Name: ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation
Uploaded: 2019-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation at JoVE.com

אנו מודים לגב רומי קמפה וגב ' נט אופץ ' לתמיכה טכנית מקצועית. אנו מודים גם למר ביוארן בינניורג. על כך שהוא תומך עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מ-a) Förderkreis Dresdner Herz-קראסלאוף-e.V., ב) "הבליטבליםתוכניות לעלמה", הפקולטה לרפואה קרל גוסטב קאר דרזדן ו-c) אחרים Kröner-פורשיסקולאג (EKFK) הפקולטה לרפואה קרל גוסטב . כרמלה דרסדן . אנו אסירי תודה על המימון והתמיכה

הפרוטוקול הבא עוקב אחר ההנחיות לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של Technische אוניברסיטת דרזדן, גרמניה (מספר קובץ: T 2014/4), כמו גם הנחיות לטיפול בעלי חיים מקובלים (FELASA)17. איור 1 מדמיין את תהליך הבידוד של התא.
1. הכנת הכיוונון, החומר והמדיה
<ol><li>להכין את התרבות הת...

<ol>
	<li>Baum, J., Duffy, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+and+myofibroblasts:+what+are+we+talking+about.">Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).</li><li>Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+identity+of+cardiac+fibroblasts.">Redefining the identity of cardiac fibroblasts.</a> Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).</li><li>Weissman-Shomer, P., Fry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+fibroblasts+senscence+in+vitro:+pattern+of+cell+division+and+life+span+as+a+function+of+cell+density.">Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).</li><li>Angello, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+potential+and+the+duration+of+the+cell+cycle+in+human+fibroblasts:+coordinate+stimulation+by+epidermal+growth+factor.">Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).</li><li>Serra, V., von Zglinicki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fibroblasts+in+vitro+senesce+with+a+donor-specific+telomere+length.">Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length.</a> FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).</li><li>Mateu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differences+between+neonatal+and+adult+fibroblasts+and+keratinocytes:+Donor+age+affects+epithelial-mesenchymal+crosstalk+in+vitro.">Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro.</a> International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).</li><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Cardiac+Fibroblast.">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Kuenzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+epigenetic+silencing+of+polo-like+kinase+2+promotes+fibrosis+in+atrial+fibrillation.">Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation.</a> bioRxiv. , 445098 (2018).</li><li>Van Linthout, S., Miteva, K., Tsch&#246;pe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+fibroblasts+and+inflammatory+cells.">Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer.">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li><li>Poulet, C., K&#252;nzel, S., B&#252;ttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+physiological+functions+and+ion+currents+in+atrial+fibroblasts+from+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation.</a> Physiological Reports. 4 (2), (2016).</li><li>G&#252;nd&#252;z, D., Hamm, C. W., Aslam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Isolation+of+High+Quality+Cardiomyocytes,+Endothelial+Cells,+and+Fibroblasts+from+an+Adult+Rat+Heart.">Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).</li><li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells.">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li><li>Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+enzymatic+isolation+of+fibroblasts+for+the+creation+of+autologous+skin+substitutes.">Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).</li><li>El-Armouche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+inhibitor-1-deficient+mice+are+protected+from+catecholamine-induced+arrhythmias+and+myocardial+hypertrophy.">Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy.</a> Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).</li><li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FELASA+Guidelines+and+Recommendations.">FELASA Guidelines and Recommendations.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).</li><li>Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblasts+differentiate+from+fibroblasts+when+plated+at+low+density.">Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).</li><li>Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+in+cell+culture+systems:+myofibroblasts+all+along.">Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).</li><li>Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484</a> (2019)</li><li>Copp&#233;, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor.">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li><li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease:+from+mechanisms+to+therapy.">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li><li>Singh, M., Sharma, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowth+of+fibroblast+cells+from+goat+skin+explants+in+three+different+culture+media+and+the+establishment+of+cell+lines.">Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).</li><li>Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+removal+of+fibroblasts+from+human+tissue+culture+systems.">A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems.</a> Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).</li></ol>

בהשוואה לקווי התאים המושווים פיברוהפיצוץ, הפיברופיצוצים העיקריים מציעים מספר יתרונות. הם יכולים להיות מבודדים עלות בצורה יעילה באיכות גבוהה וכמות. יתר על כן, תרבויות העיקרי להציע את האפשרות ללמוד תאים מאנשים מרובים, אשר מגביר את האמינות של התוצאות המתקבלות ומקטין את הסבירות של רק לימוד ח...

