Name: ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation
Uploaded: 2019-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation at JoVE.com

Wij danken mevrouw Romy Kempe en Mrs. Annett Opitz voor deskundige technische ondersteuning. Wij danken ook de heer Bjoern Binnewerg voor haar steun. Dit werk werd gesteund door subsidies van a) de Förderkreis Dresdner Herz-Kreislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsförderprogramm für Frauen", Faculteit Geneeskunde Carl Gustav Carus Dresden en c) else Kröner-Forschungskolleg (EKFK) faculteit geneeskunde Carl Gustav Carus Dresden. Wij zijn dankbaar voor de financiering en de steun.

Het volgende protocol volgt de richtlijnen voor de institutionele dierenverzorging van de Technische Universität Dresden, Duitsland (dossiernummer: T 2014/4) en internationaal aanvaarde richtlijnen inzake dierenverzorging (FELASA)17. Figuur 1 visualiseert het celisolatieproces.
1. voorbereiden van de installatie, materiaal en media
<ol><li>Bereid celkweekmedium, PBS-oplossing, Collagenase Blend Stock Solution (reconstitueer 50 mg gelyofi...

<ol>
	<li>Baum, J., Duffy, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+and+myofibroblasts:+what+are+we+talking+about.">Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).</li><li>Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+identity+of+cardiac+fibroblasts.">Redefining the identity of cardiac fibroblasts.</a> Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).</li><li>Weissman-Shomer, P., Fry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+fibroblasts+senscence+in+vitro:+pattern+of+cell+division+and+life+span+as+a+function+of+cell+density.">Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).</li><li>Angello, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+potential+and+the+duration+of+the+cell+cycle+in+human+fibroblasts:+coordinate+stimulation+by+epidermal+growth+factor.">Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).</li><li>Serra, V., von Zglinicki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fibroblasts+in+vitro+senesce+with+a+donor-specific+telomere+length.">Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length.</a> FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).</li><li>Mateu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differences+between+neonatal+and+adult+fibroblasts+and+keratinocytes:+Donor+age+affects+epithelial-mesenchymal+crosstalk+in+vitro.">Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro.</a> International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).</li><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Cardiac+Fibroblast.">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Kuenzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+epigenetic+silencing+of+polo-like+kinase+2+promotes+fibrosis+in+atrial+fibrillation.">Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation.</a> bioRxiv. , 445098 (2018).</li><li>Van Linthout, S., Miteva, K., Tsch&#246;pe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+fibroblasts+and+inflammatory+cells.">Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer.">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li><li>Poulet, C., K&#252;nzel, S., B&#252;ttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+physiological+functions+and+ion+currents+in+atrial+fibroblasts+from+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation.</a> Physiological Reports. 4 (2), (2016).</li><li>G&#252;nd&#252;z, D., Hamm, C. W., Aslam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Isolation+of+High+Quality+Cardiomyocytes,+Endothelial+Cells,+and+Fibroblasts+from+an+Adult+Rat+Heart.">Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).</li><li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells.">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li><li>Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+enzymatic+isolation+of+fibroblasts+for+the+creation+of+autologous+skin+substitutes.">Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).</li><li>El-Armouche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+inhibitor-1-deficient+mice+are+protected+from+catecholamine-induced+arrhythmias+and+myocardial+hypertrophy.">Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy.</a> Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).</li><li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FELASA+Guidelines+and+Recommendations.">FELASA Guidelines and Recommendations.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).</li><li>Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblasts+differentiate+from+fibroblasts+when+plated+at+low+density.">Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).</li><li>Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+in+cell+culture+systems:+myofibroblasts+all+along.">Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).</li><li>Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484</a> (2019)</li><li>Copp&#233;, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor.">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li><li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease:+from+mechanisms+to+therapy.">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li><li>Singh, M., Sharma, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowth+of+fibroblast+cells+from+goat+skin+explants+in+three+different+culture+media+and+the+establishment+of+cell+lines.">Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).</li><li>Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+removal+of+fibroblasts+from+human+tissue+culture+systems.">A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems.</a> Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).</li></ol>

