Name: antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis at JoVE.com

Författarna skulle vilja tacka Dr Turja Kanti Debnath för hans hjälp med ChemDraw. Forskning i Xhemalçe Lab stöds av Department of Defense-Congressiellt riktade medicinska forsknings program-Breast Cancer genombrott Award (W81XWH-16-1-0352), NIH Grant R01 GM127802 och start-up medel från Institute of Cellular och Molekylärbiologi och Högskolan för naturvetenskap vid University of Texas i Austin, USA.

1. in vitro-transkription och gel rening av mål-RNA
<ol><li>Klona sekvensen av intresse till plasmider som innehåller T7 och/eller SP6-initiativtagare med hjälp av etablerade molekylära kloningstekniker12 eller Kits.</li>
	<li>Linearizing DNA-mall för in vitro-transkription
	<ol>
<li>Förstärka sekvensen av intresse genom PCR av plasmid med primers som utformats för att inkludera T7 promotor regionen genom insatsen, + 20-30 BP uppströms och nedströms som tidigare beskri...

<ol>
	<li>Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+histones+to+RNA:+role+of+methylation+in+cancer.">From histones to RNA: role of methylation in cancer.</a> Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).</li><li>Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Who+Watches+the+Watchmen:+Roles+of+RNA+Modifications+in+the+RNA+Interference+Pathway.">Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).</li><li>Mauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+methylation+of+m(6)Am+in+the+5'+cap+controls+mRNA+stability.">Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability.</a> Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability.">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li><li>Pendleton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U6+snRNA+m(6)A+Methyltransferase+METTL16+Regulates+SAM+Synthetase+Intron+Retention.">The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention.</a> Cell. 169 (5), 824-835 (2017).</li><li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'+UTR+m(6)A+Promotes+Cap-Independent+Translation.">5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation.</a> Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(6)-methyladenosine+Modulates+Messenger+RNA+Translation+Efficiency.">N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency.</a> Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).</li><li>Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine+marks+primary+microRNAs+for+processing.">N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing.</a> Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).</li><li>Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RNA+methyltransferase+BCDIN3D+regulates+microRNA+processing.">Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing.</a> Cell. 151 (2), 278-288 (2012).</li><li>Jeronimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+the+protein+interaction+network+for+the+human+transcription+machinery+reveals+the+identity+of+the+7SK+capping+enzyme.">Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme.</a> Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brd4+and+JMJD6-associated+anti-pause+enhancers+in+regulation+of+transcriptional+pause+release.">Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release.</a> Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visual Experimentation. , (2019).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).</li><li>Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+strand+switching+by+T7+RNA+polymerase.">Template strand switching by T7 RNA polymerase.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+active+recombinant+T7+RNA+polymerase+from+E.+coli.">Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).</li><li>Shelton, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+RNA+Methylation+and+Histone-Binding+Activities+of+MePCE+Regulates+P-TEFb+Activation+on+Chromatin.">Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin.</a> Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).</li><li>Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+plasmids+for+producing+RNA+in+vitro+transcripts+with+homogeneous+ends.">General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends.</a> Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).</li><li>Blazer, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Suite+of+Biochemical+Assays+for+Screening+RNA+Methyltransferase+BCDIN3D.">A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D.</a> SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).</li><li>Arango, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+Promotes+Translation+Efficiency.">Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.</a> Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NAT10+is+an+ATP-dependent+RNA+acetyltransferase+responsible+for+N4-acetylcytidine+formation+in+18+S+ribosomal+RNA+(rRNA).">Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).</li></ol>

Här rapporteras en enkel och robust metod för in vitro-verifiering av RNA-metyltransferasaktivitet mot specifika transkriptioner. Analysen utnyttjar det faktum att S-adenosyl metionin kan tritieras på metylgrupp givaren (figur 1), vilket gör det möjligt för METYLERAT RNA att upptäckas korrekt utan användning av antikroppar. Det är dock viktigt att notera att denna analys inte kan ange vilka rester eller kemisk grupp metyleras av enzymet. För att identifiera eller kontrollera att en...

