Name: ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation
Uploaded: 2019-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation at JoVE.com

ونشكر السيدة رومي كيمب والسيدة أنيت أوبيتز على الدعم التقني الخبير. كما نشكر السيد بيورن بينينغ على دعمه في تكنولوجيا المعلومات. تم دعم هذا العمل بمنح من (أ) كلية الطب كارل غوستاف غوستاف (كاروس دريسدن) ونحن ممتنون للتمويل والدعم.

يتبع البروتوكول التالي المبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية الحيوانات من جامعة دريسدن التقنية، ألمانيا (رقم الملف: T 2014/4) وكذلك المبادئ التوجيهية المقبولة دوليا لرعاية الحيوانات (FELASA)17. يصور الشكل 1 عملية عزل الخلية.
1. إعداد الإعداد والمواد ووسائل ?...

<ol>
	<li>Baum, J., Duffy, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+and+myofibroblasts:+what+are+we+talking+about.">Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).</li><li>Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+identity+of+cardiac+fibroblasts.">Redefining the identity of cardiac fibroblasts.</a> Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).</li><li>Weissman-Shomer, P., Fry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+fibroblasts+senscence+in+vitro:+pattern+of+cell+division+and+life+span+as+a+function+of+cell+density.">Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).</li><li>Angello, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+potential+and+the+duration+of+the+cell+cycle+in+human+fibroblasts:+coordinate+stimulation+by+epidermal+growth+factor.">Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).</li><li>Serra, V., von Zglinicki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fibroblasts+in+vitro+senesce+with+a+donor-specific+telomere+length.">Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length.</a> FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).</li><li>Mateu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differences+between+neonatal+and+adult+fibroblasts+and+keratinocytes:+Donor+age+affects+epithelial-mesenchymal+crosstalk+in+vitro.">Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro.</a> International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).</li><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Cardiac+Fibroblast.">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Kuenzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+epigenetic+silencing+of+polo-like+kinase+2+promotes+fibrosis+in+atrial+fibrillation.">Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation.</a> bioRxiv. , 445098 (2018).</li><li>Van Linthout, S., Miteva, K., Tsch&#246;pe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+fibroblasts+and+inflammatory+cells.">Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer.">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li><li>Poulet, C., K&#252;nzel, S., B&#252;ttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+physiological+functions+and+ion+currents+in+atrial+fibroblasts+from+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation.</a> Physiological Reports. 4 (2), (2016).</li><li>G&#252;nd&#252;z, D., Hamm, C. W., Aslam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Isolation+of+High+Quality+Cardiomyocytes,+Endothelial+Cells,+and+Fibroblasts+from+an+Adult+Rat+Heart.">Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).</li><li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells.">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li><li>Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+enzymatic+isolation+of+fibroblasts+for+the+creation+of+autologous+skin+substitutes.">Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).</li><li>El-Armouche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+inhibitor-1-deficient+mice+are+protected+from+catecholamine-induced+arrhythmias+and+myocardial+hypertrophy.">Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy.</a> Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).</li><li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FELASA+Guidelines+and+Recommendations.">FELASA Guidelines and Recommendations.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).</li><li>Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblasts+differentiate+from+fibroblasts+when+plated+at+low+density.">Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).</li><li>Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+in+cell+culture+systems:+myofibroblasts+all+along.">Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).</li><li>Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484</a> (2019)</li><li>Copp&#233;, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor.">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li><li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease:+from+mechanisms+to+therapy.">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li><li>Singh, M., Sharma, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowth+of+fibroblast+cells+from+goat+skin+explants+in+three+different+culture+media+and+the+establishment+of+cell+lines.">Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).</li><li>Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+removal+of+fibroblasts+from+human+tissue+culture+systems.">A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems.</a> Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).</li></ol>

بالمقارنة مع خطوط الخلايا الليفية الخالدة، تقدم الخلايا الليفية الأولية العديد من المزايا. ويمكن عزلها من حيث التكلفة بشكل فعال في نوعية عالية وكمية. وعلاوة على ذلك، توفر الثقافات الأولية إمكانية دراسة الخلايا من أفراد متعددين، مما يزيد من موثوقية النتائج التي تم الحصول عليها ويقلل من ا?...