In vergelijking met vereeuwigd fibroblast cellijnen bieden primaire fibroblasten verschillende voordelen. Ze kunnen worden geïsoleerd kosteneffectief in hoge kwaliteit en kwantiteit. Bovendien bieden primaire culturen de mogelijkheid om cellen van meerdere individuen te bestuderen, wat de betrouwbaarheid van de verkregen resultaten verhoogt en de kans verkleint dat alleen celcultuurartefacten worden bestudeerd. Continue generatie van nieuwe primaire culturen voorkomt genetische veranderingen die vaak optreden na herhaal...

Fibroblasten zijn vlakke, spindle-vormige cellen met meerdere ecoagriturismo late processen en een uitgebreid ruw endoplasmisch reticulum1,2. Een gemiddelde fibroblast meet 30-100 μm en heeft een levensduur van 57 ± 3 dagen1,3. De gemiddelde celcyclus duur van menselijke fibroblasten varieert van 16-48 h, afhankelijk van de cultuuromstandigheden4. Er zijn aanwijzingen dat de replicatieve capaciteit en de functionele kwaliteit van gekweekte primaire fibroblasten negatief correleerden met de leeftijd van de donor, wat suggereert dat jongere donoren (dieren of patiënten) de voorkeur moeten krijgen indien mogelijk5,6 .
Fibroblasten vormen een overheersend celtype van de meeste lichaamsweefsels van zoogdieren. Ondanks hun alomtegenwoordige aanwezigheid is de moleculaire identificatie van fibroblasten nog steeds een uitdaging7. Fibroblasten migreren naar de ontwikkeling van weefsels en organen uit verschillende bronnen tijdens de embryonale ontwikkeling8. Om deze reden is er een overvloed aan marker eiwitten die kan worden gevonden in fibroblasten, terwijl unieke marker eiwitten, die aanwezig zijn in elke fibroblast populatie en exclusief voor fibroblasten, nog steeds ontbreken. Zo worden expressie patronen van verschillende herkende markers meestal gebruikt om fibroblasten te identificeren. Onder de meest erkende markers zijn vimentin, menselijk fibroblast oppervlak eiwit (hFSP), discoidin domein receptor 2 (DDR2) en alpha glad spier actine (αsma).
Fibroblasten zijn de belangrijkste extracellulaire matrix (ECM)-producerende celtype. Daardoor behouden fibroblasten een geordende weefsel architectuur en bieden ze mechanische ondersteuning voor naburige cellen1. De balans tussen ECM-synthese en afbraak is een goed gereguleerd proces. Verschuivingen in de richting van synthese markeren het begin van overmatige ECM-depositie die, indien niet beëindigd, leidt tot fibrose. Fibrose wordt gemedieerd door myofibroblasten, die afkomstig zijn van geactiveerde fibroblasten die moleculaire en fenotypische veranderingen ondergaan. Een kenmerk van myofibroblasten is verbeterde secretie van ECM en cytokinen en de uitdrukking van ordelijke gearrangeerde αSMA Microfilamenten9.
Primaire fibroblasten zijn in de schijnwerpers van recent onderzoek gericht op fibrose, weefsel ontsteking en fibroblast-kanker-celinteracties10,11. Echter, om effectief te bestuderen fibroblast eigenschappen in gezondheid en ziekte, het is noodzakelijk om te isoleren van levensvatbare primaire volwassen fibroblasten op een regelmatige basis. Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor het isoleren van fibroblasten12,13,14. De drie belangrijkste methoden van fibroblast isolatie zijn uitgroei uit weefsel chunks12, enzymatische weefsel spijsvertering15, en enzymatische perfusie van holleorganen 9,13,16. Het voordeel van uitgroei is een zacht isolatie proces zonder enzymatische celdegradatie. Aan de andere kant vereisen de groei culturen meestal langdurige cultuur perioden totdat cellen kunnen worden gebruikt voor experimenten. Veelvoorkomende enzymatische spijsvertering is snel, maar draagt een risico van besmetting met andere celtypen (bijv. endotheel cellen) of bacteriën in het roer proces, die nodig zijn om het weefsel mechanisch te ontbinden. Bovendien, deze methoden zijn vaak uitgebreid en vereisen tijd en vaardigheid om te leren.
Wat betreft het belang van primaire fibroblasten in het onderzoek, is er nog steeds behoefte aan het optimaliseren van bestaande celisolatiebenaderingen in termen van snelheid, eenvoud en betrouwbaarheid. Hier wordt een nieuwe Ultrasone-gebaseerde enzymatische fibroblast-isolatiemethode geleverd die hoge kwaliteit cellen levert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1103px;" width="1103">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">T4049-100ML</td>
			<td style="width:405px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotics</td>
			<td>Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>Gibco LS15140148&#160;</td>
			<td>Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>51023608</td>
			<td>HeraSafe KSP15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>50049176</td>
			<td>BBD 6220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on vessel</td>
			<td>6-, 12-, 24-wells Nunclon surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture suction</td>
			<td style="width:339px;">VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany</td>
			<td>20727400</td>
			<td style="width:405px;">BVC professional suction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell strainer (mesh)</td>
			<td>Corning, Tewksbury, USA</td>
			<td style="width:143px;">431750</td>
			<td>40 &#181;m Nylon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:339px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td style="width:143px;">75007213</td>
			<td>Megafuge 8R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cordless pipetting controller</td>
			<td>Hirschmann, Eberstadt, Germany</td>
			<td>9907200</td>
			<td>Pipetus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>SafeSeal tips for pipettes (10 &#181;l, 20 &#181;l, 100 &#181;l, 200 &#181;l, 1000 &#181;l)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable plastic pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable sterile scalpel</td>
			<td>Myco Medical, Cary, USA</td>
			<td style="width:143px;">n.a.</td>
			<td>Techno cut</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:339px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>41965-062</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany&#160;</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>50 &#181;l, 500 &#181;l, 1.500&#181;l, 2.000 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>F2442-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase blend</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">5401020001</td>
			<td>Liberase TL Research Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish 6 cm</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Senescence detection kit</td>
			<td style="width:339px;">Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>ab65351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Shaker/ Vortex</td>
			<td style="width:339px;">IKA, Staufen im Breisgau, Germany</td>
			<td style="width:143px;">n.a.</td>
			<td>MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile plastic tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>Falcon 352095</td>
			<td>BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrasonic water bath</td>
			<td>BANDELIN electronic GmbH &#38; Co. KG, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:143px;">312</td>
			<td>Sonorex RK100H</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical scissors (atraumatic)</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">NR 82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical scissors&#160;</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">eq 1060.09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical forceps</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">BD577</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation

