Name: antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke Dr. turja Kanti Debnath for hans hjelp med ChemDraw. Forskning i Xhemalçe laboratoriet er støttet av Department of Defense-Congressionally regissert Medical Research program-brystkreft gjennombrudd Award (W81XWH-16-1-0352), NIH Grant R01 GM127802 og oppstart midler fra Institute of Cellular og Molekylærbiologi og College of Natural Sciences ved University of Texas i Austin, USA.

1. in vitro transkripsjon og gel rensing av målet RNA
<ol><li>Klon sekvensen av interesse i plasmider inneholder T7 og/eller SP6 arrangører bruker etablerte molekylær kloning teknikker12 eller kits.</li>
	<li>Linearizing DNA mal for in vitro transkripsjon
	<ol>
<li>Forsterke sekvensen av interesse av PCR av plasmider med primere utformet for å inkludere T7 promoter regionen gjennom innsatsen, + 20-30 BP oppstrøms og nedstrøms som tidligere beskrevet13</su...

<ol>
	<li>Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+histones+to+RNA:+role+of+methylation+in+cancer.">From histones to RNA: role of methylation in cancer.</a> Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).</li><li>Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Who+Watches+the+Watchmen:+Roles+of+RNA+Modifications+in+the+RNA+Interference+Pathway.">Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).</li><li>Mauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+methylation+of+m(6)Am+in+the+5'+cap+controls+mRNA+stability.">Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability.</a> Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability.">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li><li>Pendleton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U6+snRNA+m(6)A+Methyltransferase+METTL16+Regulates+SAM+Synthetase+Intron+Retention.">The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention.</a> Cell. 169 (5), 824-835 (2017).</li><li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'+UTR+m(6)A+Promotes+Cap-Independent+Translation.">5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation.</a> Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(6)-methyladenosine+Modulates+Messenger+RNA+Translation+Efficiency.">N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency.</a> Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).</li><li>Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine+marks+primary+microRNAs+for+processing.">N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing.</a> Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).</li><li>Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RNA+methyltransferase+BCDIN3D+regulates+microRNA+processing.">Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing.</a> Cell. 151 (2), 278-288 (2012).</li><li>Jeronimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+the+protein+interaction+network+for+the+human+transcription+machinery+reveals+the+identity+of+the+7SK+capping+enzyme.">Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme.</a> Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brd4+and+JMJD6-associated+anti-pause+enhancers+in+regulation+of+transcriptional+pause+release.">Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release.</a> Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visual Experimentation. , (2019).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).</li><li>Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+strand+switching+by+T7+RNA+polymerase.">Template strand switching by T7 RNA polymerase.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+active+recombinant+T7+RNA+polymerase+from+E.+coli.">Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).</li><li>Shelton, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+RNA+Methylation+and+Histone-Binding+Activities+of+MePCE+Regulates+P-TEFb+Activation+on+Chromatin.">Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin.</a> Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).</li><li>Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+plasmids+for+producing+RNA+in+vitro+transcripts+with+homogeneous+ends.">General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends.</a> Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).</li><li>Blazer, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Suite+of+Biochemical+Assays+for+Screening+RNA+Methyltransferase+BCDIN3D.">A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D.</a> SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).</li><li>Arango, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+Promotes+Translation+Efficiency.">Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.</a> Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NAT10+is+an+ATP-dependent+RNA+acetyltransferase+responsible+for+N4-acetylcytidine+formation+in+18+S+ribosomal+RNA+(rRNA).">Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).</li></ol>

Her rapporteres en enkel og robust metode for in vitro-verifisering av RNA methyltransferase aktivitet mot spesifikke transkripsjoner. Analysen utnytter det faktum at S-adenosyl metionin kan tritiated på metyl-gruppen donor (figur 1), slik at denaturert RNA å være nøyaktig oppdages uten bruk av antistoffer. Det er imidlertid viktig å merke seg at denne analysen ikke kan indikere hvilke rester eller kjemisk gruppe er denaturert av enzymet. Å identifisere eller bekrefte at en bestemt res...

