Name: ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation
Uploaded: 2019-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation at JoVE.com

Vi takker MS Romy Kempe og fru Annett Opitz for ekspert teknisk støtte. Vi takker også Mr. Bjoern Binnewerg for IT-støtte. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra a) den Förderkreis Dresdner Herz-kreislauf-tage e.V., b) "Habilitationsförderprogramm für frauen", det medisinske fakultet Carl Gustav Carus Dresden og c) else Kröner-Forschungskolleg (EKFK) det medisinske fakultet Carl Gustav Carus Dresden. Vi er takknemlige for finansiering og støtte.

Følgende protokoll følger de institusjonelle dyre omsorgen retningslinjer for Technische Universität Dresden, Tyskland (filnummer: T 2014/4) samt internasjonalt aksepterte dyre omsorg retningslinjer (FELASA)17. Figur 1 visualiserer celle isolasjons prosessen.
1. klargjøre oppsett, materiale og Media
<ol><li>Forbered cellekultur medium, PBS løsning, kollagenase blanding lagerløsning (Rekonstituer 50 mg lyofilisert kollagenase blandin...

<ol>
	<li>Baum, J., Duffy, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+and+myofibroblasts:+what+are+we+talking+about.">Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).</li><li>Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+identity+of+cardiac+fibroblasts.">Redefining the identity of cardiac fibroblasts.</a> Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).</li><li>Weissman-Shomer, P., Fry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+fibroblasts+senscence+in+vitro:+pattern+of+cell+division+and+life+span+as+a+function+of+cell+density.">Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).</li><li>Angello, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+potential+and+the+duration+of+the+cell+cycle+in+human+fibroblasts:+coordinate+stimulation+by+epidermal+growth+factor.">Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).</li><li>Serra, V., von Zglinicki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fibroblasts+in+vitro+senesce+with+a+donor-specific+telomere+length.">Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length.</a> FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).</li><li>Mateu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differences+between+neonatal+and+adult+fibroblasts+and+keratinocytes:+Donor+age+affects+epithelial-mesenchymal+crosstalk+in+vitro.">Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro.</a> International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).</li><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Cardiac+Fibroblast.">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Kuenzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+epigenetic+silencing+of+polo-like+kinase+2+promotes+fibrosis+in+atrial+fibrillation.">Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation.</a> bioRxiv. , 445098 (2018).</li><li>Van Linthout, S., Miteva, K., Tsch&#246;pe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+fibroblasts+and+inflammatory+cells.">Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer.">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li><li>Poulet, C., K&#252;nzel, S., B&#252;ttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+physiological+functions+and+ion+currents+in+atrial+fibroblasts+from+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation.</a> Physiological Reports. 4 (2), (2016).</li><li>G&#252;nd&#252;z, D., Hamm, C. W., Aslam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Isolation+of+High+Quality+Cardiomyocytes,+Endothelial+Cells,+and+Fibroblasts+from+an+Adult+Rat+Heart.">Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).</li><li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells.">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li><li>Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+enzymatic+isolation+of+fibroblasts+for+the+creation+of+autologous+skin+substitutes.">Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).</li><li>El-Armouche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+inhibitor-1-deficient+mice+are+protected+from+catecholamine-induced+arrhythmias+and+myocardial+hypertrophy.">Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy.</a> Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).</li><li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FELASA+Guidelines+and+Recommendations.">FELASA Guidelines and Recommendations.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).</li><li>Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblasts+differentiate+from+fibroblasts+when+plated+at+low+density.">Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).</li><li>Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+in+cell+culture+systems:+myofibroblasts+all+along.">Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).</li><li>Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484</a> (2019)</li><li>Copp&#233;, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor.">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li><li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease:+from+mechanisms+to+therapy.">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li><li>Singh, M., Sharma, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowth+of+fibroblast+cells+from+goat+skin+explants+in+three+different+culture+media+and+the+establishment+of+cell+lines.">Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).</li><li>Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+removal+of+fibroblasts+from+human+tissue+culture+systems.">A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems.</a> Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).</li></ol>

Sammenlignet med udødeliggjort Fibroblast cellelinjer, har primære fibroblaster flere fordeler. De kan isoleres kostnadseffektivt i høy kvalitet og kvantitet. Videre primære kulturer tilbyr muligheten til å studere celler fra flere individer, noe som øker påliteligheten av oppnådde resultater og reduserer sannsynligheten for bare å studere cellekultur gjenstander. Kontinuerlig generering av nye primære kulturer forhindrer genetiske forandringer som ofte oppstår etter gjentatt passaging21</sup...