DNA, RNA och proteiner är föremål för modifieringar som tätt reglerar genuttryck1. Bland dessa modifieringar förekommer metyleringar på alla tre biopolymerer. DNA-och proteinmetyleringar har studerats mycket väl under de senaste tre decennierna. Däremot har intresset för RNA-metylering bara nyligen reantänts i ljuset av de viktiga roller som proteiner som skriver, raderar eller binder RNA-metyleringar spelar i utveckling och sjukdom2. Förutom bättre kända funktioner i den rikliga ribosomala och överförande rnas reglerar RNA-metyleringsvägarna specifika budbärare RNA stabilitet3,4, skarvning5 och översättning6,7, Mirna bearbetning8,9 och transkriptionella pausa och release10,11.
Här rapporteras en enkel och robust metod för in vitro-verifiering av RNA-metyltransferasaktivitet i en molekylärbiologisk laboratoriemiljö (sammanfattas i figur 1). Många studier bedömer aktiviteten hos ett RNA-metyltransferas genom dot-blot med en antikropp mot RNA-modifiering av intresse. Emellertid, dot-blot inte kontrollera integriteten av RNA vid inkubering med RNA-metyltransferas. Detta är viktigt eftersom även mindre föroreningar av rekombinanta proteiner med nukleaser kan leda till partiell RNA-nedbrytning och confounding resultat. Dessutom kan även mycket specifika RNA modifiering antikroppar erkänna oförändrad RNAs med specifika sekvenser eller strukturer. Det in vitro-RNA-metyltransferas-test som rapporteras här utnyttjar det faktum att S-adenosyl-metionin kan tritieras på metylgruppdonatorn (figur 1), vilket gör det möjligt att korrekt upptäcka det metylerade RNA utan att använda antikroppar . Instruktioner ges för in vitro-transkription och rening av en avskrift av intresse och testning av metylering av nämnda avskrift av enzymet av intresse. Denna metod är flexibel och robust, och kan justeras i enlighet med behoven hos ett givet projekt. Till exempel, in vitro transkriberad och renad RNAs, kemiskt syntetiserade RNAs, men även cellulära RNAs kan användas. Denna analys ger kvantitativ information i form av scintillationgrester, samt kvalitativ information genom att visa exakt var det metylerade RNA körs på en gel. Detta kan ge en unik inblick i funktionen hos ett RNA-metyltransferas, särskilt vid användning av cellulära RNAs som substrat, eftersom det ger en metod för att direkt observera storleken på RNA eller RNAs som är riktade mot metylering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="851">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10821-015</td>
			<td style="width:353px;">10 bp DNA Ladder kit.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10% Ammonium Persulfate (APS)&#160;</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 &#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">10X TBE Buffer</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22&#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">10X TBS</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">BP1408-1</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H])</td>
			<td style="width:121px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:161px;">NET155V250UC</td>
			<td style="width:353px;">For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= 
			(1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 &#181;M.&#160;&#160; Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4&#176;C, make 20 &#181;L aliquots, and freeze them at -30&#176;C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">RPN11649</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amersham Hyperfilm MP</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">28906846</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beckman Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS6500</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704466</td>
			<td style="width:353px;">Mini Horizontal Electrophoresis System.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:121px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:161px;">4693159001</td>
			<td style="width:353px;">For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion Cell</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">345-9902</td>
			<td>RNase free empty cassette for polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion empty Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1656001</td>
			<td>Vertical midi-format electrophoresis cell.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer</td>
			<td style="width:121px;">DeNovix</td>
			<td style="width:161px;">DS-11-S</td>
			<td style="width:353px;">Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ecoscint Original</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td style="width:161px;">LS-271</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">03-337-1</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer</td>
			<td style="width:121px;">RPI CORP</td>
			<td style="width:161px;">112600</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel pretreatment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel dryer</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1651745</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Gel Loading Buffer II</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM8547</td>
			<td style="width:353px;">For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneCatcher disposable gel excision tips</td>
			<td style="width:121px;">Gel Company</td>
			<td style="width:161px;">NC9431993</td>
			<td>For removing bands from agarose and polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Megascript Kit</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM1333</td>
			<td>For in vitro transcription with T7 RNA polymerase.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Perfectwestern Extralarge Container</td>
			<td style="width:121px;">Genhunter Corporation</td>
			<td style="width:161px;">NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black)</td>
			<td>Gel staining box.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pRZ</td>
			<td style="width:121px;">Addgene</td>
			<td style="width:161px;">#27663</td>
			<td style="width:353px;">Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">74204</td>
			<td style="width:353px;">For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">28704</td>
			<td style="width:353px;">Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Saran Premium Plastic Wrap</td>
			<td style="width:121px;">Saran Wrap</td>
			<td style="width:161px;">Amazon</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Gold</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S11494</td>
			<td>Ultra sensitive nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TE</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">93283-100ML</td>
			<td>10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TEMED</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">110-18-9</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5382000023/5361000038</td>
			<td style="width:353px;">For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td style="width:121px;">life technologies</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:353px;">Kits for fast cloning of Taq polymerase&#8211;amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TURBO DNase (2 U&#8260;&#181;L)</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM2238</td>
			<td>For DNA removal from in vitro transcription reactions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">51456-500G</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Whatman 3MM paper</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">3030-154</td>
			<td style="width:353px;">Chromatography paper for drying gel.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis

Det finns mer än 100 kemiskt distinkta modifieringar av RNA, varav två tredjedelar består av metyleringar. Intresset för RNA-modifieringar, och i synnerhet metyleringar, har åter dykt upp på grund av de viktiga roller som de enzymer som skriver och raderar dem i biologiska processer som är relevanta för sjukdomar och cancer. Här, en känslig in vitro-analys för noggrann analys av RNA metylering Writer aktivitet på syntetiska eller in vitro-transkriberas RNAs tillhandahålls. Denna analys använder en tritierat form av S-adenosyl-metionin, vilket resulterar i direkt märkning av metylerat RNA med tritium. Den låga energin av tritium strålning gör metoden säker, och befintliga metoder för tritium signal förstärkning, gör det möjligt att kvantifiera och visualisera metylerat RNA utan användning av antikroppar, som är ofta benägna att artefakter. Medan denna metod är skriven för RNA-metylering, få tweaks gör det tillämpligt på studiet av andra RNA-modifieringar som kan radioaktivt märkas, såsom RNA-acetylering med 14C acetyl-coenzym A. Sammantaget gör denna analys att snabbt bedöma RNA metylering villkor, hämning med små molekyler hämmare, eller effekten av RNA eller enzym mutanter, och ger ett kraftfullt verktyg för att validera och expandera resultat som erhållits i celler.

In vitro-transkription reaktion Figur 2 A representerar en typisk kör från en in vitro-transkription reaktion med T7 RNA-polymeras av 7Sk snRNA, vilket är en relativt kort (331 NT) och mycket strukturerade RNA. Som visas på RAW-bild, det finns flera oönskade band, både kortare och längre än 7SK, troligen till följd av slumpmässiga transkriptionella initiering eller uppsägning händelser. På grund av detta är gel rening efter in vitro-transkri...

Watch this Scientific Journal Video about Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis at JoVE.com

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

Här beskrivs en antikroppsfri in vitro-analys för direkt analys av metyltransferasaktivitet på syntetiskt eller in vitro-transkriberat RNA.

