Name: antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis at JoVE.com

Yazarlar ChemDraw ile onun yardımı için Dr turja Kanti Debnath teşekkür etmek istiyorum. Xhemalçe laboratuvarındaki araştırmalar, Savunma Bakanlığı tarafından desteklenmektedir-Kongre yönettiği tıbbi araştırma programı-meme kanseri atılım Ödülü (W81XWH-16-1-0352), NıH Grant R01 GM127802 ve mobil Enstitüsü 'nden başlangıç fonları ve Moleküler Biyoloji ve College of Doğa Bilimleri Texas Üniversitesi 'nde Austin, ABD.

1. In vitro transkripsiyon ve hedef RNA jel arıtma
<ol><li>Kurulan moleküler klonlama teknikleri12 veya Kits kullanarak T7 ve/veya SP6 Rehberleri içeren plazmids ilgi dizisini klonlayın.</li>
	<li>İn vitro transkripsiyon için DNA şablonunun doğranallaştıran
	<ol>
<li>Daha önce13' ü açıklandığı gibi, + 20-30 BP upstream ve downstream ile T7 Organizatör bölgesini eklemek üzere tasarlanan astar ile Plasmid 'in PCR tarafından ilgi sıras?...

<ol>
	<li>Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+histones+to+RNA:+role+of+methylation+in+cancer.">From histones to RNA: role of methylation in cancer.</a> Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).</li><li>Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Who+Watches+the+Watchmen:+Roles+of+RNA+Modifications+in+the+RNA+Interference+Pathway.">Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).</li><li>Mauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+methylation+of+m(6)Am+in+the+5'+cap+controls+mRNA+stability.">Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability.</a> Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability.">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li><li>Pendleton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U6+snRNA+m(6)A+Methyltransferase+METTL16+Regulates+SAM+Synthetase+Intron+Retention.">The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention.</a> Cell. 169 (5), 824-835 (2017).</li><li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'+UTR+m(6)A+Promotes+Cap-Independent+Translation.">5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation.</a> Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(6)-methyladenosine+Modulates+Messenger+RNA+Translation+Efficiency.">N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency.</a> Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).</li><li>Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine+marks+primary+microRNAs+for+processing.">N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing.</a> Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).</li><li>Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RNA+methyltransferase+BCDIN3D+regulates+microRNA+processing.">Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing.</a> Cell. 151 (2), 278-288 (2012).</li><li>Jeronimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+the+protein+interaction+network+for+the+human+transcription+machinery+reveals+the+identity+of+the+7SK+capping+enzyme.">Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme.</a> Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brd4+and+JMJD6-associated+anti-pause+enhancers+in+regulation+of+transcriptional+pause+release.">Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release.</a> Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visual Experimentation. , (2019).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).</li><li>Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+strand+switching+by+T7+RNA+polymerase.">Template strand switching by T7 RNA polymerase.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+active+recombinant+T7+RNA+polymerase+from+E.+coli.">Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).</li><li>Shelton, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+RNA+Methylation+and+Histone-Binding+Activities+of+MePCE+Regulates+P-TEFb+Activation+on+Chromatin.">Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin.</a> Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).</li><li>Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+plasmids+for+producing+RNA+in+vitro+transcripts+with+homogeneous+ends.">General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends.</a> Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).</li><li>Blazer, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Suite+of+Biochemical+Assays+for+Screening+RNA+Methyltransferase+BCDIN3D.">A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D.</a> SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).</li><li>Arango, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+Promotes+Translation+Efficiency.">Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.</a> Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NAT10+is+an+ATP-dependent+RNA+acetyltransferase+responsible+for+N4-acetylcytidine+formation+in+18+S+ribosomal+RNA+(rRNA).">Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).</li></ol>

Burada, RNA metiltransferaz aktivitesinin spesifik transkriptlere yönelik in vitro doğrulama için basit ve sağlam bir yöntem bildirilmiştir. Tahlil S-adenosyl metiyonin metil grup donör üzerinde tritiated olabilir gerçeğinden yararlanır (Şekil 1), metillenmiş RNA doğru antikorlar kullanmadan algılanması için izin. Ancak, bu tahlil hangi kalıntı veya kimyasal grup enzim tarafından metillenmiş olduğunu göstermez dikkat etmek önemlidir. Belirli bir kalıntı metilasyonlu...

