Name: ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation
Uploaded: 2019-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation at JoVE.com

Vi takker fru Romy Kempe og fru Annett Opitz for ekspert teknisk support. Vi takker også hr. Bjoern Binnewerg for IT-støtte. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra a) Förderkreis Dresdner Herz-kreislauf-tage e.V., b) "Habilitationsförderprogramm für Frauen", det medicinske fakultet Carl Gustav Carus Dresden og c) Else Kröner-Forschungskolleg (EKFK) Faculty of Medicine Carl Gustav Carus Dresden. Vi er taknemmelige for finansieringen og støtten.

Følgende protokol følger de institutionelle retningslinjer for dyrepasning i Technische Universität Dresden, Tyskland (sagsnummer: T 2014/4) samt internationalt accepterede retningslinjer for dyrepasning (FELASA)17. Figur 1 visualiserer celle isolations processen.
1. klargøring af setup, materiale og medier
<ol><li>Forbered cellekulturmedium, PBS opløsning, kollagenase blanding stamopløsning (rekonstruere 50 mg lyofiliseret kollagen...

<ol>
	<li>Baum, J., Duffy, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+and+myofibroblasts:+what+are+we+talking+about.">Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).</li><li>Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+identity+of+cardiac+fibroblasts.">Redefining the identity of cardiac fibroblasts.</a> Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).</li><li>Weissman-Shomer, P., Fry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+fibroblasts+senscence+in+vitro:+pattern+of+cell+division+and+life+span+as+a+function+of+cell+density.">Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).</li><li>Angello, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+potential+and+the+duration+of+the+cell+cycle+in+human+fibroblasts:+coordinate+stimulation+by+epidermal+growth+factor.">Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).</li><li>Serra, V., von Zglinicki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fibroblasts+in+vitro+senesce+with+a+donor-specific+telomere+length.">Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length.</a> FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).</li><li>Mateu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differences+between+neonatal+and+adult+fibroblasts+and+keratinocytes:+Donor+age+affects+epithelial-mesenchymal+crosstalk+in+vitro.">Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro.</a> International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).</li><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Cardiac+Fibroblast.">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Kuenzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+epigenetic+silencing+of+polo-like+kinase+2+promotes+fibrosis+in+atrial+fibrillation.">Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation.</a> bioRxiv. , 445098 (2018).</li><li>Van Linthout, S., Miteva, K., Tsch&#246;pe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+fibroblasts+and+inflammatory+cells.">Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer.">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li><li>Poulet, C., K&#252;nzel, S., B&#252;ttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+physiological+functions+and+ion+currents+in+atrial+fibroblasts+from+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation.</a> Physiological Reports. 4 (2), (2016).</li><li>G&#252;nd&#252;z, D., Hamm, C. W., Aslam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Isolation+of+High+Quality+Cardiomyocytes,+Endothelial+Cells,+and+Fibroblasts+from+an+Adult+Rat+Heart.">Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).</li><li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells.">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li><li>Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+enzymatic+isolation+of+fibroblasts+for+the+creation+of+autologous+skin+substitutes.">Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).</li><li>El-Armouche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+inhibitor-1-deficient+mice+are+protected+from+catecholamine-induced+arrhythmias+and+myocardial+hypertrophy.">Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy.</a> Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).</li><li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FELASA+Guidelines+and+Recommendations.">FELASA Guidelines and Recommendations.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).</li><li>Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblasts+differentiate+from+fibroblasts+when+plated+at+low+density.">Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).</li><li>Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+in+cell+culture+systems:+myofibroblasts+all+along.">Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).</li><li>Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484</a> (2019)</li><li>Copp&#233;, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor.">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li><li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease:+from+mechanisms+to+therapy.">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li><li>Singh, M., Sharma, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowth+of+fibroblast+cells+from+goat+skin+explants+in+three+different+culture+media+and+the+establishment+of+cell+lines.">Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).</li><li>Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+removal+of+fibroblasts+from+human+tissue+culture+systems.">A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems.</a> Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).</li></ol>

Sammenlignet med udødeliggjort fibroblast cellelinjer, primære fibroblaster giver flere fordele. De kan være isolerede omkostninger effektivt i høj kvalitet og kvantitet. Endvidere, primære kulturer giver mulighed for at studere celler fra flere individer, hvilket øger pålideligheden af de opnåede resultater og mindsker sandsynligheden for blot at studere cellekultur artefakter. Kontinuerlig generation af nye primære kulturer forhindrer genetiske ændringer, som almindeligvis opstår efter gentagen passaging<sup...