Primaire volwassen fibroblasten zijn uitgegroeid tot een belangrijk instrument om fibrose te bestuderen, fibroblast interacties en ontsteking in alle lichaamsweefsels. Omdat primaire fibroblasten niet voor onbepaalde tijd kunnen delen door myofibroblast-differentiatie of senescentie-inductie, moeten er regelmatig nieuwe culturen worden vastgesteld. Echter, er zijn verschillende obstakels te overwinnen tijdens de processen van de ontwikkeling van een betrouwbare isolatie protocol en primaire fibroblast isolatie zelf: de moeilijkheidsgraad van de methode (vooral voor beginners), het risico van bacteriële besmetting, de vereiste tijd tot primaire fibroblasten kunnen worden gebruikt voor experimenten, en de daaropvolgende celkwaliteit en levensvatbaarheid. In deze studie, een snelle, betrouwbare en gemakkelijk te leren protocol om primaire volwassen fibroblasten te isoleren en te cultuur van muis hart, longen, lever en nieren combineren enzymatische spijsvertering en ultrasone agitatie is voorzien.

Het vermogen van dit protocol om volwassen fibroblasten uit massief muriene weefsel te isoleren werd aangetoond. Levensvatbare fibroblasten werden verkregen die kunnen worden gebruikt voor latere experimenten zoals immunofluorescentie kleuring of proliferatie experimenten (Figuur 2D-F, Figuur 5A).
Volwassen fibroblasten zijn platte spindel vormige cellen met meerdere cellulaire processen die meestal g...

Watch this Scientific Journal Video about Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation at JoVE.com

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

We presenteren een protocol om primaire volwassen fibroblasten op een eenvoudige, snelle en betrouwbare manier te isoleren, die door beginners kunnen worden perforeerbaar (bijv. studenten). De procedure combineert enzymatische weefsel spijsvertering en mechanische opwinding met ultrasone golven om primaire fibroblasten te verkrijgen. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan specifieke experimentele eisen (bijv. menselijk weefsel).