DNA, RNA ve proteinler gen ifadesi1 'i sıkıca düzenleyen değişikliklere tabidir. Bu değişiklikler arasında, üç biopolymers üzerinde metilasyonlar ortaya çıkar. DNA ve protein metilasyonları son üç yılda çok iyi incelenmiştir. Buna karşılık, RNA metilasyonlarının ilgi alanı sadece son zamanlarda, RNA metilasyonları yazma, silme veya bağlama proteinlerinin geliştirme ve hastalık2' de oynacağı önemli rollerin ışığında reignited olmuştur. Bol ribozomal ve transfer Rnas 'da daha iyi bilinen fonksiyonlara ek olarak, RNA metilasyon yolları özel haberci RNA stabilitesi3,4, yapıştırma5 ve Translation6,7, Mirna işleme8,9 ve transkripsiyonel duraklatma ve sürüm10,11.
Burada, moleküler biyoloji laboratuarında RNA metiltransferaz aktivitesinin in vitro olarak doğrulanması için basit ve sağlam bir yöntem bildirilmiştir ( Şekil 1' de özetlenmiştir). Birçok çalışmada RNA 'nın metiltransferaz aktivitesini dot-blot ile bir antikor ile bir antikorla karşılaştırın. Ancak, dot-blot RNA metiltransferaz ile kuluçka üzerine RNA bütünlüğünü doğrulamaz. Bu önemlidir, çünkü nükller ile rekombinant proteinlerin bile küçük kontaminasyonları kısmi RNA bozulması ve şok edici sonuçlara yol açabilir. Dahası, yüksek spesifik RNA Modifikasyon antikorları bile değiştirilmiş RNAs 'ı belirli diziler veya yapılarla tanıyabilir. Burada bildirilen in vitro RNA metiltransferaz tahlil S-adenöl metiyonin metil grup donör üzerinde tritiated olabilir gerçeği yararlanır (Şekil 1), metillenmiş RNA doğru antikorlar kullanmadan algılanması için izin . Talimatları in vitro transkripsiyon ve faiz ve metilasyon test bir transkript arıtılması için verilir, ilgi enzim tarafından transkript söyledi. Bu yöntem esnek ve sağlamdır ve belirli bir projenin ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir. Örneğin, in vitro transkripsiyonu ve saflaştırılmış RNAs, kimyasal olarak sentezlenmiş RNAs, aynı zamanda hücresel RNAs kullanılabilir. Bu tahlil, tam olarak metilated RNA 'nın bir jel üzerinde çalıştığı yeri göstererek nitel bilgilerin yanı sıra scintite sayar formunda niceliksel bilgiler sağlar. Bu, özellikle metilasyon için hedeflenen RNA veya RNAs boyutunu doğrudan gözlemlemek için bir yöntem sağladığı için, bir RNA metiltransferaz fonksiyonuna benzersiz bir anlayış sağlayabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="851">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10821-015</td>
			<td style="width:353px;">10 bp DNA Ladder kit.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10% Ammonium Persulfate (APS)&#160;</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 &#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">10X TBE Buffer</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22&#181;m filter).</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">10X TBS</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:353px;">For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">BP1408-1</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H])</td>
			<td style="width:121px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:161px;">NET155V250UC</td>
			<td style="width:353px;">For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= 
			(1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 &#181;M.&#160;&#160; Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4&#176;C, make 20 &#181;L aliquots, and freeze them at -30&#176;C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">RPN11649</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amersham Hyperfilm MP</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">28906846</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel exposure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beckman Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS6500</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704466</td>
			<td style="width:353px;">Mini Horizontal Electrophoresis System.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:121px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:161px;">4693159001</td>
			<td style="width:353px;">For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion Cell</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">345-9902</td>
			<td>RNase free empty cassette for polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Criterion empty Cassettes</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1656001</td>
			<td>Vertical midi-format electrophoresis cell.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer</td>
			<td style="width:121px;">DeNovix</td>
			<td style="width:161px;">DS-11-S</td>
			<td style="width:353px;">Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ecoscint Original</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td style="width:161px;">LS-271</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">03-337-1</td>
			<td style="width:353px;">For liquid scintillation count.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer</td>
			<td style="width:121px;">RPI CORP</td>
			<td style="width:161px;">112600</td>
			<td style="width:353px;">For autoradiogram gel pretreatment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel dryer</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:161px;">1651745</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Gel Loading Buffer II</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM8547</td>
			<td style="width:353px;">For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneCatcher disposable gel excision tips</td>
			<td style="width:121px;">Gel Company</td>
			<td style="width:161px;">NC9431993</td>
			<td>For removing bands from agarose and polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Megascript Kit</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM1333</td>
			<td>For in vitro transcription with T7 RNA polymerase.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Perfectwestern Extralarge Container</td>
			<td style="width:121px;">Genhunter Corporation</td>
			<td style="width:161px;">NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black)</td>
			<td>Gel staining box.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pRZ</td>
			<td style="width:121px;">Addgene</td>
			<td style="width:161px;">#27663</td>
			<td style="width:353px;">Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">74204</td>
			<td style="width:353px;">For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td style="width:121px;">Qiagen</td>
			<td style="width:161px;">28704</td>
			<td style="width:353px;">Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Saran Premium Plastic Wrap</td>
			<td style="width:121px;">Saran Wrap</td>
			<td style="width:161px;">Amazon</td>
			<td style="width:353px;">For drying gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Gold</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S11494</td>
			<td>Ultra sensitive nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Nucleic acid gel stain.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TE</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">93283-100ML</td>
			<td>10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TEMED</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">110-18-9</td>
			<td style="width:353px;">For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5382000023/5361000038</td>
			<td style="width:353px;">For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td style="width:121px;">life technologies</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:353px;">Kits for fast cloning of Taq polymerase&#8211;amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TURBO DNase (2 U&#8260;&#181;L)</td>
			<td style="width:121px;">Ambion</td>
			<td style="width:161px;">AM2238</td>
			<td>For DNA removal from in vitro transcription reactions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">51456-500G</td>
			<td>For urea denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Whatman 3MM paper</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">3030-154</td>
			<td style="width:353px;">Chromatography paper for drying gel.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibody-free assay for rna methyltransferase activity analysis