פיברותקיעות הם שטוחים, תאים בצורת ציר עם תהליכים stellate מרובים ומעין הרשתית הרחב מחוספס רשתית פלזמית1,2. ממוצע פיברוהפיצוץ אמצעים 30-100 יקרומטר ויש לו תוחלת חיים של 57 ± 3 ימים1,3. משך המחזור הממוצע של התאים של האדם נע בין 16-48 h בהתאם לתנאי התרבות4. יש עדויות לכך שהיכולת המאובדית והאיכות הפונקציונלית של הגידולים הראשוניים העיקריים מתפקדים לרעה עם גיל התורם, ומציעה שתורמים צעירים יותר (בעלי חיים או חולים) צריכים להיות מועדפים אם אפשרי5,6 .
פיברותקיעות מהווים סוג תא דומיננטי של רוב ממחטות הגוף. למרות הנוכחות שלהם בכל מקום, הזיהוי המולקולרי של הפיברופיצוצים הוא עדיין אתגר7. פיברותקיעות להגר לפתח רקמות ואיברים ממקורות שונים במהלך פיתוח עובריים8. מסיבה זו, יש שפע של מסמן חלבונים שניתן למצוא בתוך פיברובפיצוצים בעוד החלבונים סמן ייחודי, אשר נמצאים בכל אוכלוסיית הפיברומה ובלעדית לפיברותקיעות, עדיין חסרים. לפיכך, דפוסי ביטוי של מספר סמנים מזוהים משמשים בדרך כלל כדי לזהות פיברומופיצוצים. בין הסמנים המוכרים ביותר הם vimentin, חלבון הקרקע האדם פיברוההדף (hfsp), discoidin התחום קולטן 2 (DDR2) ו אלפא שריר חלק שרירים אקטין (αSMA).
פיברותקיעות הם מטריצת החילוץ העיקרית (ECM)-הפקת סוג תא. ובכך, הפיברובטות שומרות על ארכיטקטורת רקמה מסודרת ומספקות תמיכה מכנית לתאים שכנים1. האיזון בין סינתזה של ECM לבין השפלה הוא תהליך מוסדר היטב. משמרות לכיוון הסינתזה לסמן את תחילתה של התצהיר ECM מוגזמת אשר, אם לא הסתיים, מוביל פיברוזיס. פיברוזיס מתווכת על ידי מיופיברופיצוצים, אשר מקורם פיברופיצוצים המופעלות שעברו מולקולרית שינויים פנופי. אחד סימן ההיכר של מיופיברופיצוצים הוא הפרשה משופרת של ECM ו ציטוקינים ואת הביטוי של מסודר מסודרים αSMA מיקרופילטרים9.
פיברותקיעות הראשי כבר בזרקור של מחקר האחרונות התמקדות פיברוזיס, דלקת רקמות ופיברוהפיצוץ-תאים לסרטן-cell10,11. עם זאת, כדי ללמוד ביעילות תכונות פיברובלסט בריאות ומחלות, יש צורך לבודד פיברוהפיצוצים הראשוניים למבוגרים על בסיס קבוע. ישנן מספר שיטות זמין כדי לבודד פיברופיצוצים12,13,14. שלוש השיטות המרכזיות של בידוד פיברובלסט הן התרחבות מנתחי רקמות12, עיכול הרקמה האנזימטית15, ופרזיה אנזימטית של איברים חלולים9,13,16. היתרון של הצמיחה החוצה הוא תהליך בידוד עדין ללא השפלה תא אנזימטי. מצד שני, תרבויות מחוץ לצמיחה דורשים בדרך כלל תקופות התרבות ממושך עד התאים יכולים לשמש ניסויים. מהירות העיכול הנפוצה היא מהירה אך נושאת סיכון לזיהום עם סוגי תאים אחרים (למשל, תאי האנדותל) או חיידקים בתהליך העצבנות, הנחוץ לפזר מכנית את הרקמה. יתרה מזאת, שיטות אלה מורכבות לעתים קרובות ודורשות זמן ומיומנות ללמוד.
בנוגע לחשיבות הגידולים הראשוניים במחקר, עדיין יש צורך למטב את הגישות הקיימות של בידוד התא במונחים של זריזות, פשטות ואמינות. כאן, שיטת בידוד אנזימטית מבוססת על-קולי ומספקת תאים באיכות גבוהה מסופק.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1103px;" width="1103">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">T4049-100ML</td>
			<td style="width:405px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotics</td>
			<td>Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>Gibco LS15140148&#160;</td>
			<td>Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>51023608</td>
			<td>HeraSafe KSP15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>50049176</td>
			<td>BBD 6220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on vessel</td>
			<td>6-, 12-, 24-wells Nunclon surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture suction</td>
			<td style="width:339px;">VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany</td>
			<td>20727400</td>
			<td style="width:405px;">BVC professional suction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell strainer (mesh)</td>
			<td>Corning, Tewksbury, USA</td>
			<td style="width:143px;">431750</td>
			<td>40 &#181;m Nylon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:339px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td style="width:143px;">75007213</td>
			<td>Megafuge 8R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cordless pipetting controller</td>
			<td>Hirschmann, Eberstadt, Germany</td>
			<td>9907200</td>
			<td>Pipetus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>SafeSeal tips for pipettes (10 &#181;l, 20 &#181;l, 100 &#181;l, 200 &#181;l, 1000 &#181;l)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable plastic pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable sterile scalpel</td>
			<td>Myco Medical, Cary, USA</td>
			<td style="width:143px;">n.a.</td>
			<td>Techno cut</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:339px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>41965-062</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany&#160;</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>50 &#181;l, 500 &#181;l, 1.500&#181;l, 2.000 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>F2442-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase blend</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">5401020001</td>
			<td>Liberase TL Research Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish 6 cm</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Senescence detection kit</td>
			<td style="width:339px;">Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>ab65351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Shaker/ Vortex</td>
			<td style="width:339px;">IKA, Staufen im Breisgau, Germany</td>
			<td style="width:143px;">n.a.</td>
			<td>MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile plastic tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>Falcon 352095</td>
			<td>BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrasonic water bath</td>
			<td>BANDELIN electronic GmbH &#38; Co. KG, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:143px;">312</td>
			<td>Sonorex RK100H</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical scissors (atraumatic)</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">NR 82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical scissors&#160;</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">eq 1060.09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical forceps</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">BD577</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation

הראשי פיברותקיעות למבוגרים הפכו כלי חשוב ללמוד פיברוזיס, פיברוהפיצוץ אינטראקציות ודלקת בכל רקמות הגוף. כיוון שהפיברופיצוצים העיקריים אינם יכולים להפריד ללא הגבלת הזמן בשל בידול או הזדקנות ביולוגית, יש להקים תרבויות חדשות באופן סדיר. עם זאת, ישנם מספר מכשולים כדי להתגבר במהלך התהליכים של פיתוח פרוטוקול בידוד אמין ובידוד העיקרי פיברוהפיצוץ עצמו: דרגת הקושי של השיטה (במיוחד למתחילים), הסיכון לזיהום חיידקי, ה זמן נדרש עד הפיברותקיעות הראשונית ניתן להשתמש עבור ניסויים, ואת איכות התא הבאים הכדאיות. במחקר זה, פרוטוקול מהיר, אמין וקל ללמידה כדי לבודד ולהתרבות למבוגרים בלבד ותרבות מתוך לב העכבר, ריאות, כבד וכליות המשלב עיכול אנזימטי ועצבנות אולטרה סאונד מסופק.

את היכולת של פרוטוקול זה כדי לבודד פיברוהפיצוצים מבוגרים מרקמת murine מוצק הוכח. ניתן להשיג את הפיברופיצוצים קיימא שניתן להשתמש בהם עבור ניסויים שלאחר מכן כגון immunofluorescence כתמים או הפצת ניסויים (איור 2D-F, איור 5א).
בוגרים פיברותק...

