Name: antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00
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Los autores quieren agradecer al Dr. Turja Kanti Debnath por su ayuda con ChemDraw. La investigación en el laboratorio xhemalé e cuenta con el apoyo del Departamento de Defensa - Programa de Investigación Médica Dirigido por el Congreso - Premio De ruptura del cáncer de mama (W81XWH-16-1-0352), NIH Grant R01 GM127802 y fondos de puesta en marcha del Instituto de Celulares y Biología Molecular y la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad de Texas en Austin, EE. UU.

1. Transcripción in vitro y purificación en gel del ARN objetivo
<ol><li>Clonar la secuencia de interés en plásmidos que contienen promotores T7 y/o SP6 utilizando técnicas de clonación molecular establecidas12 o kits.</li>
	<li>Linealización de la plantilla de ADN para transcripción in vitro
	<ol>
<li>Amplificar la secuencia de interés por PCR del plásmido con imprimaciones diseñadas para incluir la región promotora T7 a través de la plaquita, +20-30 bp aguas arrib...

<ol>
	<li>Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+histones+to+RNA:+role+of+methylation+in+cancer.">From histones to RNA: role of methylation in cancer.</a> Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).</li><li>Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Who+Watches+the+Watchmen:+Roles+of+RNA+Modifications+in+the+RNA+Interference+Pathway.">Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).</li><li>Mauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+methylation+of+m(6)Am+in+the+5'+cap+controls+mRNA+stability.">Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability.</a> Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability.">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li><li>Pendleton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U6+snRNA+m(6)A+Methyltransferase+METTL16+Regulates+SAM+Synthetase+Intron+Retention.">The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention.</a> Cell. 169 (5), 824-835 (2017).</li><li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'+UTR+m(6)A+Promotes+Cap-Independent+Translation.">5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation.</a> Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(6)-methyladenosine+Modulates+Messenger+RNA+Translation+Efficiency.">N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency.</a> Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).</li><li>Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine+marks+primary+microRNAs+for+processing.">N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing.</a> Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).</li><li>Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RNA+methyltransferase+BCDIN3D+regulates+microRNA+processing.">Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing.</a> Cell. 151 (2), 278-288 (2012).</li><li>Jeronimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+the+protein+interaction+network+for+the+human+transcription+machinery+reveals+the+identity+of+the+7SK+capping+enzyme.">Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme.</a> Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brd4+and+JMJD6-associated+anti-pause+enhancers+in+regulation+of+transcriptional+pause+release.">Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release.</a> Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visual Experimentation. , (2019).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).</li><li>Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+strand+switching+by+T7+RNA+polymerase.">Template strand switching by T7 RNA polymerase.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+active+recombinant+T7+RNA+polymerase+from+E.+coli.">Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).</li><li>Shelton, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+RNA+Methylation+and+Histone-Binding+Activities+of+MePCE+Regulates+P-TEFb+Activation+on+Chromatin.">Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin.</a> Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).</li><li>Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+plasmids+for+producing+RNA+in+vitro+transcripts+with+homogeneous+ends.">General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends.</a> Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).</li><li>Blazer, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Suite+of+Biochemical+Assays+for+Screening+RNA+Methyltransferase+BCDIN3D.">A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D.</a> SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).</li><li>Arango, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+Promotes+Translation+Efficiency.">Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.</a> Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NAT10+is+an+ATP-dependent+RNA+acetyltransferase+responsible+for+N4-acetylcytidine+formation+in+18+S+ribosomal+RNA+(rRNA).">Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).</li></ol>

Aquí, se informa de un método simple y robusto para la verificación in vitro de la actividad de la metiltransferasa de ARN hacia transcripciones específicas. El ensayo aprovecha el hecho de que S-adenosyl metionina puede ser trititada en el donante del grupo metilo (Figura1), lo que permite que el ARN metilado se detecte con precisión sin el uso de anticuerpos. Sin embargo, es importante tener en cuenta que este ensayo no puede indicar qué residuo o grupo químico es metilado por la en...