الخلايا الليفية هي خلايا مسطحة على شكل مغزل مع عمليات ستيلات متعددة وreticulum endoplasmic واسعة النطاق1،2. متوسط قياس الليفية 30 - 100 ميكرومتر ولها مدىالحياة من 57 ± 3 أيام 1،3. متوسط مدة دورة الخلية من الخلايا الليفية البشرية تتراوح بين 16 - 48 ساعة اعتمادا على ظروف الثقافة4. هناك أدلة على أن القدرة المستنسخة والجودة الوظيفية للفليائيات الأولية المستزرعة ترتبط سلبا مع سن المانحين، مما يشير إلى أنه ينبغي تفضيل المانحين الأصغر سنا (الحيوانات أو المرضى) إذا كان ذلك ممكنا5و6 .
تشكل الخلايا الليفية نوع الخلية السائد لمعظم أنسجة الجسم الثدييات. على الرغم من وجودها في كل مكان، وتحديد الجزيئية من الخلايا الليفية لا يزال تحديا7. تنتقل الخلايا الليفية إلى تطوير الأنسجة والأعضاء من مصادر مختلفة أثناء النمو الجنيني8. لهذا السبب، هناك عدد كبير من البروتينات علامة التي يمكن العثور عليها في الخلايا الليفية في حين أن البروتينات علامة فريدة من نوعها، والتي هي موجودة في كل السكان الأورام الليفية والحصرية للفليّة، لا تزال مفقودة. وهكذا، عادة ما تستخدم أنماط التعبير من عدة علامات معترف بها لتحديد الخلايا الليفية. من بين العلامات الأكثر شهرة هي فيمنتين، بروتين سطح الليفية البشرية (hFSP)، مستقبلات المجال المديسكوين 2 (DDR2) وألفا الأكتين العضلات الملساء (αSMA).
الخلايا الليفية هي المصفوفة الرئيسية خارج الخلية (ECM) المنتجة لنوع الخلية. وبالتالي، فإن الخلايا الليفية تحافظ علىبنية الأنسجة المنظمة وتوفر الدعم الميكانيكي للخلايا المجاورة 1. التوازن بين توليف إدارة المحتوى في المؤسسة والتدهور هو عملية منظمة تنظيماجيدا. التحولات نحو التوليف علامة على بداية الترسيب ECM المفرطالذي، إذا لم يتم إنهاؤه، يؤدي إلى التليف. يتم التوسط في التليف من قبل myofibroblasts، والتي تنشأ من الخلايا الليفية المنشطة التي تمر التغيرات الجزيئية والفيلونمطية. إحدى السمات المميزة للمقلبين هو تعزيز إفراز ECM والسيتوكينات والتعبير عن خيوط αSMA الدقيقة مرتبة بشكل منظم9.
وقد تم الخلايا الليفية الأولية في دائرة الضوء على البحوث الأخيرة التي تركز على التليف, التهاب الأنسجة والتفاعلات الليفية السرطان الخلية10,11. ومع ذلك، لدراسة فعالة خصائص الخلايا الليفية في الصحة والمرض، فمن الضروري لعزل الخلايا الليفية الأولية القابلة للحياة الكبار على أساس منتظم. هناك العديد من الطرق المتاحة لعزل الخلايا الليفية12،13،14. الطرق الرئيسية الثلاثة لعزل الليفية هي النمو من قطع الأنسجة12، هضم الأنسجة الأنزيمية15، والتسريب الأنزيمي للأعضاء جوفاء9،13،16. ميزة النمو هو عملية عزل لطيف دون تدهور الخلايا الأنزيمية. ومن ناحية أخرى، عادة ما تتطلب ثقافات النمو فترات ثقافية مطولة حتى يمكن استخدام الخلايا للتجارب. الهضم الأنزيمي الشائع سريع ولكنه يحمل خطر التلوث مع أنواع الخلايا الأخرى (على سبيل المثال، الخلايا البطانية) أو البكتيريا في عملية التحريض، وهو أمر ضروري لحل الأنسجة ميكانيكيا. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الأساليب غالبا ما تكون مفصلة وتتطلب وقتا ومهارة للتعلم.
وفيما يتعلق بأهمية الخلايا الليفية الأولية في البحوث، لا تزال هناك حاجة إلى تحسين نُهج عزل الخلايا القائمة من حيث السرعة والبساطة والموثوقية. هنا، يتم توفير طريقة جديدة العزل الأورام الليفية الأنزيمية المستندة إلى الموجات فوق الصوتية تقديم خلايا عالية الجودة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1103px;" width="1103">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">T4049-100ML</td>
			<td style="width:405px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotics</td>
			<td>Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>Gibco LS15140148&#160;</td>
			<td>Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>51023608</td>
			<td>HeraSafe KSP15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>50049176</td>
			<td>BBD 6220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on vessel</td>
			<td>6-, 12-, 24-wells Nunclon surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture suction</td>
			<td style="width:339px;">VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany</td>
			<td>20727400</td>
			<td style="width:405px;">BVC professional suction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell strainer (mesh)</td>
			<td>Corning, Tewksbury, USA</td>
			<td style="width:143px;">431750</td>
			<td>40 &#181;m Nylon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:339px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td style="width:143px;">75007213</td>
			<td>Megafuge 8R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cordless pipetting controller</td>
			<td>Hirschmann, Eberstadt, Germany</td>
			<td>9907200</td>
			<td>Pipetus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>SafeSeal tips for pipettes (10 &#181;l, 20 &#181;l, 100 &#181;l, 200 &#181;l, 1000 &#181;l)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable plastic pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable sterile scalpel</td>
			<td>Myco Medical, Cary, USA</td>
			<td style="width:143px;">n.a.</td>
			<td>Techno cut</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:339px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>41965-062</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany&#160;</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>50 &#181;l, 500 &#181;l, 1.500&#181;l, 2.000 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>F2442-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase blend</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">5401020001</td>
			<td>Liberase TL Research Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish 6 cm</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Senescence detection kit</td>
			<td style="width:339px;">Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>ab65351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Shaker/ Vortex</td>
			<td style="width:339px;">IKA, Staufen im Breisgau, Germany</td>
			<td style="width:143px;">n.a.</td>
			<td>MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile plastic tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>Falcon 352095</td>
			<td>BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrasonic water bath</td>
			<td>BANDELIN electronic GmbH &#38; Co. KG, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:143px;">312</td>
			<td>Sonorex RK100H</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical scissors (atraumatic)</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">NR 82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical scissors&#160;</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">eq 1060.09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical forceps</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">BD577</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation

أصبحت الخلايا الليفية الأولية للبالغين أداة هامة لدراسة التليف والتفاعلات الليفية والالتهاب في جميع أنسجة الجسم. وبما أن الخلايا الليفية الأولية لا يمكن أن تقسم إلى أجل غير مسمى بسبب تمايز myofibroblast أو تحريض الحساسية، يجب إنشاء ثقافات جديدة بانتظام. ومع ذلك، هناك العديد من العقبات التي يجب التغلب عليها خلال عمليات وضع بروتوكول عزل موثوق بها والعزلة الليفية الأولية نفسها: درجة صعوبة الأسلوب (وخاصة للمبتدئين)، وخطر التلوث البكتيري، و الوقت المطلوب حتى يمكن استخدام الخلايا الليفية الأولية للتجارب، ونوعية الخلايا اللاحقة وصلاحيتها. في هذه الدراسة، يتم توفير بروتوكول سريع وموثوق به وسهل التعلم لعزل وثقافة الخلايا الليفية الأولية للبالغين من قلب الماوس والرئة والكبد والكلى التي تجمع بين الهضم الأنزيمي والهياج بالموجات فوق الصوتية.

وقد ثبت قدرة هذا البروتوكول على عزل الخلايا الليفية للبالغين من أنسجة المورين الصلبة. تم الحصول على الخلايا الليفية القابلة للحياة التي يمكن استخدامها للتجارب اللاحقة مثل تلطيخ المناعة أو تجارب الانتشار (الشكل2D-F، الشكل 5A).
<p class="jove_conten...