Fibroblaster er flate, spindel-formede celler med flere Stel prosesser og en omfattende grov endoplasmatiske retikulum1,2. En gjennomsnittlig Fibroblast måler 30-100 μm og har en levetid på 57 ± 3 dager1,3. Den gjennomsnittlige celle syklus varigheten av menneskelig fibroblaster varierer fra 16-48 h avhengig av kulturen forhold4. Det er dokumentert at replicative kapasitet og funksjonell kvalitet på kulturperler primære fibroblaster negativt samsvarer med donor alder, noe som tyder på at yngre donorer (dyr eller pasienter) bør foretrekkes hvis mulig5,6 .
Fibroblaster utgjør en dominerende celle type mest pattedyr kroppens vev. Til tross for deres allestedsnærværende tilstedeværelse, den molekylære identifisering av fibroblaster er fortsatt en utfordring7. Fibroblaster migrere til å utvikle vev og organer fra ulike kilder under embryonale utviklingen8. Av denne grunn er det en overflod av markør proteiner som finnes i fibroblaster mens unike markør proteiner, som er til stede i hver Fibroblast befolkning og eksklusivt for fibroblaster, er fortsatt mangler. Uttrykks mønstre for flere gjenkjente markører brukes derfor vanligvis til å identifisere fibroblaster. Blant de mest anerkjente markører er vimentin, humant Fibroblast overflate protein (hFSP), discoidin domene reseptor 2 (DDR2) og Alpha glatt muskel utgangen (αSMA).
Fibroblaster er de viktigste ekstracellulære matrise (ECM)-produserende celle type. Derved, fibroblaster opprettholde en ryddig vev arkitektur og gi mekanisk støtte for nærliggende celler1. Balansen mellom ECM-syntese og-degradering er en godt regulert prosess. Skifter mot syntese markere begynnelsen av overdreven ECM deponering som, hvis ikke avsluttet, fører til fibrose. Fibrose er formidlet av myofibroblasts, som stammer fra aktivert fibroblaster gjennomgår molekylær og phenotypical endringer. Et kjennetegn på myofibroblasts er forbedret sekresjon av ECM og cytokiner og uttrykk for ryddig arrangert αSMA microfilaments9.
Primære fibroblaster har vært i søkelyset av nyere forskning med fokus på fibrose, vevs betennelse og Fibroblast-kreft-celle interaksjoner10,11. Men for å effektivt studere Fibroblast egenskaper i helse og sykdom, er det nødvendig å isolere levedyktig primær voksen fibroblaster på jevnlig basis. Det finnes flere metoder for å isolere fibroblaster12,13,14. De tre store metoder for Fibroblast isolasjon er utvekst fra vev biter12, enzymatisk vev fordøyelse15, og enzymatisk av hul organer9,13,16. Fordelen med utvekst er en skånsom isolasjons prosess uten enzymatisk celle degradering. På den annen side, utvekst kulturer krever vanligvis forlenget kultur perioder inntil cellene kan brukes til eksperimenter. Vanlig enzymatisk fordøyelsen er rask, men bærer en risiko for forurensning med andre celletyper (f. eks, endothelial celler) eller bakterier i agitasjon prosessen, som er nødvendig for å mekanisk oppløse vevet. Videre disse metodene er ofte forseggjort og krever tid og dyktighet til å lære.
Når det gjelder viktigheten av primære fibroblaster i forskning, er det fortsatt behov for å optimalisere eksisterende celle isolasjon tilnærminger i form av hurtighet, enkelhet og pålitelighet. Her, en roman ultralyd-basert enzymatisk Fibroblast isolasjon metode levere høy kvalitet celler er gitt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1103px;" width="1103">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">T4049-100ML</td>
			<td style="width:405px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotics</td>
			<td>Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>Gibco LS15140148&#160;</td>
			<td>Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>51023608</td>
			<td>HeraSafe KSP15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>50049176</td>
			<td>BBD 6220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on vessel</td>
			<td>6-, 12-, 24-wells Nunclon surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture suction</td>
			<td style="width:339px;">VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany</td>
			<td>20727400</td>
			<td style="width:405px;">BVC professional suction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell strainer (mesh)</td>
			<td>Corning, Tewksbury, USA</td>
			<td style="width:143px;">431750</td>
			<td>40 &#181;m Nylon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:339px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td style="width:143px;">75007213</td>
			<td>Megafuge 8R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cordless pipetting controller</td>
			<td>Hirschmann, Eberstadt, Germany</td>
			<td>9907200</td>
			<td>Pipetus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>SafeSeal tips for pipettes (10 &#181;l, 20 &#181;l, 100 &#181;l, 200 &#181;l, 1000 &#181;l)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable plastic pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable sterile scalpel</td>
			<td>Myco Medical, Cary, USA</td>
			<td style="width:143px;">n.a.</td>
			<td>Techno cut</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:339px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>41965-062</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany&#160;</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>50 &#181;l, 500 &#181;l, 1.500&#181;l, 2.000 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>F2442-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase blend</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">5401020001</td>
			<td>Liberase TL Research Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish 6 cm</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Senescence detection kit</td>
			<td style="width:339px;">Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>ab65351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Shaker/ Vortex</td>
			<td style="width:339px;">IKA, Staufen im Breisgau, Germany</td>
			<td style="width:143px;">n.a.</td>
			<td>MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile plastic tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>Falcon 352095</td>
			<td>BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrasonic water bath</td>
			<td>BANDELIN electronic GmbH &#38; Co. KG, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:143px;">312</td>
			<td>Sonorex RK100H</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical scissors (atraumatic)</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">NR 82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical scissors&#160;</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">eq 1060.09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical forceps</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">BD577</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation

Primær voksen fibroblaster har blitt et viktig verktøy for å studere fibrose, Fibroblast interaksjoner og betennelser i alle kroppens vev. Siden primære fibroblaster ikke kan dele på ubestemt tid på grunn av myofibroblast differensiering eller senescence induksjon, nye kulturer må etableres regelmessig. Det er imidlertid flere hindringer å overvinne under prosessene med å utvikle en pålitelig isolasjons protokoll og primær Fibroblast isolasjon seg selv: metoden vanskelighetsgrad (spesielt for nybegynnere), risikoen for bakteriell forurensning, nødvendig tid før primære fibroblaster kan brukes til eksperimenter, og påfølgende celle kvalitet og levedyktighet. I denne studien, en rask, pålitelig og lett å lære protokollen for å isolere og kultur primære voksen fibroblaster fra mus hjerte, lunge, lever og nyre kombinere enzymatisk fordøyelse og ultralyd omrøring er gitt.

Evnen til denne protokollen til å isolere voksne fibroblaster fra solid murine vev ble demonstrert. Levedyktige fibroblaster ble innhentet som kan brukes til senere eksperimenter som immunofluorescence farging eller spredning eksperimenter (figur 2D-F, figur 5A).
Voksen fibroblaster er flate spindel-formede celler med flere cellulære prosesser som vanligvis vokser i monolagere12</s...

Watch this Scientific Journal Video about Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation at JoVE.com

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Vi presenterer en protokoll for å isolere primær voksen fibroblaster på en enkel, rask og pålitelig måte, performable av nybegynnere (f. eks, studenter). Prosedyren kombinerer enzymatisk vev fordøyelse og mekanisk agitasjon med ultralydbølger for å få primær fibroblaster. Protokollen kan enkelt tilpasses spesifikke eksperimentelle krav (f.eks. menneskelig vev).

Ultralyd-utvidet primær voksen Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