El ADN, el ARN y las proteínas están sujetos a modificaciones que regulan estrechamente la expresión génica1. Entre estas modificaciones, las metilaciones se producen en los tres biopolímeros. El ADN y las metilaciones de proteínas han sido muy bien estudiados durante las últimas tres décadas. Por el contrario, el interés por la metilación del ARN se ha reinado recientemente a la luzde las importantes funciones que desempeñan las proteínas que escriben, borran o unen las metilaciones del ARN en el desarrollo y la enfermedad 2. Además de las funciones más conocidas en los abundantes ARN ribosomales y de transferencia, las vías de metilación del ARN regulan la estabilidad específica del ARN mensajero3,4, empalme5 y la traducción6,7, procesamiento de miRNA8,9 y pausa transcripcional y liberación10,11.
Aquí, se informa de un método simple y robusto para la verificación in vitro de la actividad de la met-fitransferasa de ARN en el entorno de un laboratorio de biología molecular (resumido en la Figura1). Muchos estudios evalúan la actividad de un ARN metiltransferasa a través de la mancha de puntos con un anticuerpo contra la modificación del interés del ARN. Sin embargo, el punto-blot no verifica la integridad del ARN al incubar con el ARN metiltransferasa. Esto es importante porque incluso pequeñas contaminaciones de proteínas recombinantes con nucleasas pueden conducir a la degradación parcial del ARN y resultados de confunción. Además, incluso los anticuerpos de modificación de ARN altamente específicos pueden reconocer ARN no modificados con secuencias o estructuras específicas. El ensayo de ARN metiltransferasa in vitro notificado aquí aprovecha el hecho de que la S-adenosyl metionina puede ser tritida en el donante del grupo metilo (Figura1), lo que permite que el ARN metilado se detecte con precisión sin el uso de anticuerpos . Se proporcionan instrucciones para la transcripción in vitro y la purificación de una transcripción de interés y pruebas de la metilación de dicha transcripción por la enzima de interés. Este método es flexible y robusto, y se puede ajustar de acuerdo a las necesidades de cualquier proyecto dado. Por ejemplo, se pueden utilizar ARN transcritos y purificados in vitro, ARN sintetizados químicamente, pero también ARN celulares. Este ensayo proporciona información cuantitativa en forma de recuentos de centelleo, así como información cualitativa al mostrar dónde se ejecuta exactamente el ARN metilado en un gel. Esto puede proporcionar una visión única de la función de un ARN metiltransferasa, particularmente cuando se utiliza ARN celulares como sustrato, ya que proporciona un método para observar directamente el tamaño del ARN o ARN que están dirigidos a la metilación.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="851">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10821-015</td>
			<td style="width:353px;">10 bp DNA Ladder kit.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10% Ammonium Persulfate (APS)&#160;</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 &#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">10X TBE Buffer</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22&#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">10X TBS</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">BP1408-1</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H])</td>
			<td style="width:121px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:161px;">NET155V250UC</td>
			<td style="width:353px;">For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= 
			(1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 &#181;M.&#160;&#160; Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4&#176;C, make 20 &#181;L aliquots, and freeze them at -30&#176;C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">RPN11649</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amersham Hyperfilm MP</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">28906846</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beckman Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS6500</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704466</td>
			<td style="width:353px;">Mini Horizontal Electrophoresis System.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:121px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:161px;">4693159001</td>
			<td style="width:353px;">For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion Cell</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">345-9902</td>
			<td>RNase free empty cassette for polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion empty Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1656001</td>
			<td>Vertical midi-format electrophoresis cell.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer</td>
			<td style="width:121px;">DeNovix</td>
			<td style="width:161px;">DS-11-S</td>
			<td style="width:353px;">Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ecoscint Original</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td style="width:161px;">LS-271</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">03-337-1</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer</td>
			<td style="width:121px;">RPI CORP</td>
			<td style="width:161px;">112600</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel pretreatment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel dryer</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1651745</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Gel Loading Buffer II</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM8547</td>
			<td style="width:353px;">For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneCatcher disposable gel excision tips</td>
			<td style="width:121px;">Gel Company</td>
			<td style="width:161px;">NC9431993</td>
			<td>For removing bands from agarose and polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Megascript Kit</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM1333</td>
			<td>For in vitro transcription with T7 RNA polymerase.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Perfectwestern Extralarge Container</td>
			<td style="width:121px;">Genhunter Corporation</td>
			<td style="width:161px;">NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black)</td>
			<td>Gel staining box.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pRZ</td>
			<td style="width:121px;">Addgene</td>
			<td style="width:161px;">#27663</td>
			<td style="width:353px;">Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">74204</td>
			<td style="width:353px;">For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">28704</td>
			<td style="width:353px;">Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Saran Premium Plastic Wrap</td>
			<td style="width:121px;">Saran Wrap</td>
			<td style="width:161px;">Amazon</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Gold</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S11494</td>
			<td>Ultra sensitive nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TE</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">93283-100ML</td>
			<td>10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TEMED</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">110-18-9</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5382000023/5361000038</td>
			<td style="width:353px;">For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td style="width:121px;">life technologies</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:353px;">Kits for fast cloning of Taq polymerase&#8211;amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TURBO DNase (2 U&#8260;&#181;L)</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM2238</td>
			<td>For DNA removal from in vitro transcription reactions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">51456-500G</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Whatman 3MM paper</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">3030-154</td>
			<td style="width:353px;">Chromatography paper for drying gel.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis

