えば、インビトロ転写および精製RNA、化学的に合成されたRNA、ならびに細胞RNAを用いることができる。このアッセイは、シンチレーションカウントの形で定量的な情報を提供するだけでなく、メチル化されたRNAがゲル上で正確に実行される場所を示すことによって定性的情報を提供します。これは、特に細胞RNAを基板として使用する場合に、メチル化の標的となるRNAまたはRNAのサイズを直接観察する方法を提供するため、RNAメチルトランスフェラーゼの機能に関するユニークな洞察を提供することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="851">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10821-015</td>
			<td style="width:353px;">10 bp DNA Ladder kit.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10% Ammonium Persulfate (APS)&#160;</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 &#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">10X TBE Buffer</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22&#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">10X TBS</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">BP1408-1</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H])</td>
			<td style="width:121px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:161px;">NET155V250UC</td>
			<td style="width:353px;">For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= 
			(1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 &#181;M.&#160;&#160; Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4&#176;C, make 20 &#181;L aliquots, and freeze them at -30&#176;C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">RPN11649</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amersham Hyperfilm MP</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">28906846</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beckman Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS6500</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704466</td>
			<td style="width:353px;">Mini Horizontal Electrophoresis System.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:121px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:161px;">4693159001</td>
			<td style="width:353px;">For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion Cell</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">345-9902</td>
			<td>RNase free empty cassette for polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion empty Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1656001</td>
			<td>Vertical midi-format electrophoresis cell.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer</td>
			<td style="width:121px;">DeNovix</td>
			<td style="width:161px;">DS-11-S</td>
			<td style="width:353px;">Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ecoscint Original</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td style="width:161px;">LS-271</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">03-337-1</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer</td>
			<td style="width:121px;">RPI CORP</td>
			<td style="width:161px;">112600</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel pretreatment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel dryer</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1651745</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Gel Loading Buffer II</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM8547</td>
			<td style="width:353px;">For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneCatcher disposable gel excision tips</td>
			<td style="width:121px;">Gel Company</td>
			<td style="width:161px;">NC9431993</td>
			<td>For removing bands from agarose and polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Megascript Kit</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM1333</td>
			<td>For in vitro transcription with T7 RNA polymerase.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Perfectwestern Extralarge Container</td>
			<td style="width:121px;">Genhunter Corporation</td>
			<td style="width:161px;">NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black)</td>
			<td>Gel staining box.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pRZ</td>
			<td style="width:121px;">Addgene</td>
			<td style="width:161px;">#27663</td>
			<td style="width:353px;">Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">74204</td>
			<td style="width:353px;">For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">28704</td>
			<td style="width:353px;">Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Saran Premium Plastic Wrap</td>
			<td style="width:121px;">Saran Wrap</td>
			<td style="width:161px;">Amazon</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Gold</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S11494</td>
			<td>Ultra sensitive nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TE</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">93283-100ML</td>
			<td>10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TEMED</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">110-18-9</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5382000023/5361000038</td>
			<td style="width:353px;">For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td style="width:121px;">life technologies</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:353px;">Kits for fast cloning of Taq polymerase&#8211;amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TURBO DNase (2 U&#8260;&#181;L)</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM2238</td>
			<td>For DNA removal from in vitro transcription reactions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">51456-500G</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Whatman 3MM paper</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">3030-154</td>
			<td style="width:353px;">Chromatography paper for drying gel.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis

RNAには100以上の化学的に異なる修飾があり、そのうちの3分の2はメチル化からなる。RNA修飾、特にメチル化への関心は、疾患や癌に関連する生物学的プロセスでそれらを書き、消去する酵素が果たしている重要な役割のために再浮上しました。ここで、合成またはインビトロ転写RNA上のRNAメチル化ライタ活性の正確な分析のためのインビトロアッセイに敏感なアッセイが提供される。このアッセイは、S-アデノシルメチオニンのトリチレートされた形態を使用し、トリチウムを用いてメチル化RNAを直接標識する。トリチウム放射線の低エネルギーは、この方法を安全にし、トリチウム信号増幅の既存の方法により、一般的に人工物になりやすい抗体を使用せずにメチル化RNAを定量化および可視化することを可能にします。この方法はRNAメチル化のために書かれていますが、14CアセチルコエンザイムA.を用いたRNAアセチル化など、放射性標識が可能な他のRNA修飾の研究に適用可能な調整はほとんどありません。メチル化条件、低分子阻害剤による阻害、またはRNAまたは酵素変異体の効果、および細胞で得られた結果を検証し、拡大するための強力なツールを提供する。