Ultrasoon-verhoogde primaire volwassen fibroblast-isolatie

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

Ons protocol biedt en eenvoudige en snelle aanpak voor primaire fibroblast isolatie met een duidelijke focus op het vermijden van bacteriën besmetting, die een enorm probleem kan zijn. Vooral voor beginners. Het belangrijkste voordeel van onze techniek is de eenvoud.Omdat het geen uitgebreide handmatige vaardigheden of ervaring vereist en het gemakkelijk kan worden geleerd door iedereen binnen een korte trainingsperiode. De presentatie van de techniek zal Manja Newe, een technicus uit het laboratorium. Voordat u met de dissectie begint, trek je twee paar wegwerphandschoenen aan, de ene bovenop de andere.En bevestig de muis op een polystyreen pad. Desinfecteer de vacht met 70% ethanol, zodat het dier doorweekt is. En gebruik ethanol gesteriliseerde chirurgische tangen en atraumatische schaar om de huid kopje recht boven de urogenitale darmkanaal.Snijd drie tot vier centimeter langs de middellijn van de eerste incisie naar de nek, het toevoegen van reliëf bezuinigingen op de ledematen. En pin de huid aan het pad om optimale toegang tot het spierstelsel dat de buikholte te bereiken. Desinfecteer vervolgens het buikspierstelsel twee keer met verse 70%-ethanol.Wanneer de ethanol is gedroogd, verwijder dan het eerste paar handschoenen. En gebruik een nieuwe steriele set van tangen en scharen om de spierlaag te insnijden om de buikholte en de thorax te openen. Om de organen van belang te verwijderen, voorzichtig grijpen elk orgaan met de chirurgische tangen zonder piercing het weefsel.En gebruik de schaar om zorgvuldig snijden de leverende bloedvaten in de buurt van het ingangspunt van het orgaan. Plaats elk orgaan in een buis van steriele, koude PBS en sluit de buis goed. Het plaatsen van elke buis op nat ijs als de organen worden verzameld.Wanneer alle organen zijn geoogst, spuit de buizen met 70% ethanol alvorens ze in een steriele cel kweekkap. Het dragen van een vers paar handschoenen, gebruik steriele tangen om elk orgaan over te brengen op de ene helft van een steriele zes centimeter petrischaal. En was de organen kort met verse PBS om het overtollige bloed te verwijderen.Breng de gespoelde organen naar de tweede helft van elke petrischaal en verwijder de overtollige PBS. Met behulp van twee steriele scalpels, gehakt de organen in een tot twee millimeter fragmenten. En gebruik een steriele spatel om de weefselstukken over te brengen in nieuwe, individuele, steriele, 15 milliliter buizen.Voeg twee milliliter van 0,25% Trypsin oplossing aan elke buis. En plaats de buizen in een celcultuur incubator op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Aan het einde van de incubatie, vortex de buizen op ongeveer 1400 rotaties per minuut gedurende tien seconden.En arresteer de Trypsin reactie met vier milliliter van een geschikt kweekmedium aangevuld met foetaal kalfsserum per buis. Voeg vervolgens het juiste volume collagenase-overvloeioplossing toe aan elke buis. En plaats de buizen in een 37 graden Celsius ultrasone waterbad voor 10 minuten.Aan het einde van de sonicatie, voorzichtig vortex de buizen voor 10 seconden. Voordat u de buizen terug in het ultrasone waterbad voor 10 minuten. Aan het einde van de tweede sonicatie, vortex de buizen voor 10 seconden.En desinfecteer de buizen met 70% ethanol. In de celkweekkap filtert u de celsuspensies door individuele 40 micrometer