Watch this Scientific Journal Video about Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation at JoVE.com

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד את הפיברוטים הראשוניים העיקריים באופן קל, מהיר ואמין, performable על ידי למתחילים (למשל, סטודנטים). הליך זה משלב את העיכול ברקמה אנזימטית ועצבנות מכנית עם גלי אולטרה סאונד כדי להשיג פיברוהטיות ראשונית. ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות לדרישות נסיוניות ספציפיות (לדוגמה, רקמת אדם).

אולטרה סאונד-מוגבר למבוגרים בידוד פיברוהפיצוץ

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

הפרוטוקול שלנו מספק גישה קלה ומהירה לבידוד פיברובלסט ראשוני עם דגש ברור על הימנעות מזיהום חיידקים, אשר יכול להיות בעיה ענקית. במיוחד למתחילים. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא הפשטות שלה.כפי שהוא אינו דורש מיומנויות ידניות נרחבות או ניסיון וזה יכול בקלות ללמוד על ידי כולם בתוך תקופת אימון קצרה. מציג את הטכניקה יהיה Manja Newe, טכנאי ממעבדה החוצה. לפני תחילת הניתוח, לשים על שני זוגות של כפפות חד פעמיות, אחד על גבי השני.ולתקן את העכבר ל כרית פוליסטירן. לחטא את הפרווה עם 70% אתנול, לוודא כי החיה ספוגה. ולהשתמש ממטרים כירורגיים מעוכל אתנול ומספריים אטראומטיים כדי העור ממש מעל מערכת urogenital.חותכים שלושה עד ארבעה סנטימטרים לאורך קו האמצע מהחתך הראשוני לצוואר, ומוסיפים חתכי הקלה בגפיים. ולהצמיד את העור על כרית כדי להשיג גישה אופטימלית השרירים המכסים את חלל הבטן. לאחר מכן, לחטא את שרירי הבטן פעמיים עם טרי 70% אתנול.כאשר האתנול התייבש, להסיר את זוג הכפפות הראשון. ולהשתמש קבוצה סטרילית חדשה של מדפים ומספריים כדי להסית את שכבת השריר כדי לפתוח את חלל הבטן ואת בית החזה. כדי להסיר את האיברים של עניין, בעדינות לתפוס כל איבר עם מלקחיים כירורגיים מבלי ל פירסינג הרקמה.ולהשתמש במספריים כדי לחתוך בזהירות את כלי הדם המספקים ליד נקודת הכניסה של האיבר. מניחים כל איבר לתוך צינור של PBS סטרילי, קר ולסגור את הצינור בחוזקה. מניחים כל צינור על קרח רטוב בזמן איסוף האיברים.כאשר כל האיברים נקצרו, לרסס את הצינורות עם 70% אתנול לפני הצבתם במכסה המנוע של תאים סטריליים. לובשים זוג כפפות טריות, משתמשים במטחנים סטריליים כדי להעביר כל איבר לחצי מנה סטרילית של פטרי ב-6 ס"מ. ולשטוף בקצרה את האיברים עם PBS טרי כדי להסיר את הדם העודף.מעבירים את האיברים שטוף למחצית השנייה של כל צלחת פטרי ולהסיר את PBS עודף. באמצעות שני אזמלים סטריליים, טחון את האיברים לרסיס אחד עד שני מילימטר. ולהשתמש מרית סטרילית להעביר את חתיכות הרקמה לתוך חדש, בודד, סטרילי, 15 צינורות מיליליטר.הוסף שני מיליליטר של 0.25%פתרון טריפסין לכל צינור. ומ מניחים את הצינורות באינקובטור של תרבות התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. בסוף הדגירה, מערבולת הצינורות בערך 1400 סיבובים לדקה במשך עשר שניות.ולעצור את תגובת טריפסין עם ארבעה מיליליטר של מדיום תרבות מתאים בתוספת סרום עגל עוברי לכל צינור. לאחר מכן, מוסיפים את הנפח המתאים של פתרון תערובת קולגן לכל צינור. ולמקום את הצינורות באמבט מים קולי 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.