Hay más de 100 modificaciones químicamente distintas del ARN, dos tercios de las cuales consisten en metilaciones. El interés por las modificaciones del ARN, y especialmente las metilaciones, ha resurgido debido a los importantes roles desempeñados por las enzimas que las escriben y borran en procesos biológicos relevantes para la enfermedad y el cáncer. Aquí, se proporciona un ensayo in vitro sensible para el análisis preciso de la actividad del escritor de metilación de ARN en ARN sintéticos o transcritos in vitro. Este ensayo utiliza una forma tritiada de S-adenosyl-metionina, lo que resulta en el etiquetado directo de ARN metilado con tritio. La baja energía de la radiación de tritio hace que el método sea seguro, y los métodos preexistentes de amplificación de la señal de tritio, permiten cuantificar y visualizar el ARN metilado sin el uso de anticuerpos, que son comúnmente propensos a los artefactos. Si bien este método está escrito para la metilación del ARN, pocos ajustes lo hacen aplicable al estudio de otras modificaciones de ARN que pueden ser etiquetadas radiactivamente, como la acetilación de ARN con 14C de coenzima A. En general, este ensayo permite evaluar rápidamente el ARN condiciones de metilación, inhibición con inhibidores de moléculas pequeñas, o el efecto de ARN o enzimas mutantes, y proporciona una poderosa herramienta para validar y expandir los resultados obtenidos en las células.

Reacción de transcripción in vitro Figura 2 A representa una carrera típica de una reacción de transcripción in vitro con la polimerasa de ARN T7 del ARN 7SK, que es un ARN relativamente corto (331 nt) y altamente estructurado. Como se muestra en esa imagen sin procesar, hay varias bandas no deseadas, tanto más cortas como más largas que 7SK, probablemente resultantes de eventos de iniciación o terminación de transcripción aleatoria. Debido a es...

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Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

Aquí, se describe un ensayo in vitro libre de anticuerpos para el análisis directo de la actividad de la metiltransferasa en ARN sintético o transcrito in vitro.

