Name: ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation
Uploaded: 2019-07-29T14:00:00
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로미 켐프 부부와 아넷 오피츠 부인에게 전문적인 기술 지원을 부탁드립니다. 우리는 또한 IT 지원에 대한 씨 Bjoern Binnewerg 감사합니다. 이 작품은 a) Förderkreis 드레스드너 헤르츠 - Treislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsförderprogramm für 프라우엔", 의학 학부 칼 구스타프 카루스 드레스덴과 c) 엘스 크뢰너 - 포르스충스콜레그 (EKFK) 칼 의학부에서 보조금에 의해 지원되었다 카루스 드레스덴. 우리는 자금과 지원에 감사드립니다.

다음 프로토콜은 독일 드레스덴 테크니쉬 Universität 드레스덴의 제도적 동물 관리 지침 (파일 번호 : T 2014/4)뿐만 아니라 국제적으로 인정 된 동물 관리 지침 (FELASA)17을따릅니다. 그림 1은 셀 격리 프로세스를 시각화합니다.
1. 설정, 재료 및 미디어 준비
<ol><li>세포 배양 배지, PBS 용액, 콜라게나아제 블렌드 스톡 용액(12 mL의 멸균 된 초?...

<ol>
	<li>Baum, J., Duffy, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+and+myofibroblasts:+what+are+we+talking+about.">Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).</li><li>Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+identity+of+cardiac+fibroblasts.">Redefining the identity of cardiac fibroblasts.</a> Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).</li><li>Weissman-Shomer, P., Fry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+fibroblasts+senscence+in+vitro:+pattern+of+cell+division+and+life+span+as+a+function+of+cell+density.">Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).</li><li>Angello, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+potential+and+the+duration+of+the+cell+cycle+in+human+fibroblasts:+coordinate+stimulation+by+epidermal+growth+factor.">Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).</li><li>Serra, V., von Zglinicki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fibroblasts+in+vitro+senesce+with+a+donor-specific+telomere+length.">Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length.</a> FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).</li><li>Mateu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differences+between+neonatal+and+adult+fibroblasts+and+keratinocytes:+Donor+age+affects+epithelial-mesenchymal+crosstalk+in+vitro.">Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro.</a> International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).</li><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Cardiac+Fibroblast.">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Kuenzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+epigenetic+silencing+of+polo-like+kinase+2+promotes+fibrosis+in+atrial+fibrillation.">Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation.</a> bioRxiv. , 445098 (2018).</li><li>Van Linthout, S., Miteva, K., Tsch&#246;pe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+fibroblasts+and+inflammatory+cells.">Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer.">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li><li>Poulet, C., K&#252;nzel, S., B&#252;ttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+physiological+functions+and+ion+currents+in+atrial+fibroblasts+from+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation.</a> Physiological Reports. 4 (2), (2016).</li><li>G&#252;nd&#252;z, D., Hamm, C. W., Aslam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Isolation+of+High+Quality+Cardiomyocytes,+Endothelial+Cells,+and+Fibroblasts+from+an+Adult+Rat+Heart.">Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).</li><li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells.">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li><li>Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+enzymatic+isolation+of+fibroblasts+for+the+creation+of+autologous+skin+substitutes.">Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).</li><li>El-Armouche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+inhibitor-1-deficient+mice+are+protected+from+catecholamine-induced+arrhythmias+and+myocardial+hypertrophy.">Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy.</a> Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).</li><li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FELASA+Guidelines+and+Recommendations.">FELASA Guidelines and Recommendations.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).</li><li>Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblasts+differentiate+from+fibroblasts+when+plated+at+low+density.">Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).</li><li>Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+in+cell+culture+systems:+myofibroblasts+all+along.">Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).</li><li>Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484</a> (2019)</li><li>Copp&#233;, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor.">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li><li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease:+from+mechanisms+to+therapy.">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li><li>Singh, M., Sharma, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowth+of+fibroblast+cells+from+goat+skin+explants+in+three+different+culture+media+and+the+establishment+of+cell+lines.">Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).</li><li>Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+removal+of+fibroblasts+from+human+tissue+culture+systems.">A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems.</a> Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).</li></ol>

