Name: antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00
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저자는 ChemDraw에 대한 그의 도움에 대한 박사 투르자 칸티 데브나스 에게 감사드립니다. Xhemalçe 실험실에서 연구는 국방부에 의해 지원됩니다 - 의회 지시 의료 연구 프로그램 - 유방암 획기적인 상 (W81XWH-16-1-0352), NIH 그랜트 R01 GM127802 및 셀룰러 연구소의 시작 자금 분자 생물학 및 오스틴, 미국 텍사스 대학에서 자연 과학 대학.

1. 대상 RNA의 생체 외 전사 및 젤 정제
<ol><li>확립된 분자 복제 기술12 또는 키트를 사용하여 T7 및/또는 SP6 프로모터를 함유하는 플라스미드로 관심 의 순서를 복제합니다.</li>
	<li>시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿 선형화
	<ol>
<li>앞서 설명한바와같이, 삽입을 통해 T7 프로모터 영역을 포함하도록 설계된 프라이머를 사용하여 플라스미드의 PCR에 의?...

<ol>
	<li>Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+histones+to+RNA:+role+of+methylation+in+cancer.">From histones to RNA: role of methylation in cancer.</a> Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).</li><li>Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Who+Watches+the+Watchmen:+Roles+of+RNA+Modifications+in+the+RNA+Interference+Pathway.">Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).</li><li>Mauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+methylation+of+m(6)Am+in+the+5'+cap+controls+mRNA+stability.">Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability.</a> Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability.">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li><li>Pendleton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U6+snRNA+m(6)A+Methyltransferase+METTL16+Regulates+SAM+Synthetase+Intron+Retention.">The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention.</a> Cell. 169 (5), 824-835 (2017).</li><li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'+UTR+m(6)A+Promotes+Cap-Independent+Translation.">5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation.</a> Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(6)-methyladenosine+Modulates+Messenger+RNA+Translation+Efficiency.">N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency.</a> Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).</li><li>Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine+marks+primary+microRNAs+for+processing.">N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing.</a> Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).</li><li>Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RNA+methyltransferase+BCDIN3D+regulates+microRNA+processing.">Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing.</a> Cell. 151 (2), 278-288 (2012).</li><li>Jeronimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+the+protein+interaction+network+for+the+human+transcription+machinery+reveals+the+identity+of+the+7SK+capping+enzyme.">Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme.</a> Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brd4+and+JMJD6-associated+anti-pause+enhancers+in+regulation+of+transcriptional+pause+release.">Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release.</a> Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visual Experimentation. , (2019).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).</li><li>Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+strand+switching+by+T7+RNA+polymerase.">Template strand switching by T7 RNA polymerase.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+active+recombinant+T7+RNA+polymerase+from+E.+coli.">Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).</li><li>Shelton, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+RNA+Methylation+and+Histone-Binding+Activities+of+MePCE+Regulates+P-TEFb+Activation+on+Chromatin.">Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin.</a> Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).</li><li>Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+plasmids+for+producing+RNA+in+vitro+transcripts+with+homogeneous+ends.">General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends.</a> Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).</li><li>Blazer, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Suite+of+Biochemical+Assays+for+Screening+RNA+Methyltransferase+BCDIN3D.">A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D.</a> SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).</li><li>Arango, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+Promotes+Translation+Efficiency.">Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.</a> Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NAT10+is+an+ATP-dependent+RNA+acetyltransferase+responsible+for+N4-acetylcytidine+formation+in+18+S+ribosomal+RNA+(rRNA).">Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).</li></ol>

여기서, 특정 전사체를 향한 RNA 메틸트랜스퍼라제 활성의 시험관내 검증을 위한 간단하고 견고한 방법이 보고된다. 이 분석은 S-아데노실 메티오닌이 메틸 기공체에서 삼각화될 수있다는 사실을 활용합니다(그림 1), 메틸화된 RNA가 항체를 사용하지 않고 정확하게 검출될 수 있도록 한다. 그러나,이 분석효소는 어떤 잔기 또는 화학 기가 효소에 의해 메틸화되어 있는지 나타?...