Antikropps fri analys för RNA-metyltransferas aktivitetsanalys

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Det finns mer än 100 distinkta modifieringar av RNA, varav två tredjedelar är metylering. Detta protokoll ger en metod för känslig och korrekt analys av RNA metylering skribent aktivitet. Denna lättanvända teknik gör det möjligt för oss att kvantifiera och visualisera metylerat RNA utan användning av antikroppar, som ofta är benägna att artefakter.Demonstrerar proceduren blir Samantha Shelton, en grad student från mitt labb. För att påbörja detta förfarande, ställa in 100-mikroliter RNA metyltransferas assay i en 1,5-milliliter rör på is, som beskrivs i textprotokollet. Vortexa röret för att blanda ordentligt, och centrifug vid 200 gånger g i fem sekunder för att samla lösningen i botten av röret.Inkubera röret i 37 grader Celsius i två timmar. Rengör sedan reaktionen med hjälp av kolonnrening, som det skisseras i textprotokollet. För att utföra vätskescintillationsräkningen, ställ in scintillationsräkningsstället med en injektionsflaska per prov, en injektionsflaska för en bakgrundsmätning och en injektionsflaska för sveptestet.Fyll injektionsflaskan med fem milliliter scintillationsräkningslösning. Tillsätt 10 mikroliter av varje eluterat radioaktivt RNA-prov i en injektionsflaska. Dra åt locket och blanda försiktigt.För att förbereda sveptestdyssen gnuggar du noggrant bomullspinner på alla ytor och all utrustning som används under proceduren. Tillsätt dessa svabbprover till injektionsflaskan fylld med scintillation lösning, och dra åt locket. För att köra proverna på scintillationsräknaren, öppna räknarhuven, sätt in racket i maskinen och stäng huven.Välj Räkna enstaka rack. Välj Välj användarprogram. Välj eller skapa ett program som mäter tritium i 60 sekunder, och slå på Count Rack.Upprepa scintillationtalet tre gånger. Efter detta, förbereda och åter köra en urea denaturering polyakrylamid gel, som beskrivs i textprotokollet. Överför 20 mikroliter radioaktivt RNA-material till ett nytt 1,5-milliliterrör som innehåller 20 mikroliter av 2X gel-loading buffert.Efter att ha förberett stegen, inkubera proverna vid 70 grader Celsius i 15 minuter. Tvätta gelens brunnar en gång till omedelbart före provbelastning genom pipettingbuffert från geltankarna ner i gelens brunnar. Sedan laddar du 20 mikroliter av den förberedda stegen, 20 mikroliter av proverna och 20 mikroliter av 1X gel-lastningsbuffert i gelens körfält.Kör gelen på 100 volt i 60 till 180 minuter, beroende på polyakrylamid procent. När gelen har kört klart tar du bort gelen från kassetten och placerar den i en låda som innehåller 50 milliliter 1X TBE-buffert med fem mikroliter av ultrakänslig nukleinsyragelfläck. Inkubera på en vipp i fem minuter för att fläcka RNA.Efter detta, försiktigt ta gelen ur lådan, och placera den på UV transilluminator av gelen bildsystem med brunnarna upp och stegen till vänster. Fokusera kameran på gelen, slå på UV-ljuset och ta en bild av gelen. Sedan stänger du av UV-exponeringen och sparar bilden som en TIFF-fil.Placera tillbaka gelen i lådan, ta bort TBE och fixera gelen med 50 milliliter fästlösning på en vipp i rumstemperatur i 30 minuter. Därefter flyttar försiktigt gelen till en färsk svart låda som innehåller 25 milliliter av autoradiografiförbättrningslösningen. Inkubera på vips i rumstemperatur i 30 minuter.Lyft försiktigt gelen, och placera den med framsidan nedåt på ett ark plastfolie med brunnarna upp och stegen på höger sida. Placera två ark kromatografi papper på baksidan av gelen, och vänd hela stacken. Föruppvärm geltorken till 80 grader Celsius.Flytta plastskyddet på geltorken tillbaka. Sätt in hela stapeln under plastskyddet, och flytta plastskyddet tillbaka ner för att skapa en tätning. Torka gelen vid 80 grader Celsius i en timme.Stäng sedan av geltorken och ta försiktigt bort stacken. Ta bort wrap och andra kromatografi papper. Tejpa fast det återstående