Vår protokoll gir og enkel og rask tilnærming for primær fibroblast isolasjon med et klart fokus på å unngå bakterier forurensning, noe som kan være et stort problem. Spesielt for nybegynnere. Den største fordelen med vår teknikk er dens enkelhet.Siden det ikke krever omfattende manuelle ferdigheter eller erfaring, og det kan lett læres av alle i løpet av en kort treningsperiode. Presentere teknikken vil være Manja Newe, en tekniker fra ut laboratorium. Før du begynner disseksjonen, sett på to par engangshansker, en på toppen av den andre.Og fest musen til en polystyrenpute. Desinfiser pelsen med 70% etanol, og pass på at dyret er gjennomvåt. Og bruk etanol steriliserte kirurgiske tang og atraumatisk saks for å koppe huden rett over urogenitalkanalen.Klipp tre til fire centimeter langs midtlinjen fra det første snittet til nakken, og legg til lettelsekutt på lemmer. Og pin huden til puten for å oppnå optimal tilgang til muskulaturen som dekker bukhulen. Deretter desinfiserer du bukmuskulaturen to ganger med frisk 70% etanol.Når etanol har tørket, fjern det første par hansker. Og bruk et nytt sterilt sett med tang og saks for å øke muskellaget for å åpne bukhulen og thoraxen. For å fjerne interesseorganene, ta forsiktig tak i hvert organ med kirurgiske tang uten å piercing vevet.Og bruk saksen til å forsiktig kutte de forsynende blodkarene nær inngangspunktet til orgelet. Plasser hvert organ i et rør med steril, kald PBS og lukk røret tett. Plassere hvert rør på våt is som organene samles.Når alle organene er høstet, spray rørene med 70% etanol før du plasserer dem i en steril cellekulturhette. Bruk et nytt par hansker, bruk sterile tang til å overføre hvert organ på den ene halvdelen av en steril seks centimeter petriskål. Og vask kort organene med fersk PBS for å fjerne overflødig blod.Overfør de skyllede organene til andre halvdel av hver petriskål og fjern overflødig PBS. Ved hjelp av to sterile skalpeller, hakke organene i en til to millimeter fragmenter. Og bruk en steril slikkepott til å overføre vevsbitene til nye, individuelle, sterile, 15 milliliter rør.Legg til to milliliter med 0,25% Trypsin-løsning i hvert rør. Og plasser rørene i en cellekultur inkubator på 37 grader Celsius i fem minutter. På slutten av inkubasjonen, vortex rørene på ca 1400 rotasjoner per minutt i ti sekunder.Og arrester Trypsin-reaksjonen med fire milliliter av et passende kulturmedium supplert med føtalkallverum per rør. Deretter legger du til riktig volum av collagenaseblandingsløsning til hvert rør. Og legg rørene i et 37 grader Celsius ultralydvannbad i 10 minutter.På slutten av sonikeringen, forsiktig virvler rørene i 10 sekunder. Før du plasserer rørene tilbake i ultralydvannbadet i 10 minutter til. På slutten av den andre sonikeringen, vortex rørene i 10 sekunder.Og desinfiser rørene med 70% etanol. I cellekulturhetten filtrerer du cellesuspensjonene gjennom individuelle 40 mikrometersiler i et nytt, sterilt, 15 milliliter rør. Og samle cellene ved sentrifugering.Re-suspendere pellets i en milliliter frisk medium per rør. Og se cellene i egnede cellekulturkar ved passende plating tettheter. Deretter plasserer du cellene i cellekulturinkubatoren over natten.Neste morgen, vask hver kultur tre ganger med PBS før du legger til friskt medium og returnerer cellene til inkubatoren. Ved hjelp av denne protokollen kan levedyktige fibroblaster oppnås for bruk i etterfølgende eksperimenter. Som amino-fluorescerende flekker eller spredning eksperimenter.Voksne fibroblaster er flate, spindelformede celler med flere cellulære prosesser som vanligvis vokser i monolayers. Distinkte morfologiske forskjeller i fibroblastpopulasjoner fra forskjellige organer kan imidlertid observeres. For eksempel er nyrefibroblaster mindre og vokser ved høyere tettheter enn hjerte-, lunge- eller leverfibroblaster.De isolerte fibroblastene viser høye spredningshastigheter, og når en optisk samløpet på mer enn 90% etter ca. seks dager. Her kan en differensiert myofibroblast med karakteristisk alfa glatt muskelhandling mikrofilamenter observeres. Disse cellene finnes i overflod i hjerte, nyre, lever, og lungecellekulturer.Mens bare ca 20 til 30 prosent av isolerte og kultiverte celler uttrykker ryddig, arrangert, alfa glatt muskel actin mikrofilamenter, nesten alle cellene er positive for Vimentin og Discoidin Domain Receptor 2 etter syv dager i kultur. Det viktigste å huske er å bruke riktig teknikk gjennom hele prosedyren som bakterier forurensning må unngås. Etter primær fibroblastisolasjon kan cellene brukes til alle typer psykiatrieksperimenter og karakterisering.Som immunocytisk kjemi spredning eller sårhelende essays, eller molekylære biologiske vurderinger.

Research

JoVE Journal

Medicine

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Primær Culture of Human Vestibulær schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

Primær Tumor og MEF Cell Isolation å studere Lung Metastase

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolasjon og Culture of Primary endotelceller fra Canine arterier og vener

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Isolasjon og dyrking av voksen rotte Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Isolering av primære Decidual menneskeceller fra fosterets membraner av begrepet Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Isolasjon hepatocytes hovedknappen på musen for begynnende Protein syntese analyse av ikke-radioaktivt L-azidohomoalanine merking metoden

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolering av atrieflimmer myocytter fra voksen mus

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Murine hjerteinfarkt modell bruker permanent ligation av venstre fremre synkende koronar

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Raffinert CLARITY-basert vevsrydding for tredimensjonal fibroblastorganisasjon i sunne og skadde musehjerter

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

Modifikasjoner av Langendorff-metoden for samtidig isolasjon av atrie- og ventrikulære myocytter fra voksne mus

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...