DNA, RNA 및 단백질은 유전자 발현을엄격하게 조절하는 변형의 대상이 된다 1. 이러한 수정 중, 메틸화는 세 가지 생체 고분자 모두에 발생합니다. DNA와 단백질 메틸화는 지난 3년간 아주 잘 연구되었습니다. 대조적으로, RNA 메틸화에 대한 관심은 최근에 RNA 메틸화를 쓰거나 지우거나 결합하는 단백질이 발달 및 질병2에서재생하는 중요한 역할에 비추어 재점화되었다. 풍부한 리보좀 및 전사 RNA에서 더 잘 알려진 기능 외에도 RNA 메틸화 경로는특정 메신저 RNA 안정성 3,4,접합5 및 번역6,7을조절합니다. miRNA처리 8,9 및 전사 일시 중지 및 릴리스10,11.
여기서, 분자 생물학 실험실의 설정에서 RNA 메틸트랜스퍼라제 활성의 시험관내 검증을 위한 간단하고 견고한 방법이 보고된다(도 1에요약). 많은 연구는 관심의 RNA 수정에 대하여 항체를 가진 점 얼룩을 통해 RNA 메틸 트랜스퍼라제의 활동을 평가합니다. 그러나, 도트-블롯은 RNA 메틸트랜스퍼라제와 배양시 RNA의 무결성을 검증하지 않는다. 이것은 중요 하기 때문에 뉴클레아제와 재조합 단백질의 사소한 오염 부분 RNA 저하 및 혼란 결과 이어질 수 있습니다. 더욱이, 고도로 특이적인 RNA 변형 항체조차도 특정 서열 또는 구조를 가진 수정되지 않은 RNA를 인식할 수 있다. 여기서 보고된 시험관내 RNA 메틸트랜스퍼라제 분석서는 S-아데노실 메티오닌이 메틸군 공여자에 삼각화될수 있다는 사실을 활용한다(그림 1), 항체를 사용하지 않고 메틸화된 RNA를 정확하게 검출할 수 있도록 함 . 지시서는 관심 있는 효소에 의해 말의 전사체의 메틸화및 시험의 생체외 전사 및 정제를 위해 제공된다. 이 방법은 유연하고 견고하며 주어진 프로젝트의 요구에 따라 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 시험관 내에서 전사 및 정제된 RNA, 화학적으로 합성된 RNA, 뿐만 아니라 세포 RNA도 사용될 수 있다. 이 분석법은 메틸화된 RNA가 겔에서 정확히 실행되는 위치를 보여줌으로써 질적 정보뿐만 아니라, 석질 카운트의 형태로 정량적 정보를 제공한다. 이것은 메틸화에 표적으로 하는 RNA RNA 또는 RNA의 크기를 직접 관찰하는 방법을 제공하기 때문에, 특히 세포 RNA를 기질로 사용하는 경우에, RNA 메틸 트랜스퍼라제의 기능에 독특한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="851">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10821-015</td>
			<td style="width:353px;">10 bp DNA Ladder kit.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10% Ammonium Persulfate (APS)&#160;</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 &#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">10X TBE Buffer</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22&#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">10X TBS</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">BP1408-1</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H])</td>
			<td style="width:121px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:161px;">NET155V250UC</td>
			<td style="width:353px;">For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= 
			(1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 &#181;M.&#160;&#160; Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4&#176;C, make 20 &#181;L aliquots, and freeze them at -30&#176;C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">RPN11649</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amersham Hyperfilm MP</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">28906846</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beckman Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS6500</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704466</td>
			<td style="width:353px;">Mini Horizontal Electrophoresis System.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:121px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:161px;">4693159001</td>
			<td style="width:353px;">For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion Cell</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">345-9902</td>
			<td>RNase free empty cassette for polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion empty Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1656001</td>
			<td>Vertical midi-format electrophoresis cell.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer</td>
			<td style="width:121px;">DeNovix</td>
			<td style="width:161px;">DS-11-S</td>
			<td style="width:353px;">Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ecoscint Original</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td style="width:161px;">LS-271</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">03-337-1</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer</td>
			<td style="width:121px;">RPI CORP</td>
			<td style="width:161px;">112600</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel pretreatment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel dryer</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1651745</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Gel Loading Buffer II</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM8547</td>
			<td style="width:353px;">For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneCatcher disposable gel excision tips</td>
			<td style="width:121px;">Gel Company</td>
			<td style="width:161px;">NC9431993</td>
			<td>For removing bands from agarose and polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Megascript Kit</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM1333</td>
			<td>For in vitro transcription with T7 RNA polymerase.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Perfectwestern Extralarge Container</td>
			<td style="width:121px;">Genhunter Corporation</td>
			<td style="width:161px;">NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black)</td>
			<td>Gel staining box.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pRZ</td>
			<td style="width:121px;">Addgene</td>
			<td style="width:161px;">#27663</td>
			<td style="width:353px;">Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">74204</td>
			<td style="width:353px;">For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">28704</td>
			<td style="width:353px;">Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Saran Premium Plastic Wrap</td>
			<td style="width:121px;">Saran Wrap</td>
			<td style="width:161px;">Amazon</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Gold</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S11494</td>
			<td>Ultra sensitive nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TE</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">93283-100ML</td>
			<td>10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TEMED</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">110-18-9</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5382000023/5361000038</td>
			<td style="width:353px;">For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td style="width:121px;">life technologies</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:353px;">Kits for fast cloning of Taq polymerase&#8211;amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TURBO DNase (2 U&#8260;&#181;L)</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM2238</td>
			<td>For DNA removal from in vitro transcription reactions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">51456-500G</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Whatman 3MM paper</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">3030-154</td>
			<td style="width:353px;">Chromatography paper for drying gel.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis

RNA의 100개 이상의 화학적으로 명백한 수정이 있습니다, 그 중 2/3는 메틸화로 이루어져 있습니다. RNA 수정, 특히 메틸화에 대한 관심은 질병과 암과 관련된 생물학적 과정에서 효소를 쓰고 지우는 중요한 역할로 인해 다시 나타났습니다. 여기서, 합성 또는 시험관내 전사 RNA에 대한 RNA 메틸화 기활성의 정확한 분석을 위한 민감한 시험관내 분석이 제공된다. 이 분석은 삼각형태인 S-아데노실-메티오닌을 사용하며, 그 결과 메틸화된 RNA를 트리튬으로 직접 라벨링합니다. 삼중수소 방사선의 낮은 에너지는 이 방법을 안전하고 기존의 삼중수소 신호 증폭 방법을 가능하게 하며, 일반적으로 유물에 걸리기 쉬운 항체를 사용하지 않고 메틸화된 RNA를 정량화하고 시각화할 수 있게 합니다. 이 방법은 RNA 메틸화를 위해 쓰여진 동안, 몇몇 비틀기는 14C 아세틸 코엔자임 A를 가진 RNA 아세틸화와 같은 방사성으로 표지될 수 있는 그밖 RNA 수정의 연구 결과에 적용가능하게 합니다, 이 분석법은 RNA를 빨리 평가할 수 있습니다 메틸화 조건, 소분자 억제제로 억제, 또는 RNA 또는 효소 돌연변이체의 효과, 세포에서 얻은 결과를 검증하고 확장할 수 있는 강력한 도구를 제공한다.

생체 외 에서 전사 반응 그림 2 A는 7SK snRNA의 T7 RNA 폴리머라제와의 시험관내 전사 반응으로부터의 전형적인 실행을 나타내며, 이는 비교적 짧은(331 nt) 및 고도로 구조화된 RNA이다. 원시 이미지에 표시된 것처럼, 여러 원치 않는 밴드가 있다, 둘 다 짧고 긴 7SK, 아마 임의의 전사 개시 또는 종료 이벤트에서 발생. 이 때문에, 시험관 내 전사 반응에 따...

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Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

여기서, 합성 또는 시험관내 전사 RNA에 대한 메틸트랜스퍼라제 활성의 직접 분석을 위한 항체-무체질 시험관내 분석이 기재되어 있다.

