Name: antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Турью Канти Дебнатх за помощь в ChemDraw. Исследования в лаборатории Xhemal'e поддерживается Министерством обороны - Конгресс направлены медицинские исследования программы - Рак молочной железы Прорыв премии (W81XWH-16-1-0352), NIH Грант R01 GM127802 и запуск средств от Института сотовой и Молекулярная биология и Колледж естественных наук техасского университета в Остине, США.

1. Транскрипция в пробирке и гель очищение целевой РНК
<ol><li>Клон последовательность интереса в плазмиды, содержащие T7 и / или SP6 промоутеров с использованием установленных молекулярных методов клонирования12 или комплекты.</li>
	<li>Линейная версия шаблона ДНК для транскри...

<ol>
	<li>Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+histones+to+RNA:+role+of+methylation+in+cancer.">From histones to RNA: role of methylation in cancer.</a> Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).</li><li>Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Who+Watches+the+Watchmen:+Roles+of+RNA+Modifications+in+the+RNA+Interference+Pathway.">Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).</li><li>Mauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+methylation+of+m(6)Am+in+the+5'+cap+controls+mRNA+stability.">Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability.</a> Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability.">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li><li>Pendleton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U6+snRNA+m(6)A+Methyltransferase+METTL16+Regulates+SAM+Synthetase+Intron+Retention.">The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention.</a> Cell. 169 (5), 824-835 (2017).</li><li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'+UTR+m(6)A+Promotes+Cap-Independent+Translation.">5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation.</a> Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(6)-methyladenosine+Modulates+Messenger+RNA+Translation+Efficiency.">N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency.</a> Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).</li><li>Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine+marks+primary+microRNAs+for+processing.">N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing.</a> Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).</li><li>Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RNA+methyltransferase+BCDIN3D+regulates+microRNA+processing.">Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing.</a> Cell. 151 (2), 278-288 (2012).</li><li>Jeronimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+the+protein+interaction+network+for+the+human+transcription+machinery+reveals+the+identity+of+the+7SK+capping+enzyme.">Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme.</a> Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brd4+and+JMJD6-associated+anti-pause+enhancers+in+regulation+of+transcriptional+pause+release.">Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release.</a> Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visual Experimentation. , (2019).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).</li><li>Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+strand+switching+by+T7+RNA+polymerase.">Template strand switching by T7 RNA polymerase.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+active+recombinant+T7+RNA+polymerase+from+E.+coli.">Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).</li><li>Shelton, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+RNA+Methylation+and+Histone-Binding+Activities+of+MePCE+Regulates+P-TEFb+Activation+on+Chromatin.">Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin.</a> Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).</li><li>Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+plasmids+for+producing+RNA+in+vitro+transcripts+with+homogeneous+ends.">General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends.</a> Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).</li><li>Blazer, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Suite+of+Biochemical+Assays+for+Screening+RNA+Methyltransferase+BCDIN3D.">A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D.</a> SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).</li><li>Arango, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+Promotes+Translation+Efficiency.">Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.</a> Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NAT10+is+an+ATP-dependent+RNA+acetyltransferase+responsible+for+N4-acetylcytidine+formation+in+18+S+ribosomal+RNA+(rRNA).">Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).</li></ol>

Здесь сообщается о простом и надежном методе проверки РНК-метилтрансферазы в отношении конкретных транскриптов. Ассаи использует тот факт, что S-аденосил метионин может быть тритиациарет на метилгруппы донора(рисунок 1), что позволяет метилированной РНК быть точно обна...