DNA, RNA og proteiner er gjenstand for modifikasjoner som strengt regulerer genuttrykk1. Blant disse modifikasjoner, methylations forekomme på alle tre biopolymerer. DNA og protein methylations har vært svært godt studert i løpet av de siste tre ti årene. Interessen for RNA-metylering har derimot nylig vært reignited i lys av de viktige rollene som proteiner som skriver, sletter eller binder RNA-methylations spill i utvikling og sykdom2. I tillegg til bedre kjente funksjoner i rikelig ribosomal og overføring RNAs, RNA metylering trasé regulere spesifikke Messenger RNA stabilitet3,4, skjøting5 og oversettelse6,7, miRNA prosessering8,9 og transcriptional pause og slipp10,11.
Her rapporteres en enkel og robust metode for in vitro-verifisering av RNA methyltransferase aktivitet i innstillingen av et molekylærbiologi laboratorium (oppsummert i figur 1). Mange studier vurderer aktiviteten til en RNA-methyltransferase gjennom dot-blot med et antistoff mot RNA-endringen av interesse. Men dot-blot kontrollerer ikke integriteten til RNA-en ved inkubasjons med RNA-methyltransferase. Dette er viktig fordi selv mindre forurensninger av rekombinant proteiner med nukleaser kan føre til delvis RNA degradering og forvirrende resultater. Videre kan selv svært spesifikke RNA modifisering antistoffer gjenkjenne uendret RNAs med spesifikke sekvenser eller strukturer. In vitro RNA methyltransferase-analysen som rapporteres her, utnytter det faktum at S-adenosyl-metionin kan tritiated på metyl-gruppen (figur 1), noe som åpner for at denaturert RNA blir nøyaktig oppdaget uten bruk av antistoffer . Instruksjoner er gitt for in vitro transkripsjon og rensing av en transkripsjon av interesse og testing av metylering av sa transkripsjon av enzymet av interesse. Denne metoden er fleksibel og robust, og kan justeres i henhold til behovene til et gitt prosjekt. For eksempel, in vitro transkribere og renset RNAs, kjemisk syntetisert RNAs, men også cellulære RNAs kan brukes. Denne analysen gir kvantitativ informasjon i form av scintillation teller, samt kvalitativ informasjon ved å vise hvor nøyaktig denaturert RNA kjører på en gel. Dette kan gi unik innsikt i funksjonen til en RNA-methyltransferase, spesielt ved bruk av mobil RNAs som et substrat, da det gir en metode for direkte å observere størrelsen på RNA-eller RNAs-en som er målrettet for metylering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="851">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10821-015</td>
			<td style="width:353px;">10 bp DNA Ladder kit.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10% Ammonium Persulfate (APS)&#160;</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 &#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">10X TBE Buffer</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22&#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">10X TBS</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">BP1408-1</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H])</td>
			<td style="width:121px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:161px;">NET155V250UC</td>
			<td style="width:353px;">For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= 
			(1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 &#181;M.&#160;&#160; Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4&#176;C, make 20 &#181;L aliquots, and freeze them at -30&#176;C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">RPN11649</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amersham Hyperfilm MP</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">28906846</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beckman Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS6500</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704466</td>
			<td style="width:353px;">Mini Horizontal Electrophoresis System.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:121px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:161px;">4693159001</td>
			<td style="width:353px;">For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion Cell</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">345-9902</td>
			<td>RNase free empty cassette for polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion empty Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1656001</td>
			<td>Vertical midi-format electrophoresis cell.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer</td>
			<td style="width:121px;">DeNovix</td>
			<td style="width:161px;">DS-11-S</td>
			<td style="width:353px;">Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ecoscint Original</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td style="width:161px;">LS-271</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">03-337-1</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer</td>
			<td style="width:121px;">RPI CORP</td>
			<td style="width:161px;">112600</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel pretreatment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel dryer</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1651745</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Gel Loading Buffer II</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM8547</td>
			<td style="width:353px;">For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneCatcher disposable gel excision tips</td>
			<td style="width:121px;">Gel Company</td>
			<td style="width:161px;">NC9431993</td>
			<td>For removing bands from agarose and polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Megascript Kit</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM1333</td>
			<td>For in vitro transcription with T7 RNA polymerase.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Perfectwestern Extralarge Container</td>
			<td style="width:121px;">Genhunter Corporation</td>
			<td style="width:161px;">NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black)</td>
			<td>Gel staining box.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pRZ</td>
			<td style="width:121px;">Addgene</td>
			<td style="width:161px;">#27663</td>
			<td style="width:353px;">Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">74204</td>
			<td style="width:353px;">For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">28704</td>
			<td style="width:353px;">Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Saran Premium Plastic Wrap</td>
			<td style="width:121px;">Saran Wrap</td>
			<td style="width:161px;">Amazon</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Gold</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S11494</td>
			<td>Ultra sensitive nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TE</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">93283-100ML</td>
			<td>10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TEMED</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">110-18-9</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5382000023/5361000038</td>
			<td style="width:353px;">For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td style="width:121px;">life technologies</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:353px;">Kits for fast cloning of Taq polymerase&#8211;amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TURBO DNase (2 U&#8260;&#181;L)</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM2238</td>
			<td>For DNA removal from in vitro transcription reactions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">51456-500G</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Whatman 3MM paper</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">3030-154</td>
			<td style="width:353px;">Chromatography paper for drying gel.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis

Det er mer enn 100 kjemisk distinkte modifikasjoner av RNA, hvorav to tredjedeler består av methylations. Interessen for RNA modifikasjoner, og spesielt methylations, har re-dukket opp på grunn av de viktige rollene som spilles av enzymer som skriver og sletter dem i biologiske prosesser som er relevante for sykdom og kreft. Her, en følsom in vitro-analyse for nøyaktig analyse av RNA metylering forfatter aktivitet på syntetiske eller in vitro-RNAs er gitt. Denne analysen bruker en tritiated form av S-adenosyl-metionin, noe som resulterer i direkte merking av denaturert RNA med tritium. Den lave energien av tritium stråling gjør metoden trygg, og eksisterende metoder for tritium signal forsterkning, gjør det mulig å kvantifisere og visualisere denaturert RNA uten bruk av antistoffer, som vanligvis er utsatt for artefakter. Selv om denne metoden er skrevet for RNA-metylering, gjør noen tilpasninger det gjeldende for studiet av andre RNA-modifikasjoner som kan radioaktivt merket, for eksempel RNA-acetylering med 14C acetyl koenzym A. Overall, gjør denne analysen for å raskt vurdere RNA metylering forhold, hemming med små molekyl hemmere, eller effekten av RNA eller enzym mutanter, og gir et kraftig verktøy for å validere og utvide resultatene som oppnås i celler.

In vitro transkripsjon reaksjon Figur 2 A representerer en typisk kjøre fra en in vitro transkripsjon reaksjon med T7 RNA POLYMERASE av 7SK snRNA, som er en relativt kort (331 NT) og svært strukturert RNA. Idet vist opp på det ømt punkt image, der er mangfoldig uønsket bånd, begge to kortere vei og lengere enn 7SK, sannsynligvis forårsaket fra tilfeldig transcriptional innvielsen eller avslutning begivenheter. På grunn av dette, gel rensing etter ...

Watch this Scientific Journal Video about Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis at JoVE.com

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

Her beskrives en antistoff-fri in vitro-analyse for direkte analyser av methyltransferase aktivitet på syntetiske eller in vitro-er.