불멸의 섬유아세포주와 비교하여, 1차 섬유아세포는 몇 가지 장점을 제공한다. 그들은 높은 품질과 수량에서 비용 효율적으로 격리 될 수있다. 게다가, 1 차적인 배양은 다중 개별에게서 세포를 공부하는 가능성을 제안합니다, 얻어진 결과의 신뢰성을 증가시키고 단지 세포 배양 유물을 공부의 가능성을 감소시킵니다. 새로운 1 차 적인 배양물의 연속적인 생성은 일반적으로 통과하는 반복한 후에...

섬유아세포는 여러 개의 성화 과정과 광범위한 거친 파구체 망상1,2를가진 평평한 스핀들 모양의 세포이다. 평균 섬유아세포는 30-100 μm을 측정하고 수명은57±3일 1,3. 인간 섬유아세포의 평균 세포 주기 지속 기간은 배양 조건에 따라 16-48h범위이다 4. 배양된 1차 섬유아세포의 복제 능력과 기능적 질이 기증자 연령과 부정적으로 상관된다는 증거가 있으며, 가능한 경우5,6을 통해 젊은 기증자(동물 또는 환자)를 선호해야 한다는 것을 시사합니다. .
섬유아세포는 대부분의 포유류 신체 조직의 우세한 세포 유형을 구성합니다. 그들의 유비쿼터스 존재에도 불구하고, 섬유아세포의 분자식별은 여전히 도전 7입니다. 섬유아세포는 배아 발달 동안 다른 근원에서 조직및 기관 개발로 이동8 . 이러한 이유로, 섬유아세포에서 찾아질 수 있는 마커 단백질의 과다가 있는 반면, 모든 섬유아세포 집단에서 존재하고 섬유아세포에 대한 독점적인 유일한 마커 단백질은 아직도 누락됩니다. 따라서, 몇몇 인식된 마커의 발현 패턴은 일반적으로 섬유아세포를 확인하기 위하여 이용됩니다. 가장 인식되는 마커 중에는 비멘틴, 인간 섬유아세포 표면 단백질(hFSP), 디스코이딘 도메인 수용체 2(DDR2) 및 알파 평활근 액틴(αSMA)이 있다.
섬유아세포는 주요 세포외 기질(ECM) 생산 세포 유형입니다. 이에 따라 섬유아세포는 질서 정연한 조직 구조를유지하고 인접한 세포에 대한 기계적 지지를 제공한다 1. ECM 합성과 분해 사이의 균형은 잘 조절 된 과정입니다. 합성으로 이동 하는 과도 한 ECM 증착의 시작을 표시 하는, 종료 하지 않을 경우, 섬유증에 이르게. 섬유증은 분자 및 현상형 변경을 겪고 있는 활성화된 섬유아세포에서 유래한 근섬유아세포에 의해 중재됩니다. 근섬유아세포의 한 가지 특징은 ECM 및 사이토카인의 분비 및 질서 정연하게 배열된αSMA 마이크로필라멘트의 발현이다 9.
1차 섬유아세포는 섬유증, 조직염증 및 섬유아세포-암-세포 상호작용10,11에초점을 맞춘 최근 연구의 각광을 받고 있다. 그러나, 건강과 질병에 있는 섬유아세포 특성을 효과적으로 연구하기 위하여는, 실행 가능한 일차 성인 섬유아세포를 정기적으로 격리할 필요가 있습니다. 섬유아세포12,13,14를분리하는 데 사용할 수 있는 몇 가지 방법이 있다. 섬유아세포 분리의 세 가지 주요 방법은 조직 덩어리12,효소 조직 소화15,중공 장기9,13,16의효소 관류에서 자라낸다. 자성장의 장점은 효소 세포 분해없이 부드러운 절연 공정이다. 다른 한편으로는, 파생 배양은 일반적으로 세포가 실험을 위해 이용될 수 있을 때까지 연장된 배양 기간을 요구합니다. 일반적인 효소 소화는 빠르지만 조직을 기계적으로 용해시키는 데 필요한 교반 과정에서 다른 세포 유형 (예 : 내피 세포) 또는 박테리아와 오염 될 위험이 있습니다. 또한, 이러한 방법은 종종 정교하고 배울 시간과 기술이 필요합니다.
연구에서 1 차적인 섬유아세포의 중요성에 관하여, 민첩성, 단순성 및 신뢰성의 관점에서 기존 세포 격리 접근을 낙관할 필요가 아직도 있습니다. 여기서, 고품질 세포를 제공하는 새로운 초음파 기반 효소 섬유아세포 분리 방법이 제공된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1103px;" width="1103">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">T4049-100ML</td>
			<td style="width:405px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotics</td>
			<td>Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>Gibco LS15140148&#160;</td>
			<td>Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>51023608</td>
			<td>HeraSafe KSP15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>50049176</td>
			<td>BBD 6220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on vessel</td>
			<td>6-, 12-, 24-wells Nunclon surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture suction</td>
			<td style="width:339px;">VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany</td>
			<td>20727400</td>
			<td style="width:405px;">BVC professional suction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell strainer (mesh)</td>