Ensayo libre de anticuerpos para el análisis de actividad de la metiltransferasa de ARN

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Hay más de 100 modificaciones distintas del ARN, dos tercios de las cuales son metilaciones. Este protocolo proporciona un método para el análisis sensible y preciso de la actividad del escritor de metilación de ARN. Esta técnica fácil de usar nos permite cuantificar y visualizar el ARN metilado sin el uso de anticuerpos, que son comúnmente propensos a artefactos.Demostrando el procedimiento estará Samantha Shelton, una estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, configure el ensayo de ARN metiltransferasa de 100 microlitsión en un tubo de 1,5 mililitros sobre hielo, como se describe en el protocolo de texto. Vórtice el tubo para mezclar a fondo, y centrifugar a 200 veces g durante cinco segundos para recoger la solución en la parte inferior del tubo.Incubar el tubo a 37 grados centígrados durante dos horas. A continuación, limpie la reacción mediante la purificación de columnas, como se describe en el protocolo de texto. Para realizar el recuento de centelleo líquido, configure el estante de recuento de centelleo con un vial por muestra, un vial para una medición de fondo y un vial para la prueba de deslizamiento.Llene los viales con cinco mililitros de solución de conteo de centelleo. Agregue 10 microlitros de cada muestra de ARN radiactivo eluido en un vial. Apriete la tapa y mezcle suavemente.Para preparar los viales de prueba de deslizamiento, frote bien los hisopos de algodón en todas las superficies y equipos utilizados durante el procedimiento. Agregue estos hisopos a los viales llenos de solución de centelleo y apriete la tapa. Para ejecutar las muestras en el contador de centelleo, abra la campana del contador, inserte el bastidor en la máquina y cierre la campana.Seleccione Count Single Rack (Recuento de rack único). Elija Seleccionar programa de usuario. Seleccione o cree un programa que mida el tritio durante 60 segundos y pulse Recuento de rack.Repita el recuento de centelleo tres veces. Después de esto, preparar y volver a ejecutar un gel de poliacrilamida desnatural de urea, como se describe en el protocolo de texto. Transfiera 20 microlitros de material de ARN radiactivo a un nuevo tubo de 1,5 mililitros que contenga 20 microlitros de 2X tampón de carga de gel.Después de preparar la escalera, incubar las muestras a 70 grados centígrados durante 15 minutos. Lave los recipientes del gel una vez más inmediatamente antes de la carga de la muestra por tampón de pipeteo de los tanques de gel hacia abajo en los pozos del gel. A continuación, cargue 20 microlitros de la escalera preparada, 20 microlitros de las muestras y 20 microlitros de 1X tampón de carga en gel en los carriles del gel.Ejecute el gel a 100 voltios durante 60 a 180 minutos, dependiendo del porcentaje de poliacrilamida. Una vez que el gel haya terminado de funcionar, retire el gel del cassette y colóquelo en una caja que contenga 50 mililitros de tampón 1X TBE con cinco microlitros de mancha de gel de ácido nucleico ultrasensible. Incubar en un balancín durante cinco minutos para manchar el ARN.Después de esto, saque cuidadosamente el gel de la caja y colóquelo en el transilluminador UV del sistema de imágenes de gel con los pozos hacia arriba y la escalera a la izquierda. Enfoque la cámara en el gel, encienda la luz UV y tome una imagen del gel. A continuación, desactive la exposición UV y guarde la imagen como un archivo TIFF.Vuelva a colocar el gel en la caja, retire el TBE y fije el gel con 50 mililitros de solución de fijación en un balancín a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, mueva suavemente el gel a una caja negra fresca que contenga 25 mililitros de la solución que mejora la autoradiografía. Incubar el balancín a temperatura ambiente durante 30 minutos.Levante suavemente el gel y colóquelo boca abajo en una hoja de plástico con los pozos hacia arriba y la escalera en el lado derecho. Coloque dos hojas de papel cromatográfico en la parte posterior del gel y voltee toda la pila. Precaliente el secador de gel a 80 grados centígrados.Mueva la cubierta de plástico en la secadora de gel hacia atrás. Inserte toda la pila debajo de la cubierta de plástico y mueva la cubierta de plástico hacia abajo para crear un sello. Seque el gel a 80 grados centígrados durante una hora.A