Analyse av antistoff-fri analyse for RNA-Methyltransferase aktivitet

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Det er mer enn 100 forskjellige modifikasjoner av RNA, hvorav to tredjedeler er metyleringer. Denne protokollen gir en metode for sensitiv og nøyaktig analyse av RNA metylering forfatter aktivitet. Denne brukervennlige teknikken gjør det mulig for oss å kvantifisere og visualisere metylert RNA uten bruk av antistoffer, som ofte er utsatt for gjenstander.Å demonstrere prosedyren vil være Samantha Shelton, en gradstudent fra laboratoriet mitt. For å starte denne prosedyren, sett opp 100-mikroliter RNA metyltransferaseanalysen i et 1,5-milliliter rør på is, som beskrevet i tekstprotokollen. Vortex røret for å blande grundig, og sentrifuge på 200 ganger g i fem sekunder for å samle løsningen nederst på røret.Inkuber røret ved 37 grader Celsius i to timer. Deretter rengjør du reaksjonen ved hjelp av kolonnerensing, som beskrevet i tekstprotokollen. For å utføre det flytende scintillasjonsantallet, sett opp scintillation count rack med ett hetteglass per prøve, ett hetteglass for en bakgrunnsmåling og ett hetteglass for sveiptesten.Fyll hetteglassene med fem milliliter scintillation telleløsning. Tilsett 10 mikroliter av hver eluted radioaktive RNA-prøve i ett hetteglass. Stram lokket, og bland forsiktig.For å forberede sveipetesthette ampuller, gni bomullspinner grundig på alle overflater og utstyr som brukes under prosedyren. Legg disse vattpinnene til hetteglassene fylt med scintillasjonsløsning, og stram lokket. For å kjøre prøvene på scintillation telleren, åpne benkehetten, sett stativet inn i maskinen og lukk panseret.Velg Tell Enkelt Rack. Velg Velg Brukerprogram. Velg eller opprett et program som måler tritium i 60 sekunder, og trykk på Count Rack.Gjenta scintillasjonstellingen tre ganger. Etter dette, forberede og re-kjøre en urea denaturing polyakrylamid gel, som beskrevet i tekstprotokollen. Overfør 20 mikroliter radioaktivt RNA-materiale til et nytt 1,5-milliliter rør som inneholder 20 mikroliter 2X gellastende buffer.Etter å ha forberedt stigen, inkuber prøvene ved 70 grader Celsius i 15 minutter. Vask brønnene på gelen igjen umiddelbart før prøvelasting ved å pipetteringsbufferen fra geltankene ned i gelens brønner. Deretter laster du 20 mikroliter av den tilberedte stigen, 20 mikroliter av prøvene og 20 mikroliter med 1X gellastende buffer inn i gelens baner.Kjør gelen på 100 volt i 60 til 180 minutter, avhengig av polyakrylamidprosenten. Når gelen er ferdig med å gå, fjern gelen fra kassetten og legg den i en boks som inneholder 50 milliliter 1X TBE-buffer med fem mikroliter ultrasensitive nukleinsyregelflekk. Inkuber på en rocker i fem minutter for å flekke RNA.Etter dette, ta forsiktig gelen ut av esken, og legg den på UV-transilluminatoren av gelavbildningssystemet med brønnene opp og stigen til venstre. Fokuser kameraet på gelen, slå på UV-lyset og ta et bilde av gelen. Deretter slår du av UV-eksponeringen og lagrer bildet som en TIFF-fil.Legg gelen tilbake i esken, fjern TBE, og fest gelen med 50 ml festeløsning på en rocker ved romtemperatur i 30 minutter. Deretter flytter du forsiktig gelen til en frisk svart boks som inneholder 25 milliliter av autoradiografiforbedrende oppløsning. Inkuber på rockeren ved romtemperatur i 30 minutter.Løft forsiktig gelen, og legg den med forsiden ned på et plastfolie med brønnene opp og stigen på høyre side. Legg to ark med kromatografipapir på baksiden av gelen, og snu hele stabelen. Forvarm geltørkeren til 80 grader Celsius.Flytt plastdekselet på geltørkeren tilbake. Sett hele stabelen under plastdekselet, og flytt plastdekselet ned igjen for å lage en forsegling. Tørk gelen ved 80 grader Celsius i en time.Deretter slår du av geltørkeren, og fjerner forsiktig stabelen. Fjern wrap og andre kromatografi papir. Tape gjenværende