Fibroblaster er flade, spindel formede celler med flere stellat processer og en omfattende ru endoplasmatiske reticulum1,2. En gennemsnitlig fibroblast måler 30-100 μm og har en levetid på 57 ± 3 dage1,3. Den gennemsnitlige celle cyklus varighed af humane fibroblaster spænder fra 16-48 h afhængigt af dyrkningsbetingelserne4. Der er tegn på, at den replikerende kapacitet og funktionelle kvalitet af dyrkede primære fibroblaster negativt korrelerer med donor alderen, hvilket tyder på, at yngre donorer (dyr eller patienter) bør foretrækkes, hvis det er muligt,5,6 .
Fibroblaster udgør en fremherskende celletype af de fleste pattedyr kropsvæv. På trods af deres allestedsnærværende tilstedeværelse, er den molekylære identifikation af fibroblaster stadig en udfordring7. Fibroblaster migrerer til udvikling af væv og organer fra forskellige kilder under fosterudvikling8. Af denne grund er der en overflod af markør proteiner, der kan findes i fibroblaster, mens unikke markør proteiner, som er til stede i hver fibroblast befolkning og eksklusiv for fibroblaster, stadig mangler. Således udtryk mønstre af flere anerkendte markører er normalt bruges til at identificere fibroblaster. Blandt de mest anerkendte markører er vimentin, humant fibroblast overflade protein (hFSP), diskoidin domæne receptor 2 (DDR2) og alpha glat muskel actin (αSMA).
Fibroblaster er den vigtigste ekstracellulære matrix (ECM)-producerende celletype. Derved opretholder fibroblaster en velordnet vævs arkitektur og yder mekanisk støtte til tilstødende celler1. Balancen mellem ECM syntese og nedbrydning er en velreguleret proces. Forskydninger mod syntese markere begyndelsen af overdreven ECM deposition, som, hvis ikke afsluttet, fører til fibrose. Fibrose medieres af myofibroblaster, som stammer fra aktiverede fibroblaster, der gennemgår molekylære og fænotypiske forandringer. Et kendetegn for myofibroblaster er øget sekretion af ECM og cytokiner og udtrykket af ordnede arrangeret αSMA Micro filamenter9.
Primære fibroblaster har været i rampelyset for nylig forskning med fokus på fibrose, vævs betændelse og fibroblast-cancer-celle interaktioner10,11. Men for effektivt at studere fibroblast egenskaber i sundhed og sygdom, er det nødvendigt at isolere levedygtige primære voksne fibroblaster på en regelmæssig basis. Der er flere metoder til rådighed til at isolere fibroblaster12,13,14. De tre vigtigste metoder til fibroblast isolation er udvækst fra væv bidder12, enzymatisk væv fordøjelse15, og enzymatisk perfusion af hule organer9,13,16. Fordelen ved udvækst er en blid isolations proces uden enzymatisk cellenedbrydning. På den anden side, udvækst kulturer normalt kræver langvarig kultur perioder, indtil cellerne kan bruges til eksperimenter. Almindelig enzymatisk fordøjelse er hurtig, men bærer en risiko for kontaminering med andre celletyper (f. eks. endotelceller) eller bakterier i agitations processen, hvilket er nødvendigt for mekanisk at opløse vævet. Desuden er disse metoder ofte udførlige og kræver tid og dygtighed til at lære.
Med hensyn til vigtigheden af primære fibroblaster i forskning, er der stadig behov for at optimere eksisterende celle isolation tilgange i form af hurtighed, enkelhed og pålidelighed. Her leveres en roman ultralyds baseret enzymatisk fibroblast isolationsmetode, der leverer højkvalitets celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1103px;" width="1103">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">T4049-100ML</td>
			<td style="width:405px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotics</td>
			<td>Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>Gibco LS15140148&#160;</td>
			<td>Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>51023608</td>
			<td>HeraSafe KSP15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>50049176</td>
			<td>BBD 6220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on vessel</td>
			<td>6-, 12-, 24-wells Nunclon surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture suction</td>
			<td style="width:339px;">VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany</td>
			<td>20727400</td>
			<td style="width:405px;">BVC professional suction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell strainer (mesh)</td>
			<td>Corning, Tewksbury, USA</td>
			<td style="width:143px;">431750</td>
			<td>40 &#181;m Nylon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:339px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td style="width:143px;">75007213</td>
			<td>Megafuge 8R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cordless pipetting controller</td>
			<td>Hirschmann, Eberstadt, Germany</td>
			<td>9907200</td>
			<td>Pipetus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>SafeSeal tips for pipettes (10 &#181;l, 20 &#181;l, 100 &#181;l, 200 &#181;l, 1000 &#181;l)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable plastic pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable sterile scalpel</td>
			<td>Myco Medical, Cary, USA</td>
			<td style="width:143px;">n.a.</td>
			<td>Techno cut</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:339px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>41965-062</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany&#160;</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>50 &#181;l, 500 &#181;l, 1.500&#181;l, 2.000 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>F2442-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase blend</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">5401020001</td>
			<td>Liberase TL Research Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish 6 cm</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Senescence detection kit</td>
			<td style="width:339px;">Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>ab65351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Shaker/ Vortex</td>
			<td style="width:339px;">IKA, Staufen im Breisgau, Germany</td>
			<td style="width:143px;">n.a.</td>
			<td>MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile plastic tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>Falcon 352095</td>
			<td>BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrasonic water bath</td>
			<td>BANDELIN electronic GmbH &#38; Co. KG, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:143px;">312</td>
			<td>Sonorex RK100H</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical scissors (atraumatic)</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">NR 82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical scissors&#160;</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">eq 1060.09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical forceps</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">BD577</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation

Primære voksne fibroblaster er blevet et vigtigt redskab til at studere fibrose, fibroblast interaktioner og inflammation i alle kropsvæv. Da primære fibroblaster ikke kan opdeles på ubestemt tid på grund af myofibroblast differentiering eller senescens induktion, skal nye kulturer etableres regelmæssigt. Men der er flere forhindringer at overvinde i løbet af processerne med at udvikle en pålidelig isolations protokol og primær fibroblast isolation selv: metodens sværhedsgrad (især for begyndere), risikoen for bakteriel kontaminering, nødvendig tid, indtil primære fibroblaster kan bruges til eksperimenter, og efterfølgende celle kvalitet og levedygtighed. I denne undersøgelse, en hurtig, pålidelig og nem at lære protokol til at isolere og kultur primære voksne fibroblaster fra mus hjerte, lunge, lever og nyrer, der kombinerer enzymatisk fordøjelse og ultralyd agitation.

Denne protokols evne til at isolere voksne fibroblaster fra solidt murinvæv blev påvist. Der blev opnået levedygtige fibroblaster, som kunne anvendes til efterfølgende eksperimenter såsom immunofluorescens farvning eller sprednings forsøg (figur 2D-F, figur 5A).
Voksne fibroblaster er flade spindel formede celler med flere cellulære processer, der typisk vokser i monolag12</su...

Watch this Scientific Journal Video about Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation at JoVE.com

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Vi præsenterer en protokol for at isolere primære voksne fibroblaster på en nem, hurtig og pålidelig måde, performable af begyndere (f. eks. studerende). Proceduren kombinerer enzymatisk vævs nedbrydning og mekanisk agitation med ultralydbølger for at opnå primære fibroblaster. Protokollen kan let tilpasses specifikke eksperimentelle krav (f. eks. humant væv).

Ultralyd-forstærket primær voksen fibroblast isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