RNA 메틸 트랜스퍼라제 활성 분석을 위한 항체 무첨가 분석

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

RNA의 100개 이상의 뚜렷한 수정이 있으며, 그 중 3분의 2는 메틸레이션입니다. 이 프로토콜은 RNA 메틸화 라이터 활성에 대한 민감하고 정확한 분석을 위한 방법을 제공한다. 이 사용하기 쉬운 기술은 일반적으로 유물에 수그리는 항체의 사용 없이 메틸화된 RNA를 정량화하고 시각화할 수 있게 합니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원 생인 사만다 셸튼이 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 100 마이크로리터 RNA 메틸 트랜스퍼라아제 분석기를 얼음 에 1.5 밀리리터 튜브에 설정합니다. 튜브를 완전히 혼합하고 원심분리기를 5초 동안 200배 g에서 혼합하여 튜브 의 바닥에서 용액을 수집합니다.2 시간 동안 37 섭씨에서 튜브를 배양하십시오. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 컬럼 정제를 사용하여 반응을 청소합니다. 액체 신경수 수를 수행하려면 샘플당 1개의 유리병, 백그라운드 측정용 유리병 1개, 스 와이프 테스트를 위한 바이알 1개로 신경 수 랙을 설정합니다.바이알을 5밀리리터의 신경화 계수 용액으로 채웁니다. 각 용출 된 방사성 RNA 샘플의 10 마이크로 리터를 하나의 유리병에 추가합니다. 뚜껑을 조이고 부드럽게 섞습니다.스 와이프 테스트 바이알을 준비하려면 절차 중에 사용되는 모든 표면과 장비에 면 봉면을 철저히 문지릅니다. 이러한 면봉을 반짝이는 용액으로 채워진 바이알에 넣고 뚜껑을 조입니다. 신경화 카운터에서 샘플을 실행하려면 카운터 후드를 열고 랙을 기계에 삽입하고 후드를 닫습니다.단일 랙 카운트를 선택합니다. 사용자 프로그램 선택 선택을 선택합니다. 60초 동안 트리튬을 측정하는 프로그램을 선택하거나 만들고 카운트 랙을 누르세요.반짝이 수를 세 번 반복합니다. 그 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 우레아 데마포링 폴리아크라이알라미드 젤을 준비하고 다시 실행합니다. 방사성 RNA 물질 20 마이크로리터를 2X 젤 로딩 버퍼 20마이크로리터를 포함하는 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기.사다리를 준비한 후 샘플을 섭씨 70도에서 15분 동안 배양합니다. 젤 탱크에서 버퍼를 겔의 우물로 피펫팅하여 시료 로딩 하기 직전에 젤의 우물을 다시 한 번 씻으시다. 그런 다음 준비된 사다리 20개, 샘플의 마이크로리터 20개, 1X 젤 로딩 버퍼 20개를 젤 의 차선에 적재합니다.폴리아크릴아미드 백분율에 따라 60~180분 동안 100볼트에서 젤을 실행합니다. 젤이 실행이 완료되면 카세트에서 젤을 제거하고 초감도 핵산 젤 얼룩 5 마이크로 리터와 함께 1X TBE 버퍼의 50 밀리리터를 포함하는 상자에 놓습니다. RNA를 얼룩지게하기 위해 5 분 동안 로커에 배양하십시오.그런 다음, 조심스럽게 상자에서 젤을 꺼내, 우물과 왼쪽에 사다리와 젤 이미징 시스템의 UV transilluminator에 배치. 젤에 카메라를 집중하고 UV 광을 켜고 젤 이미지를 찍습니다. 그런 다음 UV 노출을 끄고 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다.젤을 다시 상자에 넣고 TBE를 제거하고 실온에서 로커에 50 밀리리터의 고정 용액으로 젤을 30 분 동안 고정하십시오. 다음으로, 부드럽게 자동 방사선 화 강화 용액의 25 밀리리터를 포함하는 신선한 블랙 박스에 젤을 이동합니다. 실온에서 로커를 30분 동안 배양합니다.젤을 부드럽게 들어 올리고, 우물과 오른쪽에 사다리가 있는 플라스틱 랩 시트에 얼굴을 아래로 놓습니다. 젤 뒷면에 크로마토그래피 용지 2장을 놓고 전체 스택을 뒤집습니다. 젤 드라이어를 섭씨 80도로 예열합니다.젤 드라이어의 플라스틱 커버를 다시 이동합니다. 플라스틱 덮개 아래에 전체 스택을 삽입하고 플라스틱 덮개를 다시 아래로 이동하여 씰을 만듭니다. 젤을 섭씨 80도에서 1시간 동안 건조시다.