Watch this Scientific Journal Video about Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation at JoVE.com

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

نقدم بروتوكولًا لعزل الخلايا الليفية للبالغين في المرحلة الابتدائية بطريقة سهلة وسريعة وموثوق بها، يمكن تنفيذها من قبل المبتدئين (على سبيل المثال، الطلاب). يجمع الإجراء بين هضم الأنسجة الأنزيمية والهياج الميكانيكي مع الموجات فوق الصوتية للحصول على الخلايا الليفية الأولية. ويمكن تكييف البروتوكول بسهولة مع متطلبات تجريبية محددة (مثل الأنسجة البشرية).

بالموجات فوق الصوتية زيادة الابتدائية الكبار العزلة الليفية

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

بروتوكولنا يوفر ونهج سهل وسريع لعزلة الخلايا الليفية الأولية مع التركيز الواضح على تجنب تلوث البكتيريا، والتي يمكن أن تكون مشكلة كبيرة. خاصة للمبتدئين. الميزة الرئيسية لتقنيتنا هي بساطتها.كما أنها لا تتطلب مهارات أو خبرة يدوية واسعة ويمكن تعلمها بسهولة من قبل الجميع في غضون فترة تدريب قصيرة. تقديم هذه التقنية سيكون مانجا نيو، وهو فني من خارج المختبر. قبل البدء في تشريح، وضعت على اثنين من أزواج من القفازات المتاح، واحد على رأس الآخر.وأصلح الماوس إلى لوحة البوليسترين. تطهير الفراء مع 70٪ الإيثانول، والتأكد من أن الحيوان غارقة. واستخدام الإيثانول معقمة ملقط الجراحية والمقص الاتنامية لكوب الجلد الحق فوق الجهاز البولي التناسلي.قطع ثلاثة إلى أربعة سنتيمترات على طول خط الوسط من الشق الأولي إلى الرقبة، مضيفا تخفيضات الإغاثة في الأطراف. وثب الجلد على الوسادة لتحقيق الوصول الأمثل إلى العضلات التي تغطي تجويف البطن. ثم، تطهير العضلات البطن مرتين مع الإيثانول الطازجة 70٪.عندما يجفف الإيثانول، قم بإزالة أول زوج من القفازات. واستخدام مجموعة جديدة معقمة من ملقط ومقص لتحني طبقة العضلات لفتح تجويف البطن والصدر. لإزالة الأجهزة ذات الاهتمام، فهم بلطف كل عضو مع ملقط الجراحية دون ثقب الأنسجة.واستخدام مقص لقطع بعناية توريد الأوعية الدموية بالقرب من نقطة دخول الجهاز. ضع كل عضو في أنبوب من برنامج تلفزيوني معقمة وباردة وإغلاق الأنبوب بإحكام. وضع كل أنبوب على الجليد الرطب كما يتم جمع الأعضاء.عندما تم حصاد جميع الأعضاء، رش الأنابيب مع 70٪ الإيثانول قبل وضعها في غطاء زراعة الخلايا العقيمة. ارتداء زوج جديد من القفازات، واستخدام ملقط العقيمة لنقل كل عضو على نصف طبق بيتري ستة سنتيمترات عقيمة. وغسل الأعضاء لفترة وجيزة مع برنامج تلفزيوني جديد لإزالة الدم الزائد.نقل الأجهزة المشطفة إلى النصف الثاني من كل طبق بيتري وإزالة برنامج تلفزيوني الزائدة. باستخدام مشرطين عقيمين ، قم بتلمي الأعضاء إلى شظايا من ملليمتر إلى 2. واستخدام ملعقة معقمة لنقل قطع الأنسجة إلى أنابيب جديدة، فردية، معقمة، 15 ملليلتر.إضافة ملليلترين من 0.25٪ تريبسين حل لكل أنبوب. ووضع الأنابيب في حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. في نهاية الحضانة، دوامة الأنابيب في حوالي 1400 دوران في الدقيقة لمدة عشر ثوان.وقبض على رد فعل التربسين مع أربعة ملليلتر من وسيلة الثقافة المناسبة تستكمل مع مصل عجل الجنين في الأنبوب الواحد. المقبل، إضافة حجم مناسب من الحل مزيج collagenase إلى كل أنبوب. ووضع الأنابيب في حمام الماء بالموجات فوق الصوتية 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.في نهاية سونيكيشن، دوامة بلطف الأنابيب لمدة 10 ثانية. قبل وضع الأنابيب مرة أخرى إلى حمام الماء بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق أخرى. في نهاية سونيكيشن الثاني، دوامة الأنابيب لمدة 10 ثانية أخرى.