RNA 'da 100 ' den fazla kimyasal olarak farklı değişiklikler vardır, üçte ikisi metilasyonlardan oluşur. RNA modifikasyonları ve özellikle metilasyonlar ile ilgili ilgi, hastalık ve kanserle ilgili biyolojik süreçlerde bunları yazarak ve silen enzimlerin oynadığı önemli roller nedeniyle yeniden ortaya çıkmıştır. Burada, sentetik veya in vitro transkripsiyonu RNAs üzerinde RNA metilasyon yazar aktivitesinin doğru analizi için hassas bir in vitro tahlil sağlanır. Bu tahlil S-adenosyl-metiyonin bir tritiated formu kullanır, tritium ile metilated RNA doğrudan etiketleme sonucu. Trityum radyasyon düşük enerji yöntemi güvenli hale getirir, ve önceden mevcut trityum sinyal amplifikasyon yöntemleri, ölçmek için mümkün kılmak ve antikorlar kullanmadan metylated RNA görselleştirmek için, genellikle eserler eğilimli olan. Bu yöntem RNA metilasyonu için yazılırken, birkaç tweaks radyoaktif olarak etiketlenmiş olabilir diğer RNA modifikasyonları çalışma için geçerli hale, 14C Asetil koenzim A ile RNA asetilasyon gibi. genel olarak, bu TAHLIL hızlı RNA değerlendirmek için izin verir metilasyon koşulları, küçük molekül inhibitörleri ile inhibisyonu veya RNA veya enzim mutantlarının etkisi, hücrelerde elde edilen sonuçları doğrulamak ve genişletmek için güçlü bir araç sağlar.

In vitro transkripsiyon reaksiyonu Şekil 2 A , bir in vitro transkripsiyon reaksiyonunun, nispeten kısa (331 NT) ve yüksek yapısal RNA olan 7Sk snRNA 'NıN T7 RNA polimeraz ile tipik bir çalışmasını temsil eder. Bu RAW görüntü üzerinde gösterildiği gibi, birden fazla istenmeyen bantları, hem kısa ve 7SK daha uzun, muhtemelen rasgele transkripsiyon başlatma veya sonlandırma olayları kaynaklanan vardır. Bu nedenle, in vitro transkripsiy...

Watch this Scientific Journal Video about Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis at JoVE.com

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

Burada, sentetik veya in vitro transkripsiyonu RNA üzerinde metiltransferaz aktivitesinin doğrudan analizi için antikor içermeyen bir in vitro tahlil açıklanmıştır.