Vores protokol giver og nem og hurtig tilgang til primær fibroblast isolation med et klart fokus på at undgå bakterier forurening, som kan være et stort problem. Især for begyndere. Den største fordel ved vores teknik er dens enkelhed.Da det ikke kræver omfattende manuelle færdigheder eller erfaring, og det kan let læres af alle inden for en kort uddannelse periode. Præsentation af teknikken vil være Manja Newe, en tekniker fra ud laboratorium. Før du begynder dissektion, sat på to par engangshandsker, den ene oven på den anden.Og fastgør musen til en polystyren pad. Desinficere pelsen med 70% ethanol, og sørg for, at dyret er gennemblødt. Og brug ethanol steriliseret kirurgiske kraftker og atraumatisk saks til kop huden lige over den urogenitale tarmkanalen.Skær tre til fire centimeter langs midterlinjen fra det første snit til halsen, tilføjer relief nedskæringer på lemmerne. Og pin huden til puden for at opnå optimal adgang til muskulaturen, der dækker bughulen. Derefter desinficere abdominal muskulatur to gange med frisk 70% ethanol.Når ethanolen er tørret, fjernes det første par handsker. Og brug et nyt sterilt sæt af scef og saks til at indskube muskellaget for at åbne bughulen og brystkassen. For at fjerne de organer af interesse, forsigtigt forstå hvert organ med de kirurgiske saftræt uden piercing vævet.Og brug saksen til omhyggeligt at skære de leverende blodkar nær indgangsstedet for orglet. Placer hvert organ i et rør af steril, kold PBS og luk røret tæt. Placering af hvert rør på våd is, da organerne indsamles.Når alle organerne er høstet, spray rørene med 70% ethanol, før du placerer dem i en steril celle kultur hætte. Iført en frisk par handsker, bruge sterile kraftker til at overføre hvert organ på den ene halvdel af en steril seks centimeter petriskål. Og vask kort organerne med frisk PBS for at fjerne det overskydende blod.Overfør de skyllede organer til anden halvdel af hver petriskål og fjern den overskydende PBS. Ved hjælp af to sterile skalpeller, hakke organer i en til to millimeter fragmenter. Og brug en steril spatel til at overføre vævsstykkerne til nye, individuelle, sterile, 15 milliliterrør.Der tilsættes to milliliter 0,25% Trypsin-opløsning til hvert rør. Og læg rørene i en cellekultur inkubator ved 37 grader Celsius i fem minutter. Ved slutningen af inkubationen, vortex rørene på omkring 1400 rotationer i minuttet i ti sekunder.Og anhold Trypsin-reaktionen med fire milliliter af et passende dyrkningsmedium suppleret med føtal kalveserum pr. rør. Dernæst tilsættes den passende mængde kollagenase blanding opløsning til hvert rør. Og placere rørene i en 37 grader Celsius ultralyd vandbad i 10 minutter.Ved slutningen af sonikeringen, forsigtigt vortex rørene i 10 sekunder. Før du placerer rørene tilbage i ultralydsvandbadet i 10 minutter mere. I slutningen af den anden sonikering, vortex rørene i 10 sekunder mere.Og desinficere rørene med 70% ethanol. I cellekulturhætten filtreres cellesuspensionerne gennem individuelle 40 mikrometerspatorer i et nyt, sterilt 15 milliliterrør. Og indsamle cellerne ved centrifugering.Pellets skal suspenderes igen i en milliliter frisk medium pr. rør. Og se cellerne i passende cellekultur fartøjer på passende plating tætheder. Derefter placere cellerne i cellen kultur kuvøse natten over.Den næste morgen vaskes hver kultur tre gange med PBS, før du tilføjer frisk medium og returnerer cellerne til kuvøsen. Ved hjælp af denne protokol, levedygtige fibroblaster kan opnås til brug i efterfølgende eksperimenter. Såsom amino-fluorescerende farvning eller spredning eksperimenter.Voksne fibroblaster er flade, spindelformede celler med flere cellulære processer, der typisk vokser i monolag. Tydelige morfologiske forskelle i fibroblast populationer fra forskellige organer kan observeres, dog. For eksempel, renal fibroblaster er mindre og vokse ved højere tætheder end hjerte-, lunge-eller leverfibroblaster.De isolerede fibroblaster udviser høje spredningshastigheder og når et optisk sammenløb på mere end 90% efter ca. seks dage. Her kan en differentieret myofibroblast med karakteristiske alfa glatte muskel actin microfilaments observeres. Disse celler findes i overflod i hjertet, nyre, lever, og lungecellekulturer.Mens kun omkring 20 til 30 procent af isolerede og dyrkede celler udtrykke velordnet, arrangeret, alpha glat muskel actin microfilamenter, stort set alle cellerne er positive for Vimentin og Discoidin Domain Receptor 2 efter syv dage i kultur. Det vigtigste at huske er at bruge den rigtige teknik under hele proceduren, da bakterier forurening skal undgås. Efter primær fibroblast isolation, kan cellerne bruges til alle former for psykiatri eksperimenter og karakterisering.Såsom immunocytisk kemi spredning eller sårheling essays, eller molekylære biologiske vurderinger.

Research

JoVE Journal

Medicine

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Primær Culture of Human vestibulær schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

Primær tumor og MEF Cell Isolation at studere Lung Metastase

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolering og dyrkning af Primære endotelceller fra Canine arterier og vener

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Isolering og dyrkning af voksen rotte Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Isolering af primære humane Decidual celler fra de føtale membraner af udtrykket efterbyrd

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Isolering af primære mus hepatocytter for spirende Protein syntese analyse af ikke-radioaktive L-azidohomoalanine mærkning metode

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolering af atrial Myocytes fra voksne mus

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Murine myokardieinfarkt model ved hjælp af permanent ligation af venstre anterior faldende koronararterie

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Raffineret KLARHED-baseret væv Clearing for tre-dimensionelle Fibroblast Organisation i sunde og sårede Mouse Hearts

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

Ændringer af Langendorff-metoden til samtidig isolering af atrie- og ventrikulære myocytter fra voksne mus

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...