وتطهير الأنابيب مع 70٪ الإيثانول. في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، تصفية تعليق الخلية من خلال مصافي 40 ميكرومتر الفردية في أنبوب جديد، عقيم، 15 ملليلتر. وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.إعادة تعليق الكريات في ملليلتر واحد من المتوسطة الطازجة لكل أنبوب. وترى الخلايا في أوعية مناسبة لثقافة الخلية في كثافة الطلاء المناسبة. ثم، ضع الخلايا في الحاضنة ثقافة الخلية بين عشية وضحاها.في صباح اليوم التالي، يغسل كل ثقافة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني قبل إضافة المتوسطة الطازجة وإعادة الخلايا إلى الحاضنة. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن الحصول على الخلايا الليفية القابلة للحياة لاستخدامها في التجارب اللاحقة. مثل تجارب التلطيخ أو الانتشار من الفلورسنت الأمينية.الخلايا الليفية للبالغين هي خلايا مسطحة على شكل مغزل مع عمليات خلوية متعددة تنمو عادة في أحادية الطبقات. ومع ذلك، يمكن ملاحظة اختلافات مورفولوجية متميزة في مجموعات الخلايا الليفية من مختلف الأعضاء. على سبيل المثال، تكون الخلايا الليفية الكلوية أصغر وتنمو بكثافة أعلى من الخلايا الليفية القلبية أو الرئوية أو الكبدية.تظهر الخلايا الليفية المعزولة معدلات انتشار عالية، لتصل إلى التقاء بصري يزيد عن 90٪ بعد حوالي ستة أيام. هنا، يمكن ملاحظة myofibroblast متمايزة مع مميزة ألفا العضلات الملساء actin microfilaments. توجد هذه الخلايا بكثرة في الثقافات القلبية والكلى والكبدية وخلايا الرئة.في حين أن حوالي 20 إلى 30 في المئة فقط من الخلايا المعزولة والمثقف تعبر عن منظم, مرتبة, ألفا العضلات الملساء actin microfilaments, تقريبا كل من الخلايا إيجابية ل Vimentin وS discoidin مستقبلات المجال 2 بعد سبعة أيام في الثقافة. أهم شيء يجب تذكره هو استخدام التقنية الصحيحة طوال الإجراء حيث يجب تجنب تلوث البكتيريا. بعد العزلة الليفية الأولية ، يمكن استخدام الخلايا لجميع أنواع تجارب الطب النفسي والتوصيف.مثل انتشار الكيمياء المناعية أو المقالات التئام الجروح، أو التقييمات البيولوجية الجزيئية.

Research

JoVE Journal

Medicine

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

الثقافة الأولية من الإنسان الدهليزي Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

ورم الابتدائي وMEF عزل الخلايا لدراسة الرئة الانبثاث

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية الأولية من الشرايين والأوردة الكلاب

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

عزل وزراعة كارديوميوسيتيس الفئران الكبار

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

عزل خلايا Decidual البشرية الأولية من الأغشية الجنينية لمصطلح مترافق

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

عزل خلايا الكبد الماوس الأساسي لتحليل توليف البروتين الوليدة بأسلوب العلامات غير مشعة L-أزيدوهوموالانيني

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

عزل الخلايا الماية الأذينية من الفئران البالغة

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

نموذج احتشاء عضلة القلب Murine باستخدام الربط الدائم للشريان التاجي الأمامي الأيسر

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

تنقية الأنسجة المستندة إلى الوضوح لمنظمة الخلايا الليفية ثلاثية الأبعاد في قلوب الفئران الصحية والمصابة

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

تعديلات على طريقة Langendorff لعزل المتزامنة من الخلايا العضلية الأذيني والبطيني من الفئران الكبار

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...