kromatografipapir med tørket gel i en autoradiogramkassett.I et mørkt rom legger du til ett ark med autoradiografifilm. Oppbevar kassetten ved negative 80 grader Celsius, og utvikle filmen til riktig tid, avhengig av signalintensiteten. Når filmen er utviklet, plasser den på toppen av kassetten og bruk en laboratoriemarkør til å nøye markere de fire kantene på gelen, hver brønn og plasseringen av XC- og BB-fargestoffene.Skann filmen med en oppløsning på enten 300 eller 600 piksler per tomme, og lagre bildet som en TIFF-fil. I denne studien er en antistofffri analyse demonstrert for å analysere RNA metyltransferaseaktivitet. Et typisk løp fra en in vitro transkripsjonsreaksjon med T7 RNA polymerase av 7SK liten kjernefysisk RNA viser relativt kort og svært strukturert RNA.Det er flere uønskede bånd, både kortere og lengre enn 7SK, sannsynligvis som følge av tilfeldig transkripsjonsinitiering eller avslutningshendelser. På grunn av dette er gelrensing etter in vitro transkripsjonsreaksjonen viktig for å få en ren RNA-prøve. På dette punktet kan RNA av interesse identifiseres ved sin plassering i forhold til stigen og renses ved gelrensing.En representativ RNA metyltransferaseanalyse ved hjelp av den nedre grensen for anbefalt RNA og proteinkonsentrasjoner er vist her. Denne analysen gir både kvantitative resultater fra scintillation teller, samt kvalitative resultater fra autoradiogram. Her er en RNA metyltransferase kjent for å metylat 7SK vist seg å være i stand til også å metylate U6. Videre, som nylig vist for 7SK, binding av histone H4 til MePCE hemmer også U6 metylering.Dette kan observeres både i scintillation count og autoradiogram, som viser robustheten til denne protokollen. RNA er utsatt for nedbrytning, så sørg for å bruke RNase-frie reagenser og for å rengjøre alle overflater og utstyr grundig. Den radioaktivt merkede RNA hentet fra denne metyltransferaseanalysen kan brukes direkte til å vurdere RNA demetylenseaktivitet eller RNA-bindingsaktivitet ved for eksempel elektrophoretisk mobilitetsforskyvningsanalyse.Denne metoden gjør det mulig for forskere å teste effekten av ulike faktorer på RNA metyltransferaseaktivitet, inkludert punktmutasjoner og små molekylhemmerbehandlinger. Denne metoden bruker radioaktivt materiale, så sørg for å bruke riktig PPE, og vær forsiktig under håndtering og avhending av radioaktive materialer.

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartlegging av RNA-RNA-interaksjoner globalt ved bruk av biotinylert psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Analyse av Transcriptomic<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA sekvenseringsdata Gjennom Tuxedo Suite på Galaxy-prosjektet

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi kvantitative påvisning av RNA-avhengig RNA Polymerase aktivitet av menneskelig Telomerase revers transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA rullegardinmenyen prosedyre å identifisere RNA mål av en lenge ikke-koding

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Sjelden hendelse gjenkjenning feil-korrigert DNA og RNA sekvensering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse av Alternative Pre-mRNA skjøting i musen hjernen inndelinger ved hjelp av RNA i Situ hybridisering analysen

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolsk merking med 4-thiouracil og kvantifisering av nylig syntetisert mRNA som en Proxy for RNA Polymerase II aktivitet

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR Guide RNA kloning for pattedyr systemer

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Kunstig RNA polymerase II forlengelse komplekser for dissekere co-transcriptional RNA prosessering hendelser

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

En analyse for kvantifisere protein-RNA binding i bakterier

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...