그런 다음 젤 건조기를 끄고 스택을 부드럽게 제거합니다. 랩과 두 번째 크로마토그래피 용지를 제거합니다. 나머지 크로마토그래피 용지에 말린 젤을 자동 라디오그램 카세트에 테이프로 테이프로 바세요.어두운 방에 는 사인 라디오 필름 1 장을 추가합니다. 카세트를 음의 섭씨 80도에 저장하고 신호 강도에 따라 적절한 시간에 필름을 개발합니다. 필름이 개발되면 카세트 위에 놓고 실험실 마커를 사용하여 젤의 네 모서리, 각 우물 및 XC 및 BB 염료의 위치를 신중하게 표시합니다.인치당 300 픽셀 또는 600 픽셀의 해상도로 필름을 스캔하고 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다. 본 연구에서는, 항체가 없는 분석이 RNA 메틸트랜스체 활성을 분석하는 것으로 입증된다. 7SK 소형 핵RNA의 T7 RNA 폴리머라제와 함께 체외 전사 반응에서 전형적인 실행은 상대적으로 짧고 고도로 구조화된 RNA를 나타낸다.7SK보다 짧고 긴 여러 개의 원치 않는 밴드가 있는데, 이는 무작위 전사 개시 또는 종료 이벤트로 인해 발생할 수 있습니다. 이 때문에, 체외 전사 반응에 따른 겔 정제는 깨끗한 RNA 샘플을 얻는 것이 중요하다. 이 시점에서, 관심있는 RNA는 사다리에 상대적인 위치에 의해 식별되고 겔 정화에 의해 정제될 수 있다.추천 RNA 및 단백질 농도의 하한을 이용한 대표적인 RNA 메틸트랜스퍼라제 분석이 여기에 나와 있다. 이 분석법은 신자극 수의 정량적 결과뿐만 아니라 자동 방사선 사진의 정성적 결과를 모두 허용합니다. 여기서, 메틸레이트 7SK로 알려진 RNA 메틸트랜스퍼라제는 또한 U6를 메틸레이트할 수 있는 것으로 나타났다. 더욱이, 최근 7SK에 대해 나타난 바와 같이, 그의 음색 H4를 MePCE에 결합하는 것도 U6 메틸화를 억제한다.이는 이 프로토콜의 견고성을 보여주는 신경 수와 자동 라디오그램 모두에서 관찰될 수 있다. RNA는 분해에 취약하므로 RNase 가없는 시약을 사용하고 모든 표면과 장비를 철저히 청소하십시오. 이 메틸트랜스퍼라제 분석에서 얻은 방사성 표지 된 RNA는 전기 이동성 이동 분석에 의한 RNA 디메틸라제 활성 또는 RNA 결합 활성을 평가하기 위해 직접 사용될 수 있다.이 방법은 연구원이 포인트 돌연변이 및 작은 분자 억제제 처리를 포함하여 RNA 메틸 전달효소 활동에 다른 요인의 효력을 시험할 수 있습니다. 이 방법은 방사성 물질을 사용하므로 적절한 PPE를 착용하고 방사성 물질을 취급하고 폐기하는 동안주의하십시오.

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

연구

유전학

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

의 Transcriptomic 분석<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; 간스</em갤럭시 프로젝트에 턱시도 제품군을 통해&gt; RNA 시퀀싱 데이터

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

인간의 Telomerase 역전사 단백질의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동의 반 정량적 검출

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

오래 비 코딩 RNA의 RNA 표적 식별에 RNA 풀 다운 절차

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

대체 사전 mRNA 접합 교 잡 시험 현장에서 RNA를 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서의 정량 분석

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR 가이드 RNA 포유류 시스템 복제

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

인공 RNA 폴리머라제 II 연신복합체 해부 공동 전사 RNA 처리 이벤트

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...