kromatografipapperet med den torkade gelen i en autoradiogramkassett.I ett mörkt rum, lägg till ett ark av autoradiografi film. Förvara kassetten vid negativ 80 grader Celsius, och utveckla filmen vid lämplig tidpunkt, beroende på signalintensiteten. När filmen är utvecklad, placera den ovanpå kassetten och använda en lab markör för att noggrant markera de fyra kanterna på gelen, varje brunn, och positionen för XC och BB färgämnen.Skanna filmen med en upplösning på antingen 300 eller 600 pixlar per tum, och spara bilden som en TIFF-fil. I denna studie, en antikroppsfri analys påvisas för att analysera RNA metyltransferas aktivitet. En typisk körning från en in vitro transkriptionreaktion med T7-RNAspolysasen av det små kärn- RNA för 7SK visar förhållandevis kort och högt strukturerat RNA.Det finns flera oönskade band, både kortare och längre än 7SK, troligen följd av slumpmässiga transkriptionella initierings- eller avslutningshändelser. På grund av detta är gelrening efter transkriptionsreaktionen in vitro viktigt för att erhålla ett rent RNA-prov. Vid denna punkt, RNA av intresse kan identifieras genom sin plats i förhållande till stegen och renas genom gel rening.En representativ RNA-metyltransferasanalys med hjälp av den undre gränsen för de rekommenderade RNA- och proteinkoncentrationerna visas här. Denna analys möjliggör både kvantitativa resultat från scintillation räknas, samt kvalitativa resultat från autoradiogrammet. Här, en RNA metyltransferas känd för att metylat 7SK visat sig kunna också metylat U6. Dessutom, som nyligen visats för 7SK, bindning av histon H4 till MePCE hämmar också U6 metylering.Detta kan observeras i både scintillationtalet och autoradiogrammet, som visar robustheten i detta protokoll. RNA är mottagligt för nedbrytning, så var snäll och se till att använda RNase-fria reagenser och att noggrant rengöra alla ytor och all utrustning. Det radioaktivt märkta RNA som erhålls från denna metyltransferasanalys kan direkt användas för att bedöma RNA-demetylasaktivitet eller RNA-bindningsaktivitet genom till exempel elektroforesröreförskjutningsanalys.Denna metod gör det möjligt för forskare att testa effekten av olika faktorer på RNA metyltransferas aktivitet, inklusive punktmutationer och små molekylhämmare behandlingar. Denna metod använder radioaktivt material, så se till att bära lämplig personlig skyddsutrustning, och var försiktig under hantering och bortskaffande av radioaktiva material.

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartläggning av RNA-RNA-interaktioner globalt med användning av biotinylerad psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analys av<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA Sequencing data via Tuxedo Suite på Galaxy Project

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Halvkvantitativ detektion av RNA-beroende RNA-polymeras aktivitet av mänskliga telomeras omvänt transkriptas Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA Pull-down förfarande att identifiera RNA mål av en lång icke-kodande RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Detektion av sällsynta händelser med fel-korrigerade DNA och RNA-sekvensering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analys av alternativa Pre-mRNA Splicing i mus hjärnan sektioner med RNA In Situ hybridisering analys

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metaboliska märkning med 4-thiouracil och kvantifiering av nyligen syntetiseras mRNA som en Proxy för RNA-polymeras II aktivitet

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR Guide RNA kloning av däggdjur system

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Konstgjorda RNA-polymeras II förlängning komplex för dissekera Co-transkriptionella RNA bearbetning händelser

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Ett test för att kvantifiera protein-RNA-bindning i bakterier

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...