RNA metiltransferaz aktivite analizi için Antibody Içermeyen tahlil

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

RNA'nın üçte ikisi metilasyonolmak üzere 100'den fazla farklı modifikasyonu vardır. Bu protokol, RNA metilasyon yazar etkinliğinin hassas ve doğru analizi için bir yöntem sağlar. Bu kullanımı kolay teknik, genellikle eserlere yatkın olan antikorlar kullanmadan metillenmiş RNA'yı ölçmemize ve görselleştirmemize olanak sağlar.Prosedürü gösteren Samantha Shelton, benim laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi olacak. Bu prosedürü başlatmak için, metin protokolünde belirtildiği gibi, buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir tüp içinde 100 mikrolitrelik RNA metiltransferaz test ayarlayın. Girdap tüp iyice karıştırmak için, ve tüpün altındaki çözeltiyi toplamak için beş saniye boyunca 200 kez g santrifüj.Tüpü 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi sütun arınmasını kullanarak reaksiyonu temizleyin. Sıvı sintillasyon sayısını gerçekleştirmek için, numune başına bir şişe, arka plan ölçümü için bir şişe ve kaydırma testi için bir şişe ile sintillasyon sayımı rafını ayarlayın.Şişeleri beş mililitre sintilasyon sayma çözeltisi ile doldurun. Bir şişe içine her eluted radyoaktif RNA örnek 10 mikrolitre ekleyin. Kapağı nı sıkın ve hafifçe karıştırın.Kaydırma testi şişelerini hazırlamak için, işlem sırasında kullanılan tüm yüzeylere ve ekipmanlara pamuklu bezleri iyice ovun. Scintillation çözeltisi ile dolu şişelere bu bezleri ekleyin ve kapağı sıkın. Örnekleri Sintillation sayacında çalıştırmak için, tezgah başlığını açın, rafı makineye takın ve kaputu kapatın.Count Tek Raf'ı seçin. Kullanıcı Programını Seç'i seçin. 60 saniye boyunca trityum ölçen bir program seçin veya oluşturun ve Count Rack'e çarptı.Sintillation sayısını üç kez tekrarlayın. Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi, bir üre denaturing poliakrilamid jel, yeniden çalıştırın. 20 mikrolitre radyoaktif RNA materyalini 20 mikrolitre 2X jel yükleme tamponu içeren 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.Merdiveni hazırladıktan sonra, örnekleri 70 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. Jel tanklarından gelen tamponu jelin kuyularına boru layarak numune yüklemesinden hemen önce jelkuyularını bir kez daha yıkayın. Daha sonra, hazırlanan merdivenin 20 mikrolitresini, numunelerin 20 mikrolitresini ve jelin şeritlerine 20 mikrolitre 1X jel yükleme tamponu yükleyin.Poliakrilamid yüzdesine bağlı olarak, 60 ila 180 dakika boyunca 100 volt jel çalıştırın. Jel çalışma bittikten sonra, kasetten jel çıkarın ve ultrahassas nükleik asit jel leke beş mikrolitre ile 1X TBE tampon 50 mililitre içeren bir kutu ya. RNA'yı lekelemek için bir rockçıya beş dakika kuluçkaya yat.Bundan sonra, dikkatle kutunun jel almak ve kuyular ve soldaki merdiven ile jel görüntüleme sisteminin UV transilluminator üzerine yerleştirin. Kamerayı jelin üzerine odakla, UV ışığını açın ve jelin görüntüsünü alın. Ardından, UV pozlamasını kapatın ve görüntüyü TIFF dosyası olarak kaydedin.Jeli kutuya geri yerleştirin, TBE'yi çıkarın ve 30 dakika oda sıcaklığında bir kayaç üzerinde 50 mililitre sabitleme çözeltisi ile jeli düzeltin. Daha sonra jeli, 25 mililitre otoradyografi arttırıcı solüsyon içeren taze bir kara kutuya hafifçe taşıyın. 