strainers in een nieuwe, steriele buis van 15 milliliter. En verzamel de cellen door centrifugatie.Schort de pellets opnieuw op in één milliliter vers medium per buis. En zie de cellen in geschikte celkweekvaten bij passende beplatingsdichtheden. Plaats vervolgens de cellen in de celcultuur incubator 's nachts.De volgende ochtend, was elke cultuur drie keer met PBS voor het toevoegen van vers medium en de terugkeer van de cellen naar de incubator. Met behulp van dit protocol kunnen levensvatbare fibroblasten worden verkregen voor gebruik in latere experimenten. Zoals amino-fluorescerende vlekken of proliferatie experimenten.Volwassen fibroblasten zijn platte, spindelvormige cellen met meerdere cellulaire processen die meestal groeien in monolagen. Er kunnen echter duidelijke morfologische verschillen in fibroblastpopulaties van verschillende organen worden waargenomen. Bijvoorbeeld, nierfibroblasten zijn kleiner en groeien bij hogere dichtheden dan hart-, long- of leverfibroblasten.De geïsoleerde fibroblasten vertonen hoge proliferatiepercentages, die na ongeveer zes dagen een optische samenvloeiing van meer dan 90% bereiken. Hier kan een gedifferentieerde myofibroblast met onderscheidende alfa gladde spieractin microfilamenten worden waargenomen. Deze cellen zijn te vinden in overvloed in het hart, nier, lever, en longcel culturen.Terwijl slechts ongeveer 20 tot 30 procent van de geïsoleerde en gekweekte cellen uitdrukkelijk ordelijk, gearrangeerd, alfa gladde spier actin microfilaments, vrijwel alle cellen zijn positief voor Vimentin en Discoidin Domain Receptor 2 na zeven dagen in de cultuur. Het belangrijkste om te onthouden is het gebruik van de juiste techniek gedurende de procedure als bacteriën besmetting moet worden vermeden. Na primaire fibroblast isolatie, kunnen de cellen worden gebruikt voor allerlei psychiatrie experimenten en karakterisering.Zoals immunocytische chemie proliferatie of wondgenezing essays, of moleculaire biologische beoordelingen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Primaire cultuur van de mens Vestibular Schwannomen

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

Primaire tumor en MEF Cell Isolation om te studeren longmetastase

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolatie en Cultuur van primaire endotheelcellen van Canine slagaders en aders

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Isolatie en teelt van volwassen ratten Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Isolatie van primaire menselijke Decidual cellen van de foetus membranen van Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Isolatie van primaire muisknop hepatocyten door niet-radioactieve L-azidohomoalanine Labeling methode p.a. ontluikende eiwit synthese

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolatie van atriale Myocyten van volwassen muizen

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Murine myocardinfarct model met behulp van permanente Ligatie van linker anterieure aflopende coronaire slagader

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Verfijnde op HELDERHEID gebaseerde weefselopruiming voor driedimensionale fibroblastorganisatie in gezonde en gewonde muizenharten

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

Modificaties van de Langendorff-methode voor gelijktijdige isolatie van atriale en ventriculaire myocyten van volwassen muizen

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...