בסוף sonication, בעדינות מערבולת הצינורות במשך 10 שניות. לפני הצבת הצינורות בחזרה לאמבט המים הקולי במשך 10 דקות נוספות. בסוף sonication השני, מערבולת הצינורות במשך 10 שניות נוספות.ולחטא את הצינורות עם 70% אתנול. במכסה המנוע של תא התרבות, לסנן את מתלי התא דרך מסנני 40 מיקרומטר בודדים לתוך צינור חדש, סטרילי, 15 מיליליטר. ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.להשעות מחדש את כדורי במיליליטר אחד של מדיום טרי לכל צינור. ולראות את התאים בכלי תרבות תאים מתאימים בצפיפות ציפוי מתאימה. לאחר מכן, מניחים את התאים באינקובטור תרבות התאים בן לילה.למחרת בבוקר, לשטוף כל תרבות שלוש פעמים עם PBS לפני הוספת מדיום טרי והחזרת התאים לחממה. באמצעות פרוטוקול זה, fibroblasts קיימא ניתן להשיג לשימוש בניסויים הבאים. כגון ניסויי כתם אמינו-פלואורסצנטי או התפשטות.פיברובלסטים בוגרים הם תאים שטוחים בצורת ציר עם תהליכים תאיים מרובים הגדלים בדרך כלל במונוטלים. הבדלים מורפולוגיים ברורים באוכלוסיות פיברובלסט מאיברים שונים ניתן לראות, עם זאת. לדוגמה, פיברובלסטים כליות קטנים יותר וגדלים בצפיפויות גבוהות יותר מאשר פיברובלסטים לבביים, ריאתי או בהפטיים.הפיברובלסטים המבודדים מציגים שיעורי התפשטות גבוהים, ומגיעים להתכנסות אופטית של יותר מ-90% לאחר כשישה ימים. כאן, myofibroblast מובחן עם מיקרופילמנטים ייחודיים של שרירי אלפא חלקים. תאים אלה נמצאים בשפע בתרבויות הלב, הכליות, הכבד ותאי הריאות.בעוד שרק כ -20 עד 30 אחוזים מהתאים המבודדים והמתרבתים מבטאים מיקרופילמנטים מסודרים, מסודרים וחלקים של השרירים, כמעט כל התאים חיוביים עבור קולטן דומיין וימנטין ודיסקודין 2 לאחר שבעה ימים בתרבות. הדבר החשוב ביותר לזכור הוא להשתמש בטכניקה הנכונה לאורך כל ההליך כמו זיהום חיידקים יש להימנע. לאחר בידוד פיברובלסט ראשוני, התאים יכולים לשמש עבור כל מיני ניסויים פסיכיאטריים ואפיון.כגון התפשטות כימיה אימונוציטית או מאמרי ריפוי פצעים, או הערכות ביולוגיות מולקולריות.

Research

JoVE Journal

Medicine

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

העיקרית של תרבות האנושית שיווי המשקל schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

גידול ראשוני ובידוד תא MEF לחקר ריאות גרורה

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

בידוד והתרבות של תאי האנדותל ראשיים מן העורקים וורידים לכלבים

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

בידוד, טיפוח של עכברים בוגרים Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

בידוד של ראשי תאים Decidual האנושי בקרום עוברי של המונח Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

בידוד של העכבר הראשי Hepatocytes לניתוח סינתזת חלבון Nascent בשיטה תיוג L שאינו רדיואקטיבי-azidohomoalanine

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

בידוד של פרפור מיוציטים מעכברים למבוגרים

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

מודל אוטם שריר הלב באמצעות הארכה קבועה של עורק שמאלי קדמי כלילי יורד

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

ניקוי רקמות מבוסס בהירות מעודן עבור ארגון פיברובלסט תלת מימדי בלבבות עכבר בריאים ופצועים

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

שינויים בשיטת לנגנדורף לבידוד סימולטני של מיוציטים מפרשים בוגרים

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...