30 dakika oda sıcaklığında rocker üzerinde kuluçka.Jeli yavaşça kaldırın ve kuyular yukarı ve sağ taraftaki merdivenle plastik bir sargı üzerine yüz aşağı yerleştirin. Jelin arkasına iki yaprak kromatografi kağıdı yerleştirin ve tüm desteyi çevirin. Jel kurutma makinesini önceden 80 dereceye ısıtın.Jel kurutucuüzerindeki plastik kapağı geri hareket ettirin. Tüm desteyi plastik kapağın altına yerleştirin ve plastik kapağı bir mühür oluşturmak için aşağı doğru hareket ettirin. Jeli 80 derecede bir saat kurutun.Sonra, jel kurutucu kapatın ve yavaşça yığını çıkarın. Sarma ve ikinci kromatografi kağıdını çıkarın. Kalan kromatografi kağıdını kurutulmuş jelle birlikte otoradyogram kasete kaydedin.Karanlık bir odada, otoradyografi film bir sayfa ekleyin. Kaseti negatif 80 santigrat derecede saklayın ve sinyali yoğunluğuna bağlı olarak filmi uygun zamanda geliştirin. Film geliştirildikten sonra, kasetin üzerine yerleştirin ve jelin dört kenarını, her kuyuyu ve XC ve BB boyalarının konumunu dikkatlice işaretlemek için bir laboratuvar işaretçisi kullanın.Filmi inç başına 300 veya 600 piksel çözünürlükte tarayanın ve görüntüyü TIFF dosyası olarak kaydedin. Bu çalışmada RNA metiltransferaz aktivitesini analiz etmek için antikorsuz bir analiz gösterilmiştir. 7SK küçük nükleer RNA'nın T7 RNA polimeraz ile in vitro transkripsiyon reaksiyonundan tipik bir çalışma nispeten kısa ve yüksek yapılandırılmış RNA gösterir.7SK'dan daha kısa ve daha uzun, muhtemelen rasgele transkripsiyon elolayı veya sonlandırma olaylarından kaynaklanan birden fazla istenmeyen bant vardır. Bu nedenle, in vitro transkripsiyon reaksiyonu sonrasında jel arıtma temiz bir RNA örneği elde etmek için önemlidir. Bu noktada, ilgi RNA merdivene göre konumu ile tespit edilebilir ve jel arıtma ile saflaştırılmış.Önerilen RNA ve protein konsantrasyonlarının alt limitini kullanan temsili bir RNA metiltransferaz tayı burada gösterilmiştir. Bu tahsin, hem sintillasyon sayılarından hem nicel sonuçlar hem de otoradyogramdan nitel sonuçlar sağlar. Burada 7SK'yi metilatabildiği bilinen bir RNA metiltransferazın u6'yı da metilatilemlet edebildiği gösterilmiştir. Ayrıca, son zamanlarda 7SK için gösterildiği gibi, MePCE histon H4 bağlanması da U6 metilasyon inhibe.Bu, hem sintilasyon sayısında hem de bu protokolün sağlamlığını gösteren otoradyogramda görülebilir. RNA bozulmaya karşı hassastır, bu nedenle lütfen RNase içermeyen reaktifleri kullandığınızdan ve tüm yüzeyleri ve ekipmanları iyice temizlediğinden emin olun. Bu metiltransferaz tayından elde edilen radyoaktif etiketli RNA, örneğin elektroforetik hareketlilik kayması tonu ile RNA demethylaz aktivitesini veya RNA bağlama aktivitesini değerlendirmek için doğrudan kullanılabilir.Bu yöntem, araştırmacıların nokta mutasyonları ve küçük molekül inhibitörü tedavileri de dahil olmak üzere farklı faktörlerin RNA metiltransferaz aktivitesi üzerindeki etkisini test etmesine olanak tanır. Bu yöntem radyoaktif madde kullanır, bu nedenle uygun PPE giymek emin olun, ve taşıma ve radyoaktif maddelerin atılması sırasında dikkatli olun.

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

arasında Transkriptomik Analizi<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</emGalaxy Projesi Smokin Suite sayesinde&gt; RNA Sıralama Veri

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

İnsan revers transkriptaz protein RNA'ya bağımlı RNA polimeraz aktivitesinin yarı kantitatif algılama

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Uzun kodlamayan RNA, RNA hedefleri tanımlamak için RNA Pull-down yordamı

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolik 4-thiouracil ve bir miktar ile etiketleme yeni mRNA RNA polimeraz II etkinlik için bir Proxy olarak sentezlenmiş

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR Kılavuzu RNA memeli sistemler için klonlama

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Diseksiyon eş transkripsiyon RNA Işleme etkinlikleri için suni RNA polimeraz II uzama kompleksler

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...