ДНК, РНК и белки подвержены изменениям, которыежестко регулируют экспрессию генов 1. Среди этих модификаций метилирование происходит на всех трех биополимерах. Метилирование ДНК и белка было очень хорошо изучено в течение последних трех десятилетий. В отличие от этого, интерес к метилированию РНК был только недавно возродился в свете важной роли, что белки, которые пишут, стирают или связывают РНК метилациляции играют в развитии и болезни2. В дополнение к более известным функциям в обильных рибосомных и передачи РНК, РНК метилирования пути регулируют конкретные посыльного РНК стабильности3,4, сращивание5 и перевод6,7, miRNA обработки8,9 и транскрипционной паузы и выпуска10,11.
Здесь сообщается о простом и надежном методе проверки РНК-метилтрансферазы в условиях лаборатории молекулярной биологии (обобщено на рисунке 1). Многие исследования оценивают активность РНК метилтрансферазы через точечную подрамность с антителом против изменения интереса РНК. Однако, точка-блот не проверяет целостность РНК при инкубации с метилтрансферазой РНК. Это важно, потому что даже незначительные загрязнения рекомбинантных белков с нуклеазой может привести к частичной деградации РНК и смешанные результаты. Более того, даже высокоспецифические антитела к модификации РНК могут распознавать неизмененные РНК с определенными последовательностями или структурами. In vitro RNA метилтрансферазы анализ сообщил здесь использует тот факт, что S-аденосил метионин может быть трилциатна на метиловой группы донора (Рисунок 1), что позволяет метилированной РНК быть точно обнаружены без использования антител . Инструкции предусмотрены для экстракорпорной транскрипции и очистки стенограммы интереса и тестирования метилирования указанной транскрипта ферментом интереса. Этот метод является гибким и надежным и может быть скорректирован в соответствии с потребностями того или иного проекта. Например, в пробирке транскрибируются и очищены РНК, химически синтезированные РНК, но и клеточные РНК могут быть использованы. Этот ассси обеспечивает количественную информацию в виде сцинтилляции, а также качественную информацию, показывая, где именно метилированная РНК работает на геле. Это может обеспечить уникальное понимание функции РНК метилтрансферазы, особенно при использовании клеточных РНК в качестве субстрата, так как он обеспечивает метод непосредственного наблюдения размер РНК или РНК, которые предназначены для метилирования.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="851">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10821-015</td>
			<td style="width:353px;">10 bp DNA Ladder kit.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10% Ammonium Persulfate (APS)&#160;</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 &#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">10X TBE Buffer</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22&#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">10X TBS</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">BP1408-1</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H])</td>
			<td style="width:121px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:161px;">NET155V250UC</td>
			<td style="width:353px;">For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= 
			(1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 &#181;M.&#160;&#160; Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4&#176;C, make 20 &#181;L aliquots, and freeze them at -30&#176;C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">RPN11649</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amersham Hyperfilm MP</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">28906846</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beckman Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS6500</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704466</td>
			<td style="width:353px;">Mini Horizontal Electrophoresis System.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:121px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:161px;">4693159001</td>
			<td style="width:353px;">For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion Cell</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">345-9902</td>
			<td>RNase free empty cassette for polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion empty Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1656001</td>
			<td>Vertical midi-format electrophoresis cell.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer</td>
			<td style="width:121px;">DeNovix</td>
			<td style="width:161px;">DS-11-S</td>
			<td style="width:353px;">Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ecoscint Original</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td style="width:161px;">LS-271</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">03-337-1</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer</td>
			<td style="width:121px;">RPI CORP</td>
			<td style="width:161px;">112600</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel pretreatment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel dryer</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1651745</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Gel Loading Buffer II</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM8547</td>
			<td style="width:353px;">For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneCatcher disposable gel excision tips</td>
			<td style="width:121px;">Gel Company</td>
			<td style="width:161px;">NC9431993</td>
			<td>For removing bands from agarose and polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Megascript Kit</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM1333</td>
			<td>For in vitro transcription with T7 RNA polymerase.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Perfectwestern Extralarge Container</td>
			<td style="width:121px;">Genhunter Corporation</td>
			<td style="width:161px;">NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black)</td>
			<td>Gel staining box.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pRZ</td>
			<td style="width:121px;">Addgene</td>
			<td style="width:161px;">#27663</td>
			<td style="width:353px;">Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">74204</td>
			<td style="width:353px;">For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">28704</td>
			<td style="width:353px;">Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Saran Premium Plastic Wrap</td>
			<td style="width:121px;">Saran Wrap</td>
			<td style="width:161px;">Amazon</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Gold</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S11494</td>
			<td>Ultra sensitive nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TE</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">93283-100ML</td>
			<td>10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TEMED</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">110-18-9</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5382000023/5361000038</td>
			<td style="width:353px;">For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td style="width:121px;">life technologies</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:353px;">Kits for fast cloning of Taq polymerase&#8211;amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TURBO DNase (2 U&#8260;&#181;L)</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM2238</td>
			<td>For DNA removal from in vitro transcription reactions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">51456-500G</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Whatman 3MM paper</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">3030-154</td>
			<td style="width:353px;">Chromatography paper for drying gel.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis

Существует более 100 химически различных модификаций РНК, две трети из которых состоят из метилирования. Интерес к изменениям РНК, и особенно метилирования, вновь появился из-за важной роли, которую играют ферменты, которые пишут и стирают их в биологических процессах, имеющих отношение к болезням и раку. Здесь, чувствительный анализ in vitro для точного анализа деятельности писателя метилирования РНК на синтетических или in vitro транскрибированных РНК предоставляется. В этом ассее используется тритированная форма S-аденосил-метионина, что приводит к прямой маркировке метилированной РНК тритием. Низкая энергия излучения трития делает метод безопасным, а уже существующие методы усиления сигнала трития позволяют количественно и визуализировать метилированную РНК без использования антител, которые обычно подвержены артефактам. Хотя этот метод написан для РНК метилирования, несколько настроек сделать его применимым к изучению других изменений РНК, которые могут быть радиоактивно помечены, такие как РНК ацетилирование с 14C ацетил кофермент A. В целом, этот вывод позволяет быстро оценить РНК метилирование условия, ингибирование с небольшими ингибиторами молекулы, или эффект РНК или фермента мутантов, и обеспечивает мощный инструмент для проверки и расширения результатов, полученных в клетках.

Реакция транскрипции в пробирке Рисунок 2 A представляет собой типичный пробег от реакции транскрипции in vitro с полимеразой РНК T7 7SK snRNA, которая является относительно короткой (331 nt) и высоко структурированной РНК. Как показано на этом исходном изображе...

Watch this Scientific Journal Video about Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis at JoVE.com

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

Здесь описывается анализ антител без пробирки для прямого анализа активности метилтрансферазы на синтетической или в пробирке транскрибированной РНК.