インビトロ転写反応 図 2Aは、比較的短い(331 nt)および高度に構造化されたRNAである7SK snRNAのT7 RNAポリメラーゼとのインビトロ転写反応からの典型的な実行を表す。その生の画像に示すように、7SKより短く、長い両方の複数の望ましくないバンドがあり、おそらくランダム転写開始または終了イベントから生じる。このため、インビトロ転写反...

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Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

ここで、合成またはインビトロ転写RNA上のメチルトランスフェラーゼ活性の直接分析のための抗体フリーインインビトロアッセイが記載されている。

RNAメチルトランスフェラーゼ活性分析のための抗体フリーアッセイ

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

RNAには100以上の明確な改変があり、その3分の2はメチル化です。このプロトコルはRNAメチル化ライター活性の敏感で正確な分析のための方法を提供する。この使いやすい技術により、一般的に人工物を起こしやすい抗体を使用せずにメチル化RNAを定量化し、視覚化することができます。手順をデモンストレーションすることは、私の研究室の大学院生であるサマンサ・シェルトンです。この手順を開始するには、テキストプロトコルで概説されているように、氷上の1.5ミリリットルチューブに100マイクロリットルRNAメチルトランスビ転移酵素アッセイを設定します。チューブを完全に混合し、遠心分離機を200回gで5秒間ボルテックスし、チューブ下部の溶液を回収する。2時間摂氏37度でチューブをインキュベートします。次に、テキストプロトコルで概説されているように、カラム精製を用いて反応を浄化する。液体シンチレーションカウントを実行するには、サンプルごとに1つのバイアル、バックグラウンド測定用のバイアル、スワイプテスト用のバイアル1個でシンチレーションカウントラックを設定します。5ミリリットルのシンチレーションカウント溶液でバイアルを充填します。溶出した放射性RNAサンプル10マイクロリットルを1つのバイアルに加えます。蓋を締め、やさしく混ぜます。スワイプテストバイアルを準備するには、手順中に使用されるすべての表面と機器に綿棒を徹底的にこすります。これらの綿棒をシンチレーション溶液で満たしたバイアルに加え、蓋を締めます。シンチレーションカウンターでサンプルを実行するには、カウンターフードを開き、ラックを機械に挿入し、フードを閉じます。[単一ラックをカウント] を選択します。[ユーザー プログラムの選択] を選択します。60 秒間トリチウムを測定するプログラムを選択または作成し、カウント ラックをヒットします。シンチレーションカウントを3回繰り返します。この後、テキストプロトコルで概説されているように、尿素変性ポリアクリルアミドゲルを調製し、再実行する。20マイクロリットルの20マイクロリットルの2Xゲルローディングバッファーを含む新しい1.5ミリリットルチューブに放射性RNA材料の20マイクロリットルを移します。ラダーを準備した後、15分間摂氏70度でサンプルをインキュベートします。ゲルタンクからゲルのウェルにバッファーをピペット処理して、サンプルローディングの直前にゲルのウェルをもう一度洗います。次いで、調製されたラダーの20マイクロリットル、サンプルの20マイクロリットル、および20マイクロリットルの1Xゲルローディングバッファーをゲルのレーンにロードする。ポリアクリルアミドの割合に応じて、ゲルを100ボルトで60〜180分間実行します。ゲルの実行が完了したら、カセットからゲルを取り出し、5マイクロリットルの超高感度核酸ゲル染色を含む1X TBEバッファーの50ミリリットルを含む箱に入れます。ロッカーに5分間インキュベートしてRNAを染色します。この後、慎重に箱からゲルを取り出し、ウェルを上げ、左にはしごを持つゲルイメージングシステムのUVトランイルミニューエーターに置きます。カメラをゲルに合わせ、UV光を点灯し、ゲルの画像を撮ります。次に、UV 露出をオフにして、TIFF ファイルとしてイメージを保存します。ゲルを箱に戻し、TBEを取り出し、室温で50ミリリットルの固定溶液でゲルを固定します。次に、自動ラジオグラフィー増強溶液の25ミリリットルを含む新鮮なブラックボックスにゲルを静かに移動させます。室温でロッカーに30分間インキュベートします。ゲルをそっと持ち上げ、ウェルを上にしてはしごを右側に置いたラップのシートにうつ伏せに置きます。