			<td>Corning, Tewksbury, USA</td>
			<td style="width:143px;">431750</td>
			<td>40 &#181;m Nylon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:339px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td style="width:143px;">75007213</td>
			<td>Megafuge 8R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cordless pipetting controller</td>
			<td>Hirschmann, Eberstadt, Germany</td>
			<td>9907200</td>
			<td>Pipetus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>SafeSeal tips for pipettes (10 &#181;l, 20 &#181;l, 100 &#181;l, 200 &#181;l, 1000 &#181;l)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable plastic pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable sterile scalpel</td>
			<td>Myco Medical, Cary, USA</td>
			<td style="width:143px;">n.a.</td>
			<td>Techno cut</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:339px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>41965-062</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany&#160;</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>50 &#181;l, 500 &#181;l, 1.500&#181;l, 2.000 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>F2442-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase blend</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">5401020001</td>
			<td>Liberase TL Research Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish 6 cm</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Senescence detection kit</td>
			<td style="width:339px;">Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>ab65351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Shaker/ Vortex</td>
			<td style="width:339px;">IKA, Staufen im Breisgau, Germany</td>
			<td style="width:143px;">n.a.</td>
			<td>MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile plastic tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>Falcon 352095</td>
			<td>BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrasonic water bath</td>
			<td>BANDELIN electronic GmbH &#38; Co. KG, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:143px;">312</td>
			<td>Sonorex RK100H</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical scissors (atraumatic)</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">NR 82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical scissors&#160;</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">eq 1060.09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical forceps</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">BD577</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation

1 차적인 성인 섬유아세포는 모든 바디 조직에 있는 섬유증, 섬유아세포 상호 작용 및 염증을 공부하는 중요한 공구가 되었습니다. 1 차적인 섬유아세포는 myofibroblast 분화 또는 노화 유도 때문에 무기한 으로 분할할 수 없기 때문에, 새로운 문화는 정규로 설치되어야 합니다. 그러나 신뢰할 수있는 절연 프로토콜 및 1 차 섬유 아세포 격리 자체를 개발하는 과정에서 극복해야 할 몇 가지 장애물이 있습니다 : 방법의 난이도 (특히 초보자) 및 박테리아 오염의 위험, 1 차적인 섬유아세포가 실험, 및 후속 세포 질 및 생존을 위해 사용될 수 있을 때까지 필요한 시간. 본 연구에서는, 효소 소화 및 초음파 동요를 결합하는 마우스 심장, 폐, 간 및 신장으로부터 원발성 성인 섬유아세포를 분리하고 배양하는 빠르고 안정적이며 배우기 쉬운 프로토콜이 제공된다.

고체 뮤린 조직으로부터 성인 섬유아세포를 분리하는 이 프로토콜의 능력이 입증되었다. 생존 가능한 섬유아세포는 면역형광 염색 또는 증식 실험과 같은 후속 실험에 사용될 수 있는 것을 수득하였다(도2D-F, 도 5A).
성체 섬유아세포는 일반적으로 단층12,18에서?...

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Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

우리는 초보자 (예를 들어, 학생)에 의해 수행 할 수있는 쉽고 빠르고 신뢰할 수있는 방법으로 기본 성인 섬유 아아세포를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이 절차는 효소 조직 소화와 기계적 동요를 초음파와 결합하여 1 차 섬유 아아아를 얻습니다. 프로토콜은 특정 실험 요구 사항(예를 들어, 인간 조직)에 쉽게 적응될 수 있다.

초음파 증강 원발성 섬유아세포 분리

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

우리의 프로토콜은 박테리아 오염을 피하는 데 중점을 두고 1 차 섬유아 세포 격리를위한 쉽고 빠른 접근 방식을 제공하며 이는 큰 문제가 될 수 있습니다. 특히 초보자를위한. 우리의 기술의 주요 장점은 단순성입니다.그것은 광범위한 수동 기술이나 경험을 필요로하지 않기 때문에 짧은 훈련 기간 내에 모두가 쉽게 배울 수 있습니다. 이 기술을 제시하는 것은 아웃 실험실의 기술자 인 Manja Newe가 될 것입니다. 해부를 시작하기 전에, 일회용 장갑 두 켤레를 착용, 다른 위에 하나.그리고 폴리스티렌 패드에 마우스를 고정합니다. 70%에탄올로 털을 소독하여 동물이 흠뻑 젖었는지 확인합니다. 그리고 에탄올 살균 수술 용 집게와 외상성 가위를 사용하여 비뇨 생식기 위 바로 위에 피부를 컵.초기 절개에서 목에 이르는 미드라인을 따라 3~4센티미터를 자르고 팔다리에 릴리프 컷을 추가했습니다. 그리고 복강을 덮고 있는 근육에 최적 접근을 달성하기 위해 피부에 패드에 고정합니다. 그런 다음, 신선한 70 %에탄올로 복부 근육을 두 번 소독.에탄올이 건조되면 첫 번째 장갑을 제거합니다. 그리고 새로운 멸균 세트의 집게와 가위를 사용하여 복강과 흉부를 열기 위해 근육 층을 절개합니다. 관심있는 장기를 제거하려면 조직을 관통하지 않고 외과 용 집게로 각 장기를 부드럽게 잡습니다.그리고 가위를 사용하여 기관의 진입점 근처의 공급 혈관을 조심스럽게 절단하십시오. 각 장기를 멸균, 차가운 PBS 튜브에 넣고 튜브를 단단히 닫습니다. 장기가 수집될 때 각 튜브를 젖은 얼음 위에 놓습니다.모든 장기를 수확하면 멸균 세포 배양 후드에 넣기 전에 튜브에 70 %에탄올로 튜브를 스프레이하십시오. 신선한 장갑을 착용하고 멸균 집게를 사용하여 각 장기를 멸균 6센티미터 페트리 접시의 절반으로 옮긴다. 그리고 간략하게 과잉 혈액을 제거하기 위해 신선한 PBS로 장기를 씻어.각 페트리 접시의 후반부에 헹구는 장기를 옮기고 초과 PBS를 제거합니다. 두 개의 멸균 메스를 사용하여 장기를 1~ 2밀리미터 조각으로 다진다. 그리고 멸균 주걱을 사용하여 조직 조각을 새로운 개인, 멸균, 15 밀리리터 튜브로 옮기십시오.각 튜브에 0.25%의 트립신 용액2밀리리터를 추가합니다. 그리고 5 분 동안 섭씨 37도에서 세포 배양 인큐베이터에 튜브를 배치합니다. 인큐베이션이 끝나면 튜브를 분당 약 1,400회 회전하여 10초 동안 소용돌이를 피합니다.그리고 튜브 당 태아 송아지 혈청으로 보충 된 적절한 배양 매체의 4 밀리리터로 트립신 반응을 체포한다. 다음으로 각 튜브에 적절한 콜라게나아제 블렌드 솔루션을 추가합니다. 그리고 튜브를 섭씨 37도의 초음파 수조에 10분 간 배치합니다.