Антитела-бесплатный анализ для анализа активности РНК метилтрансферазы

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Существует более 100 различных модификаций РНК, две трети из которых являются метилированиями. Этот протокол обеспечивает метод для чувствительного и точного анализа деятельности писателя метилирования РНК. Этот простой в использовании метод позволяет количественно и визуализировать метилированную РНК без использования антител, которые обычно подвержены артефактам.Демонстрацией процедуры будет Саманта Шелтон, аспирантка из моей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, установите 100-микролитр РНК метилтрансферазы анализ в 1,5-миллилитровой трубки на льду, как указано в текстовом протоколе. Vortex трубки тщательно перемешать, и центрифуга в 200 раз г в течение пяти секунд, чтобы собрать раствор в нижней части трубки.Инкубировать трубку при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов. Затем очистите реакцию с помощью очистки столбца, как указано в текстовом протоколе. Для выполнения подсчета жидких сцинтилляций найте стойку подсчета сцинтилляции одним флаконом на образец, одним флаконом для фонового измерения и одним флаконом для теста салфетки.Заполните флаконы пятью миллилитров раствора для подсчета сцинтилляции. Добавьте 10 микролитров каждого элеватора радиоактивного образца РНК в один флакон. Затяните крышку и аккуратно перемешайте.Чтобы подготовить пробные флаконы, тщательно протирать ватные тампоны на всех поверхностях и оборудовании, используемом во время процедуры. Добавьте эти тампоны во флаконы, наполненные раствором сцинтилляции, и затяните крышку. Для запуска образцов на счетчике сцинтилляции откройте капот счетчика, вставьте стойку в машину и закройте капот.Выберите граф одноместный стойку. Выберите программу выбора пользователя. Выберите или создайте программу, которая измеряет тритий в течение 60 секунд, и ударил граф Стойка.Повторите количество сцинтилляции три раза. После этого подготовь и повторно запустите денатурированный полиакриламидный гель мочевины, как указано в текстовом протоколе. Перенесите 20 микролитров радиоактивного РНК-материала в новую 1,5-миллилитровую трубку, содержащую 20 микролитров буфера загрузки 2X геля.После подготовки лестницы, инкубировать образцы при 70 градусов по Цельсию в течение 15 минут. Вымойте колодцы геля еще раз непосредственно перед загрузкой образца путем трубопроводного буфера из гелеобразуемых резервуаров вниз в колодцы геля. Затем загрузите 20 микролитров подготовленной лестницы, 20 микролитров образцов и 20 микролитров буфера загрузки геля в полосы движения геля.Вы запустите гель на 100 вольт в течение 60 до 180 минут, в зависимости от процента полиакриламинида. После того, как гель закончил работать, удалить гель из кассеты и поместить его в коробку, содержащую 50 миллилитров буфера 1X TBE с пятью микролитров сверхчувствительных нуклеиновых кислот гель пятно. Инкубировать на рокер в течение пяти минут, чтобы испачкать РНК.После этого осторожно вывихите гель из коробки и поместите его на УФ-трансиллюминатор системы визуализации геля с колодцами вверх и лестницей слева. Сосредоточьте камеру на геле, включите ультрафиолетовый свет и сделайе снимок геля. Затем выключите УФ-облучение и сохраните изображение в качестве файла TIFF.Поместите гель обратно в коробку, удалите TBE, и исправить гель с 50 миллилитров фиксации раствора на рокер при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем аккуратно переместите гель в свежий черный ящик, содержащий 25 миллилитров раствора для повышения ауторадиографии. Инкубировать на рокер при комнатной температуре в течение 30 минут.Аккуратно поднимите гель и поместите его лицом вниз на лист полиэтиленовой пленки с колодцами вверх и лестницей на правой стороне. Поместите два листа хроматографической бумаги на заднюю часть геля и переверните весь стек. Предварительно разогреть фен до 80 градусов по Цельсию.Перемести пластиковую крышку на фен обратно. Вставьте весь стек под пластиковую крышку, и переместить пластиковую крышку обратно вниз, чтобы создать уплотнение. Высушите гель при 80 градусах по Цельсию в течение одного часа.Затем выключите фен и аккуратно удалите стек. Снимите обертку и вторую хроматографическую бумагу. Лента оставшейся хроматографической бумаги с сушеным гелем в авториадиограмме кассеты.В темной комнате добавьте один лист авторадиографической пленки. Храните кассету при отрицательных 80 градусах по Цельсию и развивайте пленку в соответствующее время, в зависимости от интенсивности сигнала. После того, как пленка разработана, поместите его на верхней части кассеты и использовать лабораторный маркер, чтобы тщательно отметить четыре края геля, каждый хорошо, и положение XC и BB красителей.Сканируйте пленку с разрешением 300 или 600 пикселей на дюйм и сохраните изображение в качестве файла TIFF. В этом исследовании, без антител анализ продемонстрирован для анализа активности РНК метилтрансферазы. Типичный пробег от реакции транскрипции in vitro с полимеразой T7 РНК небольшой ядерной РНК 7SK показывает относительно короткую и высоко структурированную РНК.Есть несколько нежелательных полос, как короче, так и дольше, чем 7SK, вероятно, в результате случайных транскрипционных событий инициации или прекращения. Из-за этого, гель очистки после реакции транскрипции in vitro важно получить чистый образец РНК. На этом этапе РНК, представляющие интерес, может быть идентифицирована по своему расположению относительно лестницы и очищена путем очистки геля.Здесь показан репрезентативный анализ РНК метилтрансферазы с использованием нижнего предела рекомендуемой концентрации РНК и белка. Этот анализ позволяет как количественные результаты от сцинтилляции рассчитывает, а также качественные результаты от авторадиограммы. Здесь, РНК метилтрансферазы, как известно, метилат 7SK показано, что в состоянии также метилировать U6. Кроме того, как недавно показано на 7SK, связывание гистона H4 с MePCE также препятствует метилированию U6.Это можно наблюдать как при подсчете сцинтилляции, так и в авторадиограмме, демонстрируя надежность этого протокола. РНК подвержена деградации, поэтому, пожалуйста, убедитесь, что использовать RNase свободных реагентов и тщательно очистить все поверхности и оборудование. Радиоактивно помеченная РНК, полученная из анализа метилтрансферазы, может быть непосредственно использована для оценки активности РНК-деметилазы или активности связывания РНК с помощью анализа электрофоретической смены подвижности, например.Этот метод позволяет исследователям проверить влияние различных факторов на активность РНК метилтрансферазы, включая точечные мутации и лечение ингибиторами малых молекул. Этот метод использует радиоактивный материал, поэтому не забудьте носить соответствующие СИЗ, и быть осторожным во время обработки и утилизации радиоактивных материалов.

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Сопоставление взаимодействия РНК-РНК в глобальном масштабе с использованием биотинилированного псоралена

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Транскриптомный Анализ<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; Элеганс</em&gt; РНК Секвенирование данных через Tuxedo люкс по проекту Galaxy

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Полуколичественного обнаружение РНК зависимой РНК-полимеразы активности человека теломеразы транскриптазы белка

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

РНК Pull-down процедура для определения целей РНК РНК, длиной некодирующих

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Обнаружение редких событий, с помощью Исправлена ошибка ДНК и РНК последовательности

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Количественный анализ альтернативных пре мРНК сплайсинга в разделах мозга мыши, с помощью РНК в Situ гибридизация Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Пивоваренные дрожжи Метаболические маркировки с 4-thiouracil и количественная оценка недавно синтезированных мРНК как прокси для РНК-полимераза II деятельности

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

ТРИФОСФАТЫ руководство РНК клонирования млекопитающих систем

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Искусственные РНК-полимераза II Удлинение Комплексы для вскрытия co-транскрипционной РНК обработки событий

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Анализ для количественной протеино-РНК Связывания в бактериях

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...