2枚のクロマトグラフィー用紙をゲルの裏面に置き、スタック全体を反転します。ゲルドライヤーを摂氏80度に予熱します。ゲルドライヤーのプラスチックカバーを戻します。プラスチックカバーの下にスタック全体を挿入し、プラスチックカバーを下に戻してシールを作成します。ゲルを摂氏80度で1時間乾燥させます。次に、ゲル乾燥機をオフにし、スタックをそっと取り出します。ラップと2つめのクロマトグラフィー用紙を取り除きます。残りのクロマトグラフィー紙を乾燥したゲルでオートラジオグラムカセットにテープで貼ります。暗い部屋で、オートラジオグラフィーフィルムの1枚を追加します。カセットをマイナス80°Cで保存し、信号強度に応じて適時にフィルムを開発します。フィルムが開発されたら、カセットの上に置き、ラボマーカーを使用してゲルの4つのエッジ、各ウェル、およびXCとBB染料の位置を注意深くマークします。フィルムを 300 ピクセルまたは 600 ピクセル/インチの解像度でスキャンし、TIFF ファイルとして画像を保存します。本研究では、RNAメチルトランスビサイアーゼ活性を解析するための抗体を含まないアッセイが実証された。7SK小核RNAのT7 RNAポリメラーゼとのインビトロ転写反応からの典型的なランは、比較的短く、高度に構造化されたRNAを示す。ランダムな転写開始または終了イベントに起因する可能性が高い、7SKよりも短く、長い、複数の望ましくないバンドがあります。このため、インビトロ転写反応に続くゲル精製は、クリーンなRNAサンプルを得ることが重要である。この時点で、目的のRNAは、ラダーに対するその位置によって同定され、ゲル精製によって精製される。推奨されるRNAおよびタンパク質濃度の下限を用いた代表的なRNAメチルトランスファー酵素アッセイをここに示す。このアッセイは、シンチレーションカウントからの定量的な結果と、オートラジオグラムからの定性的な結果の両方を可能にする。ここで、メチル化7SKに知られているRNAメチルトランスファーーゼは、U6のメチル化も可能であることが示されている。また、最近7SKについて示されるように、MePCEへのヒストンH4の結合もU6メチル化を阻害する。これは、シンチレーションカウントとオートラジオグラムの両方で観察することができ、このプロトコルの堅牢性を示す。RNAは劣化しやすいので、RNaseフリー試薬を使用し、すべての表面や機器を徹底的に洗浄してください。このメチルトランスファーアーゼアッセイから得られた放射性標識RNAは、例えば電気泳動移動シフトアッセイによるRNAデメチル酵素活性またはRNA結合活性を直接評価するために使用することができる。この方法により、研究者は、点突然変異および小分子阻害剤治療を含むRNAメチルトランスビナーゼ活性に対する異なる因子の効果をテストすることができます。この方法では放射性物質を使用するため、適切なPPEを着用し、放射性物質の取り扱いや処分には注意が必要です。

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

ビオチン化ソラレンを用いたRNA-RNA相互作用のマッピング

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

のトランスクリプトーム解析<em&gt; C</em&gt;。<em&gt;エレガンス</emギャラクシープロジェクトのタキシードスイートを通じて&gt; RNAシーケンスデータ

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

テロメラーゼ逆転写酵素蛋白質の RNA 依存 RNA ポリメラーゼ活性の半定量的な検出

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA プルダウン長い非コード RNA の RNA 標的を識別する手順

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

哺乳類システムのクローン作成 CRISPR ガイド RNA

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

共転写RNA処理イベントを解剖するための人工RNAポリメラーゼII伸長複合体

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

細菌におけるタンパク質-RNA結合を定量するためのアッセイ

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...