continuación, apague la secadora de gel y retire suavemente la pila. Retire la envoltura y el segundo papel de cromatografía. Pegue el papel de cromatografía restante con el gel seco en un casete de autoradiograma.En una habitación oscura, agregue una hoja de película de autoradiografía. Almacene el cassette a 80 grados Celsius negativos y desarrolle la película en el momento adecuado, dependiendo de la intensidad de la señal. Una vez desarrollada la película, colóquela encima del cassette y utilice un marcador de laboratorio para marcar cuidadosamente los cuatro bordes del gel, cada uno y la posición de los tintes XC y BB.Escanee la película a una resolución de 300 o 600 píxeles por pulgada y guarde la imagen como un archivo TIFF. En este estudio, se demuestra un ensayo libre de anticuerpos para analizar la actividad del ARN metiltransferasa. Una carrera típica de una reacción de transcripción in vitro con el ARN polimerasa T7 del ARN nuclear pequeño 7SK muestra ARN relativamente corto y altamente estructurado.Hay varias bandas no deseadas, tanto cortas como más largas que 7SK, probablemente resultantes de eventos aleatorios de iniciación o terminación de transcripción. Debido a esto, la purificación de gel después de la reacción de transcripción in vitro es importante para obtener una muestra de ARN limpia. En este punto, el ARN de interés puede ser identificado por su ubicación en relación con la escalera y purificado por purificación de gel.Aquí se muestra un ensayo representativo de ARN metiltransferasa utilizando el límite inferior de las concentraciones recomendadas de ARN y proteínas. Este ensayo permite tanto resultados cuantitativos de los recuentos de centelleo, como resultados cualitativos de la autoradiograma. Aquí, una METHYLtransferasa de ARN conocida por metilato 7SK se muestra para ser capaz de también metilato U6. Además, como se ha demostrado recientemente para 7SK, la unión de la histona H4 a MePCE también inhibe la metilación U6.Esto se puede observar tanto en el recuento de centelleo como en el autoradiograma, mostrando la robustez de este protocolo. El ARN es susceptible a la degradación, así que asegúrese de utilizar reactivos libres de RNase y de limpiar a fondo todas las superficies y equipos. El ARN etiquetado radioactivamente obtenido de este ensayo de metiltransferasa se puede utilizar directamente para evaluar la actividad de la demetilasa de ARN o la actividad de unión al ARN mediante un ensayo de cambio de movilidad electroforética, por ejemplo.Este método permite a los investigadores probar el efecto de diferentes factores en la actividad de la RNA metiltransferasa, incluyendo mutaciones puntuales y tratamientos de inhibidores de moléculas pequeñas. Este método utiliza material radiactivo, así que asegúrese de usar el EPP adecuado, y tenga cuidado durante la manipulación y eliminación de materiales radiactivos.

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mapeo de las interacciones RNA-ARN a nivel mundial usando Psoralen Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Investigación

Genética

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Análisis de transcriptómica<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; ARN secuencia de datos a través de la suite smoking en el Proyecto Galaxy

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Detección semicuantitativa de la actividad de la ARN polimerasa ARN-dependiente de proteína transcriptasa reversa de Telomerasa humana

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Procedimiento de ARN Pull-down para identificar dianas de ARN de un ARN largo no codificante

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Detección de eventos raros usando ADN Error corregido y secuenciación de ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabólico etiquetado con 4-tiouracilo y la cuantificación de mRNA recién sintetizada como un Proxy para la actividad de ARN polimerasa II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

RNA de la guía CRISPR clonación de mamíferos sistemas

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Complejos de alargamiento de ARN polimerasa artificial II para disecar eventos de procesamiento de ARN co-transcripcional

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Un ensayo para cuantificar la unión de proteínas y ARN en bacterias

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...