초음파 처리가 끝나면 튜브를 10 초 동안 부드럽게 소용돌이시다. 튜브를 초음파 수조에 10 분 이상 다시 넣기 전에. 두 번째 초음파 처리가 끝나면 튜브를 10 초 더 소용돌이시다.그리고 70 %에탄올로 튜브를 소독하십시오. 세포 배양 후드에서, 개별 40 마이크로미터 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 새로운 멸균 튜브, 15 밀리리터 튜브로 필터링합니다. 그리고 원심분리에 의해 세포를 수집한다.튜브 당 신선한 매체의 1 밀리 리터에 펠 릿을 다시 중단. 그리고 적절한 도금 밀도에서 적합한 세포 배양 용기에서 세포를 참조하십시오. 그런 다음 세포를 세포 배양 인큐베이터에 하룻밤 동안 배치합니다.다음 날 아침, 신선한 배지를 추가하고 인큐베이터에 세포를 반환하기 전에 PBS로 각 문화를 세 번 세척합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 실행 가능한 섬유아세포는 후속 실험에서 사용하기 위해 얻을 수 있습니다. 아미노산 형광 염색 또는 증식 실험과 같은.성인 섬유아세포는 일반적으로 단층층에서 성장하는 다중 세포 과정을 가진 평평한 스핀들 모양의 세포입니다. 그러나 다른 장기에서 섬유아세포 집단에 있는 뚜렷한 형태학 적 다름은 관찰될 수 있습니다. 예를 들면, 신장 섬유아세포는 더 작고 심장, 폐 또는 간 섬유아세포 보다는 더 높은 밀도에서 증가합니다.고립된 섬유아세포는 높은 증식률을 표시하여 약 6일 후에 90% 이상의 광학 적 합류에 도달합니다. 여기서, 특유의 알파 평활근 액틴 마이크로필라멘트를 가진 차별화된 심오섬유블라스트를 관찰할 수 있다. 이 세포는 심장, 신장, 간 및 폐 세포 배양에서 풍부하게 발견됩니다.고립및 배양세포의 약 20~30%만이 질서 정연하게 표현하고, 배열된 알파 스무스 근육 액틴 마이크로필라멘트이지만, 사실상 모든 세포는 7일간의 배양 후 비멘틴과 디스코시딘 도메인 수용체 2에 긍정적이다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 박테리아 오염을 피해야 하기 때문에 절차 전반에 걸쳐 올바른 기술을 사용하는 것입니다. 1 차적인 섬유아세포 격리 후에, 세포는 정신과 실험 및 특성화의 모든 종류에 이용될 수 있습니다.면역 세포 화학 증식 또는 상처 치유 에세이, 또는 분자 생물학적 평가와 같은.

Research

JoVE Journal

Medicine

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

인간의 전정 신경초종의 차 문화

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

연구

의학

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

차 종양과 폐 전이을 연구하기 위해 MEF 세포 격리

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

개 동맥과 정맥에서 차 내피 세포의 분리 및 문화

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

절연 및 성인 쥐 Cardiomyocytes의 재배

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

기간 Placentae의 태아 세포 막에서 기본 인간 Decidual 세포의 고립

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

비 방사성 L-azidohomoalanine 라벨 방법에 의해 초기 단백질 합성 분석에 대 한 기본 마우스 Hepatocytes의 절연

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

성인 마우스에서 심방 근세포의 격리

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

왼쪽 전방 내림차순 관상 동맥의 영구 결찰을 사용하는 뮤린 심근 경색 모델

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

건강하고 부상당한 마우스 심혼에 있는 3차원 섬유아세포 조직을 위한 정제된 CLARITY 기지를 둔 조직 정리

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

성인 마우스에서 심방 및 심실 근세포의 동시 격리를위한 랑엔도르프 방법의 수정

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...